Summary
הפלטפורמה biowire הלב היא שיטה חוץ גופית המשמשת להבשיל עובריים אנושיים cardiomyocytes הנגזרות תאי גזע מושרים (hPSC-CM) על ידי שילוב טיפוח התא תלת ממדי עם גירוי חשמלי. כתב יד זה מציג את ההגדרה המפורטת של פלטפורמת biowire לב.
Abstract
גזע פלוריפוטנטיים האנוש cardiomyocytes התא נגזר (hPSC-CMS) היה מקור תא הבטיח ובכך עודד את החקירה של היישומים הפוטנציאליים שלהם במחקר לב, כוללים גילוי תרופות, דוגמנות מחלה, הנדסת רקמות, ורפואת רגנרטיבית. עם זאת, תאים המיוצרים על ידי פרוטוקולים קיימים להציג מגוון של בגרות לעומת cardiomyocytes חדרית בוגרי ילידים. מאמצים רבים נעשו כדי להבשיל hPSC-CMS, עם התבגרות מתונה בלבד שהושגה עד כה. לכן, מערכת מהונדסת, שנקראה biowire, כבר המציאה ידי מתן שני רמזים פיסיים חשמל להוביל hPSC-CMS למצב בשל יותר במבחנה. המערכת משתמשת בפלטפורמה microfabricated זרע hPSC-CMS מסוג קולגן אני ג'ל לאורך תפר תבנית נוקשה להרכיב לתוך רקמת לב מיושר (biowire), הכפופה גירוי שדה חשמלי בתדירות גוברת בהדרגה. בהשוואה לקבוצת ביקורת nonstimulated,מגורה biowired cardiomyocytes להפגין תואר משופר של התבגרות מבנית אלקטרו. שינויים כאלה הם תלויים שיעור הגירוי. כתב יד זה מתאר בפירוט את העיצוב והיצירה של biowires.
Introduction
טיפול המבוסס על תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות וחקרו ביותר להשיג תיקון / התחדשות לב. הוא נוצל בעזרת הנדסת רקמות לב ואת שיתוף המשלוח של חומרים ביולוגיים 1, 2. רוב המקורות סלולריים הזמינים נחקרו במודלים של בעלי חיים עבור והשפעתם הפוטנציאלית החיובית על פגום, חולה, או לבבות בגילאי 3. בפרט, מאמצים משמעותיים נעשו להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) -derived cardiomyocytes (hPSC-CM), מקור תא עצמי בלתי מוגבל פוטנציאלי עבור הנדסת רקמות לב. hPSC-CMS ניתן להפיק באמצעות פרוטוקולים כמה הוקמו 4, 5, 6. עם זאת, התאים המתקבלים להציג פנוטיפים העובר דמוי, עם מגוון של מאפיינים בשלה לעומת cardiomyocytes חדרית בוגרים 7, 8. זה יכול להיות מכשול בפני יישום של hPSC-CMS כמודלים של רקמת הלב המבוגר במחקר גילוי סמים בפיתוח מודלים למחלות לב מבוגר 9.
על מנת להתגבר על מגבלה זו של בגרות פנוטיפי, גישות חדשות נחקרו באופן פעיל כדי לקדם התבגרות cardiomyocyte. מחקרים מוקדמים גילו תכונות פרו-בשלות יעילות cardiomyocytes עכברוש בילוד באמצעות 10 מכנים מחזוריים או 11 גירוי חשמלי. דחיסת ג'ל גירוי מכאני מחזורי הוצגו גם לשפר היבטים מסוימים של התבגרות hPSC-CM 12, 13, עם שיפור מזערי של נכסי טיפול אלקטרו וסידן. לכן, מערכת פלטפורמה בשם "חוט ביולוגי" (biowire) תוכננה על ידי מתן שני רמזים מבניים stimulatio שדה החשמליn על מנת לשפר את ההבשלה של hPSC-CMS 14. מערכת זו משתמשת בפלטפורמת microfabricated ליצור רקמת לב מיושרת כי ניתן גירוי שדה חשמלי. זה יכול לשמש כדי לשפר את הבגרות המבנית של אלקטרו hPSC-CMS. כאן, אנו מתארים את הפרטים של מה שהופך biowires כזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב מאסטר ייצור
הערה: השתמש ליתוגרפיה רך עבור ייצור המכשיר. הפוך מאסטר דו שכבתי SU-8 עבור polydimethylsiloxane דפוס (PDMS).
- עיצוב המכשיר באמצעות עיצוב וניסוח תוכנה (איור 1A, שמאל). צייר כל שכבה של המאסטר בנפרד. הדפס את עיצוב המכשיר על שני photomasks ב 20,000 dpi, בהתאם לשתי שכבות של המאסטר 15. הגדר את תבנית התקן כפי שקוף וסביבתה כפי כהה; המסכות תשמשנה את התבנית כדי להעביר את תבנית ההתקן אופטי על SU-8 על ידי ליתוגרפיה (כמתואר על ידי אחרים 15).
- לוותר על 4 מ"ל של SU-8 50 על מרכז של פרוסות סיליקון 4 אינץ. מעיל SU-8 50 שווה על פרוסות סיליקון באמצעות coater ספין על ידי ספינינג ב 2000 סיבובים לדקה (RPM) עבור 30 s. אופים את פרוסות על פלטה חמה C 95 ° עבור 10 דקות. לחשוף את פרוסות אולטרה סגול (UV) light ב 200 mJ / ס"מ 2.
- יוצקים על 4 מ"ל של SU-8 2050 על גבי במרכז רקיק ועל ספין ב 2500 סל"ד במשך 30 s. אופה על הפלטה החשמלית C ° 95 במשך 15 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר (RT).
- חזור על שלב 1.3 פעמים נוספות.
- מכסה את הפרוסות המצופות עם photomask השקיפות-השכבה הראשונה. לחשוף את פרוסות לאור UV ב 270 mJ / ס"מ 2 על מנת להפוך את השכבה הראשונה. אופה על הפלטה החשמלית C ° 95 במשך 15 דקות.
- הפוך את השכבה השנייה של SU-8 2050 על ידי חזרה על שלב 1.3 פעמים.
- יישר את המסכה בשכבה השנייה לתכונות על השכבה הראשונה באמצעות aligner מסכה. ואז, לחשוף לאור UV ב 240 mJ / 2 ס"מ. אופים בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הערה: זמן החשיפה נקבע לפי מינון UV כולל נדרש ואת עוצמת פלט UV האור נמדדה ביום לפני השימוש. - פיתוח רקיק ידי והשקיע אותה אצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול (PGMEA) ו רועד ב 200 סל"ד במשך 30 דקות על שייקר מסלולית.
- מקוםאת המאסטר לתוך צלחת פטרי בזהירות לשפוך את התערובת PDMS (בסיס כדי crosslinker ביחס של 10: 1 לפי משקל) על מרכז רקיק. לכסות את כל התכונות ולהימנע בועות אוויר.
- מחממים בתנור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. השתמש להב חד לחתוך סביב קצה תבנית biWire PDMS ( איור 1 א, מימין). לקלף את PDMS מן המאסטר. חתוך את המכשיר עם הלהב. שים את תבנית biWire PDMS ב עיקור עיקור חיטוי אדים ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- בתוך ארון biosafety (BSC), במקום את תבנית PDWW PDMS לתוך צלחת פטרי. השתמש פינצטה להחזיק ואת הר פיסת תפר משי סטרילי סטרילי (6-0) במרכז הערוץ של micrustell PDMS על ידי ישיבה אותו החריצים בשני הקצוות של הערוץ ( איור 1B-I ).
2. יצירת לשכת גירוי חשמלי
- צור זוג חתיכות פוליקרבונט מלבניות (אורך x רוחב x עובי: 2 ס"מ x0.85 ס"מ x 0.35 ס"מ) ולהשתמש בהם המסגרת של תא גירוי חשמלי (איור 2).
- מקדחה השנייה 3 מ"מ חורים רחבים מזה 2 סנטימטר לאורך קו האמצע של כל פיסת מסגרת פוליקרבונט.
- חותכים שתי חתיכות של מוטות פחמן ארוך 1.5 ס"מ. לקדוח חור 1 מ"מ-רחב דרך מוט הפחמן על 3 מ"מ מהקצה. חוטי תיל פלטינה דרך חור מוט פחמן להדק את החוט על ידי לפפת אותה סביב מוט הפחמן. צרף קליפ אל הקצה השני של חוט פלטינה עבור חיבור מאוחר יותר עם ממריץ חשמלי.
- הכנס את מוטות פחמן לתוך חתיכות מסגרת פוליקרבונט. מניח את המסגרת התאספה עם מוטות פחמן לתוך באר של צלחת שש היטב.
- יוצקים 2 מ"ל של PDMS לתוך הבאר. לצלול התחתון של מסגרות פוליקרבונט ב PDMS, תוך שמירה על רמת השטח PDMS קרוב אבל לא להגיע לתחתית מוטות פחמן. מחממים בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 h.
- קח את תא הגירוי החשמלי מתוך השישה- צלחת טובה והכניסו אותו שקיק עיקור עבור קיטור עיקור על 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
3. דיסוציאציה אנזימטית של hPSC-CMs
- לעורר hPSC כדי להבדיל cardiomyocytes באמצעות פרוטוקול הוקמה 4 .
הערה: בקצרה, ליצור cardiomyocytes דרך גופים עובריים הוקמה (EB) ב בינוני פרו גזע באמצעות תוסף רציף עם חלבון morphogenetic העצם 4, גורם הצמיחה הבסיסית fibroblast, Activin, גורם צמיחה אנדותל כלי הדם, ו דיקופ הומולוג 1 4 . השתמש EBS מיום 20-34 של בידול לעשות biowires. - איסוף EBS מצלחת מצורף נמוך עם קצה P1,000 פיפטה ולהעביר צינור חרוטי. גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 125 xg ו RT. מחק supernatant ו resuspend גלולה עם מראש מחומם, 37 ° C collagenase סוג אני מכיל 1% deoxyribonuclease אני (DNAse אני). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעותלעיכול.
- מוסיפים 5 מ"ל של מחומם מראש, 37 ° C לשטוף בינוני ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 125 XG ו RT. בטל supernatant. Resuspend גלולה עם 2 מ"ל של טריפסין / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון לדגור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- להוסיף 1 מ"ל של מדיום להפסיק המכיל 3% (v / v) I. DNase
- צרף מחט 20 G (0.9 מ"מ) כדי מזרק 5 מ"ל ולהעביר את ההשעיה EB דרכו 3-5 פעמים.
- להוסיף 7 מ"ל של מדיום לשטוף צנטריפוגות ב 280 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant. Resuspend הגלולה (IMDM) הבינוני של השינוי של Iscove Dulbecco ולאחסן על קרח. קבע את מספר הסלולרי עם hemocytometer. קח 0.5 x 10 6 תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 280 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
- טרום מגניב כל הרכיבים ג'ל על קרח לפני ערבוב אותם בתוך שפופרת סטרילית. מערבבים את מרכיבי ג'ל קולגן הבאים (ריכוז סופי): 2.1 מ"ג / קולגן זנב עכברוש מ"ל סוג I, 24.9 גלוקוז מ"מ, 23.8 מ"מ לאא3 CO, 14.3 מ"מ NaOH, 10 HEPES מ"מ, ו מטריקס 10% בטווח הבינוני 1x M199. מוסיפים את הקולגן מטריקס האחרון. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- Resuspend 0.5 x 10 6 תאים עם 3.5 μL של ג'ל קולגן ומערבבים היטב.
- השתמש קצה פיפטה P10 להוסיף 4 μL של ההשעיה התא לתוך התעלה 0.5 ס"מ באורך (איור 1B-II). התאם את המיקום של תפר עם מלקחיים סטרילית במידת הצורך.
- מכסים את תחתית צלחת פטרי עם שנאגרו מלוחים פוספט סטרילית (PBS), כדי לוודא שלא לגעת בג'ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- החלף את PBS עם 12 מ"ל של מדיום תרבות (למשל, גזע Pro או בינוני המומלץ על ידי היצרן התא), מספיק כדי לכסות את התאים (איור 1B-III). תרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שבוע. שינוי המדיום פעם ביומיים.
4. גירוי חשמלי טיפוח Biowire
- בשנתBSC, להוסיף 2 מ"ל של PBS היטב בכל צלחת שש היטב כי יהיה בית קאמרית חשמלי. להשתמש בפינצטה סטרילי כדי למקם את מכשיר גירוי חשמלי לעקר בעדינות לתוך הבאר. בטל PBS מהבאר.
- מכסים את מוטות פחמן עם 5 מ"ל של מדיום התרבות מחומם מראש. להשתמש בפינצטה סטרילי כדי להרכיב את biowires בתא גירוי חשמלי לכוון אותם בניצב מוטות פחמן (איור 2).
- מניחים את המכסה על גבי צלחת שש היטב, אך להשאיר חוטי פלטינה מספיק לכת מחוץ לצלחת כדי להתחבר עם ממריץ האלקטרוני. מניחים את צלחת שש היטב בתוך תרבית תאים חממה ב 37 ° C ולחבר את חוט פלטינה על חשמלי.
- לעורר את biowires באמצעות חשמלי עם ההגדרה הבאה: דופק חוזר בי-פאזית, משך דופק 1-MS, 3 V / סנטימטר, ו 1 דופק לשנייה (PPS). הרם את PPS כל 24 h לערכים הבאים: 1.83, 2.66, 3.49, 40.82, 5.15, ו -6 שינוי המדיום פעם ביומיים.
- שים לב התכווצות cardiomyocyte בתגובת גירוי חשמלי תחת מיקרוסקופ בהגדלה 10X.
הערה: לאחר שבוע אחד של גירוי, את biowires הופך בוגר (ראה סעיף התוצאות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרציונל לשימוש תפר את biowires הוא לשמש כתבנית ליצירת מבני 3D כי ליישר ב ציר אחד לחקות את הצורה של סיבי לב. אנו מראים כי לאחר שבעה ימים של תרבות biowire, תאים שופצו הג'ל ברחבי (איור 3 א) התפר. התאים נאספו לאורך הציר של התפר כדי ליצור מיושר ברקמת לב (איור 3). לאחר 7 ימים של preculture, את biowires נחשף 7 ימים של גירוי שדה חשמלי הציגו עוד תכונות תואמות התבגרות מבנית ותפקודית של שריר לב.
אדם PSC-CMS ב biowires הציג ביטוי חזק של חלבוני התכווצות לב, α-actinin sarcomeric, תקטין (איור 4A). הבחנו פסים sarcomeric של מנגנון ההתכווצות hPSC-CM ויישור של תוכחות myofibrilarלאורך הציר של התפר. זהו איכותי דומה למבנה בלב המבוגר (האיור 4A). שנית, בהשוואה לאלו של EBS, hESC-CMS biowired אלה מוצגים שיעורי התפשטות נמוך (איור 4 ב). שלישית, hESC-CMS biowired הציג השתפר טיפול סידן נכסים (איור 5) והתבגרות אלקטרופיזיולוגיה cardiomyocyte (איור 6). בשנת cardiomyocytes הבוגר, טיפול עם קפאין גורם לשחרור פתאומי של Ca 2 + מ הרטיקולום sarcoplasmic 8. הארעיים כזה Ca 2+ נמצאו hESC-CMS גירוי חשמלי, אך לא בתאים מן שולטת הלא מגורה (איור 5 א-ג). התגובה לקפאין בתאי הגירוי החשמלי, בהשוואה לקבוצת ביקורת הלא מגורה, חשפה משרעת גבוהה משמעותי של עוצמת באופן תדיר תלויות גירוי (האיור 5D ו- E). בינתיים, hPSC-CMSב biowires הראו השתפר הנוכחי מיישר זרם ופנימה hERG (אני K1) צפיפויות, שהיה משופר עוד יותר על ידי גירוי חשמלי (איור 6 א 'וב'). שיפורים כאלה ב K1 הנוכחי ואני בהתאם אינדוקציה ב הגן ערוץ לתיקון כלפי פנים אשלגן (KCNJ2) ביטוי החלבון biowires (איור 6C).
עוד פרמטר חשוב לגבי התבגרות הוא היכולת של שריר הלב כדי לנצח באופן ספונטני, הידוע גם בשם לאוטומטיות, וזה סימן של בגרות בעבודת cardiomyocytes (פרוזדורים חדרית) 16. Automaticity היה גבוה משמעותי cardiomyocytes EB-נגזרה לעומת biowires המלא (איור 6 ד), אשר היה דומה לזה biowires נתון משטר 6-הרץ.
לקחתn יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך תרבות biowire עם גירוי חשמלי קדמה את ההתבגרות המבנית של אלקטרו hPSC-CMS 14.
איור 1: פלטפורמת תרבות Biowire. (א) סכמטי (משמאל) בפועל (מימין) עובש PDMS של biowire. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (ב) להגדרת biowire, תפר היה רכוב מרכזי בערוץ (I). השעית hESC-CM ב ג'ל שאני סוג קולגן הייתה זורעת ברחבי התפר בערוץ (II) וטופחה במדיום (III). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:Biowire היה בתרבית לשכת הגירוי החשמלית במהלך השבוע השני של טיפוח. Biowire הוצב בניצב אלקטרודות פחמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: שיפוץ תא ג'ל מתקשרים סביב התפרים לאחר 7 יום Preculture ב Biowire. (א) תמונות Brightfield של hESC-CMS בימים המצוין של preculture בתבנית biowire. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. כימות (B) של דחיסה ג'ל על הימים המצוינים של התרבות (ממוצע ± SD). (ג) Hematoxylin ו eosin (H & E) ו מאסון של trichrome (MT) מכתים סעיפים biowire (החצים בעל שני ראשים מייצגים את ציר תפר). ba סולםr = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מהתייחסות 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: פיזיולוגיה של שריר הלב בתרבית פלטפורמת Biowire. (א) תמונות confocal נציג של מגורה ללא (שליטה) ו biowires גירוי חשמלי (3 הרץ ו 6 משטרי הרץ) מראה יישור cardiomyocyte ודיסקים-Z תכופים (החצים בעל שני ראשים מייצגים את ציר תפר). גרין, α-actinin; יקטין, אדום. בר סולם = 20 מיקרומטר. (ב) התפשטות Cardiomyocyte ב biowires הייתה נמוכה מאשר EBS. תפוצה הוערכה על ידי צביעה כפולה עבור actinin-α sarcomeric ו Ki67 (n = 3-4 תנאי לכל, ± הממוצע; SD). *, **, #, ו & מייצגים הבדלים משמעותיים סטטיסטית בהשוואה EBd34 (-test t של סטודנט). דמות זו שונתה מהתייחסות 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: שיפורים מקודמים גירוי חשמלי Ca 2+ טיפול מאפיינים. (AC) עקבות נציג של Ca 2+ שחרור בתגובת קפאין בתאים מלאים nonstimulated (א) ותאי נתון משטר 3-הרץ (B) ואת משטר 6 רץ (C). (ד) שינוי מושרה קפאין של עוצמת קרינת השיא בין קבוצות ניסוי (ממוצע ± SEM לאחר נרמול קרינת שיא intensity לפני זריקת הקפאין; מלא לעומת 3 הרץ, P = 1.1 x 10 - 6; מלא לעומת 6 הרץ, P = 2.1 x 10 - 7; 3 הרץ לעומת 6 הרץ, P = 0.003; n = 10 (שליטה), n = 6 (Hz 3), ו- n = 9 (6 הרץ) (-test t של סטודנט). (E) הקלטת פלורסנט נציג של Ca 2 + ארעיים לפני ואחרי זריקת הקפאין על 5 מ"מ (חץ) בתאים נתונים משטר 6 הרץ. דמות זו שונתה מהתייחסות 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: צועד חשמל משפר אלקטרו נכסים automaticity. Electrophysiolog תכונות iCal ב cardiomyocytes יחיד מבודד biowires או גופים embryoid (EBS) נרשמו עם מהדק תיקון. (א) hERG זנב צפיפות נוכחית. (B) צפיפות זרם לי K1 הנמדדים -100 mV. (ג) upregulation של אשלגן לתיקון כלפי פנים גן ערוץ (KCNJ2). (ד) יחס של תאי מציגים פועמים ספונטני (automaticity) או בלי מכות ספונטניות (ללא automaticity). הנתונים לספירה מייצגים את ממוצע ± SEM ההבדלים בין קבוצת הניסוי נותחו על ידי -test t של הסטודנט, מבחן כי בריבוע, ו ANOVA (השוואות מרובות pairwise, שיטה ההולמת-Sidak). דמות זו שונתה מהתייחסות 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| צעד פרוטוקול # | צעדים קריטיים | ||||
| 2.4 | מניח את מוטות פחמן 1 - מלבד 2 סנטימטר או על המרחק הקטן ביותר האפשרי, כדי למנוע גירוי באנרגיה גבוהה תהליכי מוות תאי. | ||||
| 2.6 | בדוק את החיבורים בין חוט הפלטינה ואת הפחמן פעם בתא הגירוי נעשה בפעם הראשונה. קישור חדר הגירוי אל הממריץ האלקטרוני ולאחר מכן להגדיר מתח רצוי. מניחים להוביל וולט על כל אחד משני מוטות פחמן. מתח המוצא מאולם הגירוי צריך להיות באותו המתח לקרוא על מד המתח. כל קריאות שגויות לציין את הציפוי האפשרי של חוט הפלטינה עם PDMS או אחר חיבור פגום במערכת. | ||||
| 3.1 | תאים בודדים ששימשו לזרוע את biowire. דיסוציאציה, את incubation זמן עם collagenase הוא קריטי וצריך להיקבע על ידי גיל התאים ואת פרוטוקול הבידול (EBS לעומת monolayers). בפרוטוקול זה, זמן דגירה של 2 h מומלץ ליום 21 EBS ו- 30 דקות עבור משטחים. עבור תאים בגילאים אחרים, הפעם עיכול collagenase אולי צריך אופטימיזציה על ידי ניטור כדאיות התא ומתפקדים תנועתיים-עיכול פוסט. | ||||
| 3.3 | טריפסין יכול לגרום נזק לתאים; ובכך, להגביל את משך הדגירה כדי לא יותר מ 5 דקות. | ||||
| 3.5 | הימנע מציגה מזהמים על ידי מחזיק רק בסוף המזרק כדי לצרף את המזרק קצה המחט. מספר הטבילות נקבע על ידי בהעדר גושים הגדולים של תאים. מזער שיבושים מחט כדי למנוע מוות של תאים. למנוע היווצרות בועה. במקרה של גושים גלויים לאחר שיבוש מחט, להאריך את זמן הדגירה ב collagenase ב בידודים עוקבים במקום הגדלהזמן הדגירה טריפסין או מספר צולל. | ||||
| 3.6 | הסר את supernatant לחלוטין לפני תוספת של ג'ל. שיורית בינוני עשוי לדלל את היחס של תא: ג 'ל ולהשפיע על פילמור ג' ל. | ||||
| 3.7 | שמור את הריכוזים של רכיבי ג'ל קולגן כאשר דרוג או למעלה. יש לזכור כי ריכוז המניות עשוי להשתנות בהתאם אצווה או הכנה של ריאגנטים. | ||||
| 3.11 | כדי להבטיח כי microwsells PDMS להישאר בתחתית צלחת פטרי, לוודא כי צלחת פטרי יבש להשתמש זוג מלקחיים סטרילית לדחוף את microwells PDMS למטה. | ||||
| 4.2 | ודא שכל biwires נמצאים במקום. לכסות את biowires לחלוטין עם המדיום בתא גירוי חשמלי. לסדר את כל הביאוורים בניצב מוטות פחמן. | ||||
| 4.3 | <Td colspan = "5"> הימנע מכל נזק לחוט הפלטינה על-ידי כיסוי המכסה בעדינות. השתמש בקלטת כדי לאבטח את המכסה כראוי על הצלחת, למקרה שהמכסה אינו סגור במלואו. בעת סגירת הדלתות חממה, מניחים את החלק הדק של החוטים מן ממריץ חשמלי בנקודות הסגירה הדלת כדי להבטיח את האיטום הנכון של החממה.|||||
| 4.4 | נתק את המאיץ החשמלי לשינויים הבינוניים. השתמש P1000 כדי להסיר רק את החלק העליון של המדיום הישן ולאחר מכן להוסיף בינוני טרי. ודא כי biewires תמיד שקוע מתחת בינוני. | ||||
טבלה 1: צעדים קריטיים בפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר את ההתקנה והטמעה של הפלטפורמה המהונדסת, biowire, כדי לשפר את ההבשלה של hPSC-CMS. המכשיר יכול להתבצע במתקני microfabrication סטנדרטיים, biowires יכול להיות מיוצר עם טכניקות תרבית תאים משותפות לממריץ חשמלי.
למיטב ידיעתנו, אין דיווח שיטה דומה biowires. אסטרטגיה זו מגלה כי מאפייני הבשלה משופרים היו תלויים במשטר הגירוי החשמלי, כפי שמעידים הרמה הבשלה יותר שהושגה biowires נתון המשטר כבש את שער גירוי הגבוה (6 ההרץ לעומת 3 הרץ). Cardiomyocytes ב biowires הפגינו פחות automaticity וזרמים hERG גבוה ואני K1 לעומת EBS טיפח במשך 20 ימים (EBd20) או עבור 40-44 ימים (EBd44). EBd20 cardiomyocytes ייצג את מאפייני התא לפני שילובם biowires, ואילו cardiomyocytes EBd44 היו בתרבית 10 l ימיםonger מאשר הזמן ותרבות biowire ומופעים שגם עם זמן עוד בתרבות בפורמט EB, שריר לב לא יכול להגיע מאפייני הבשלה שווים לאלו המושרים על ידי גירוי חשמלי ב biowires. עם זאת, שריר הלב שהושג באמצעות biowires הם עדיין לא בשלים כמו cardiomyocytes המבוגר.
גירוי מכני הוצע להיות יעיל אינדוקציה של חלבונים מבניים של hPSC-CMS. עם זאת, גירוי מכאני לא להוביל התבגרות אלקטרו 12. זה סימנים המצביעים על הצורך לשלב גירוי חשמלי ומתח מכונאי, ברצף או במקביל, כדי להשרות התמיינות מסוף cardiomyocytes הנגזרות hPSC. השילוב של גירוי חשמלי עם שיטות אחרות, כולל אספקה של ביוכימיים גורמי 17 ויישור תאים ב 3D רקמות 18, יוכל להשיג Strate פרו-הבשלה יעיל יותרGY לעתיד במחקרים vivo.
הממדים של המכשיר biowire משמש כאן הם 5 מ"מ x 1 מ"מ x 0.3 מ"מ (גובה אורך x רוחב x), אבל אפשר לשנות את המכשיר כדי לעשות עוד biowires. עם זאת, גובה biowires מוגבל 0.3 מ"מ (עם רדיוס של ~ 300 מיקרומטר על הידוק ג'ל), נתון למגבלות במשלוח חמצן ברקמות גדולות. כדי להתגבר על מגבלה זו של יצירת רקמות עבות, שיטת זלוף תידרש 19. אף על פי כן, מומלץ לשמור על יחס של 0.5 x 10 6 תאים / 0.5 ס"מ של חוט באורך. עבור biowires יותר, פילמור ג'ל קולגן עשוי להימשך זמן רב, ושינויים תכופים בינוניים יותר עשויים להידרש בהתאם למספר התא המוגבר. יתר על כן, ההגדרה הנוכחית של biowire באמצעות תפר משי אינה מאפשרת מדידה של כוח הכיווץ שנוצר על ידי שריר הלב זרע. עם זאת, שימוש תפר מתכלה עשוי מאקדואר אפשרי הזה בעתיד.
סוג התא נהג להכין את biowire המתואר כאן הוא hESC-CM באמצעות שורת תאי Hes2 20. פרוטוקול יכול גם להשתמש שורות תאים hiPSC (למשל, CDI-MRB ו HR-I-2Cr-2R) 14. יכולת cardiomyogenic של שורות תאי גזע אנושיות שונות עשויה להיות שונה, והתאמת פלטפורמה זו צריכה להיקבע באופן ניסיוני ואת התנאים מותאמים לפי צורך. ישנם מספר צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול (ראו טבלה 1).
בנוסף, biowires נועד להשתלב צלחת 6-היטב, ואת הדוגמא כאן הראתה עשיית biowire אחד. עם זאת, אפשר התרבות חשמלית לעורר biowires בו זמנית גם אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי גרנט ב- סיוע מן הלב ושבץ הקרן של קנדה (G-14-0,006,265), מענקי הפעלה מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר (137,352 ו 143,066), וכן מענק מקרן JP Bickell (1,013,821 ) ל SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
