Summary
Cardiac biowire platform er en in vitro metode, der anvendes til modne humane embryonale og inducerede pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CM) ved at kombinere dyrkning tredimensionale celle med elektrisk stimulering. Dette håndskrift præsenterer den detaljerede opsætning af hjerte- biowire platformen.
Abstract
Humane pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hPSC-CMS) har været en lovende cellekilde og har således tilskyndet undersøgelse af deres potentielle anvendelser i hjerte- forskning, herunder lægemiddelforskning, sygdom modellering, tissue engineering, og regenerativ medicin. Celler fremstillet ved eksisterende protokoller vise en række umodenhed sammenlignet med native voksne ventrikulære cardiomyocytter. Der er gjort mange forsøg på at modne hPSC-CMS med kun moderat modning nået hidtil. Derfor en manipuleret system, kaldet biowire, er blevet udtænkt ved at tilvejebringe både fysiske og elektriske signaler til at lede hPSC-CMS til en mere moden tilstand in vitro. Systemet anvender en mikrofremstillet platform til frø hPSC-CMS i collagen type I gel langs en stiv skabelon sutur til at samle sig på linie hjertevæv (biowire), som underkastes elektrisk felt-stimulering med en gradvis voksende frekvens. Sammenlignet med ikke-stimulerede kontroller,stimulerede biowired cardiomyocytter udviser en forøget grad af strukturel og elektrofysiologisk modning. Sådanne ændringer er afhængige af stimulation sats. Dette manuskript beskriver detaljeret design og skabelse af biowires.
Introduction
Celle-baseret behandling er en af de mest lovende og undersøgte strategier for at opnå hjerteopheling / regeneration. Det er blevet hjulpet af hjertevæv teknik og samtidig tilførsel af biomaterialer 1, 2. De fleste tilgængelige celle kilder er blevet undersøgt i dyremodeller for deres potentielt gavnlige virkninger på beskadigede, syge eller ældre hjerter 3. Især har gjort en betydelig indsats for at anvende human pluripotente stamcelle (hPSC) afledt cardiomyocytter (hPSC-CM), et potentielt ubegrænset autolog celle kilde til hjertevæv engineering. hPSC-CM kan fremstilles under anvendelse af adskillige etablerede protokoller 4, 5, 6. Men de opnåede celler udviser føtale-lignende fænotyper, med en række af umodne egenskaber sammenlignet med voksne ventrikulære cardiomyocytter 7, 8 . Dette kan være en hindring for anvendelsen af hPSC-CM'er som modeller af voksen hjertevæv i forskning i narkotikaforskning og i udviklingen af voksne hjertesygdomsmodeller 9 .
For at overvinde denne begrænsning af fænotypisk umodenhed er nye tilgange blevet undersøgt aktivt for at fremme kardiomyocyt modning. Tidlige studier afslørede effektive formognningsegenskaber i neonatale rottekardiomyocytter via cyklisk mekanisk 10 eller elektrisk stimulering 11 . Gelkomprimering og cyklisk mekanisk stimulering viste sig også at forbedre nogle aspekter af hPSC-CM modning 12 , 13 med minimal forbedring af de elektrofysiologiske og calciumbehandlingsegenskaber. Derfor blev et platformsystem kaldet "biologisk ledning" (biowire) udformet ved at tilvejebringe både strukturelle signaler og elektrisk feltstimuleringn at øge modningen af hPSC-CM'erne 14. Dette system anvender en mikrofremstillet platform til at skabe linie hjertevæv, der er modtagelig for elektrisk felt-stimulering. Dette kan bruges til at forbedre den strukturelle og elektrofysiologiske løbetid på hPSC-CMS. Her beskriver vi detaljerne i at foretage sådanne biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master Design og Fabrication
BEMÆRK: Brug blød litografi til enhed fabrikation. Lav en to-lags SU-8 master for polydimethylsiloxan (PDMS) støbning.
- Design enheden ved hjælp af en design og udarbejdelse software (figur 1A, til venstre). Tegn hvert lag af master separat. Udskrive enheden design på to fotomasker på 20.000 dpi, svarende til de to lag af master 15. Indstille enhedens mønster som gennemsigtige og det omkringliggende område som mørke; maskerne vil tjene som skabelonen til optisk at overføre enhedens mønster på SU-8 ved litografi (som beskrevet af andre 15).
- Dispensere ca. 4 ml af SU-8 50 på midten af en 4 tommer siliciumwafer. Belægge SU-8 50 jævnt på wafer ved anvendelse af en spincoater ved centrifugering ved 2.000 omdrejninger i minuttet (RPM) i 30 s. Bag skiven på en 95 ° C varmeplade i 10 minutter. Expose wafer for ultraviolet (UV) light ved 200 mJ / cm2.
- Hæld omkring 4 ml SU-8 2050 på midten af skiven og centrifugering ved 2.500 rpm i 30 s. Bage på 95 ° C varmeplade i 15 min. Afkøl til stuetemperatur (RT).
- Gentag trin 1.3 to gange mere.
- Dække den belagte wafer med det første lag gennemsigtighed fotomaske. Udsætte wafer for UV-lys ved 270 mJ / cm2 for at gøre det første lag. Bage på 95 ° C varmeplade i 15 min.
- Gøre det andet lag af SU-8 2050 ved at gentage trin 1.3 to gange.
- Tilpasse det andet lag maske trækkene på det første lag ved hjælp af en maske aligner. Derefter udsættes for UV-lys ved 240 mJ / cm2. Bages ved 95 ° C i 15 min.
BEMÆRK: Eksponeringstiden er bestemt af den krævede totale UV-dosis og UV lysudgangsintensitet målt på før anvendelse dagen. - Udvikle waferen ved at nedsænke det i propylenglycolmonomethyletheracetat acetat (PGMEA) og rystning ved 200 RPM i 30 minutter på en orbitalryster.
- PlacereMaster i en petriskål og hæld forsigtigt PDMS-blandingen (base til tværbinder i forholdet 10: 1 efter vægt) i midten af waferen. Dæk alle funktionerne og undgå luftbobler.
- Varm i en ovn ved 70 ° C i 2 timer. Brug et skarpt blad til at skære rundt på kanten af PDMS biowire skabelon ( Figur 1A, højre). Skræl PDMS fra mesteren. Trim enheden med bladet. Sæt PDMS biowire-skabelonen i en steriliseringspose og dampautoklav ved 121 ° C i 20 minutter.
- I et biosikkerhedsskabe (BSC) placeres PDMS biowire-skabelonen i en petriskål. Brug pincet til at holde og sætte et stykke steril kirurgisk silkesirutur (6-0) i midten af kanalen på PDMS microwell ved at placere den i sporene i begge ender af kanalen ( Figur 1B-I ).
2. Oprettelse af den elektriske stimuleringskammer
- Lav et par rektangulære polykarbonatstykker (længde x bredde x tykkelse: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) og bruge dem som ramme den elektriske stimulation kammer (figur 2).
- Bore to 3 mm brede huller 2 cm fra hinanden langs midterlinien af hver polycarbonat rammestykke.
- Skær to stykker 1,5 cm lang kulstofstænger. Bor et mm bred hul 1 gennem carbon stang omkring 3 mm fra enden. Tråd en platintråd gennem kulstiften hul og stram wiren ved at vikle det omkring carbon stang. Vedhæfte et klip til den anden ende af platintråden til senere forbindelse med elektrisk stimulator.
- Indsæt de kulstofstænger ind i polycarbonat rammestykker. Placer den samlede ramme med carbon stænger i en brønd i en seks brønds plade.
- Hæld 2 ml PDMS ind i brønden. Sænk bunden af polycarbonat rammer i PDMS samtidig holde overfladeniveauet PDMS tæt på, men ikke når bunden af carbon stænger. Varme i en ovn ved 70 ° C i 2 timer.
- Tage den elektriske stimulation kammer ud af seksbrønds plade og sætte det i en sterilisering pose til dampsterilisation ved 121 ° C i 20 minutter.
3. Enzymatisk Dissociation af hPSC-CM
- Inducere hPSC at differentiere til cardiomyocytter ved anvendelse af en etableret protokol 4.
BEMÆRK: I korte træk generere cardiomyocytter via etablerede embryoid legeme (EB) protokoller i stamceller pro medium gennem den sekventielle tilskud af knoglemorfogenetisk protein 4, basisk fibroblastvækstfaktor, activin A, vaskulær endotelvækstfaktor, og Dickkopf homolog 1 4. Brug EB'er fra dag 20-34 af differentiering at gøre biowires. - Indsamle EB'er fra den lave fastgørelsesplade med en P1,000 pipettespids og overføres til en konisk rør. Pellet ved centrifugering i 5 minutter ved 125 xg og RT. Supernatanten kasseres og pellet resuspenderes med forvarmet, 37 ° C collagenase type I indeholdende 1% deoxyribonuclease I (DNAse I). Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timerfor fordøjelsen.
- Tilsæt 5 ml forvarmet, 37 ° C vaskemedium og centrifugeres i 5 minutter ved 125 xg og RT. Supernatanten kasseres. Pelleten resuspenderes med 2 ml trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
- Tilsæt 1 ml af stop-medium indeholdende 3% (vol / vol) DNase I.
- Vedhæfte en 20 G (0,9 mm) nål til en 5 ml sprøjte og passere EB suspensionen gennem det 3-5 gange.
- Tilsættes der 7 ml vaskemedium og centrifugeres ved 280 xg i 5 min. Supernatanten kasseres. Pellet resuspenderes i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) og gemme på is. Bestemme celleantallet med et hæmocytometer. Tage 0,5 x 10 6 celler og pellet ved centrifugering ved 280 xg i 5 min. Fjern supernatanten.
- Præ-fede alle gelkomponenterne på is før blanding af dem i et sterilt rør. Bland følgende kollagengel komponenter (slutkoncentration): 2,1 mg / ml rottehalecollagen type I, 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES og 10% ekstracellulær matrix i 1x M199-medium. Tilsæt kollagen og ekstracellulære matrix sidste. Bland ved pipettering op og ned.
- Opblande 0,5 x 10 6 celler med 3,5 pi kollagengel og bland godt.
- Brug en P10 pipettespids at tilføje 4 pi af cellesuspensionen i 0,5 cm lange kanal (figur 1B-II). Justere placeringen af suturen med steril pincet om nødvendigt.
- Dække bunden af petriskålen med steril phosphatpufret saltopløsning (PBS), hvilket gør sikker på ikke at røre gelen. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Erstatte PBS med 12 ml dyrkningsmedium (fx stamceller pro eller medium anbefalet af cellen fabrikanten), nok til at dække cellerne (figur 1B-III). Kulturen i en inkubator ved 37 ° C i 1 uge. Skift mediet hver anden dag.
4. Elektrisk Stimulation for Biowire Dyrkning
- IBSC, tilsættes 2 ml PBS til hver brønd i en seks-brønds plade, der skal huse en elektrisk stimulator kammer. Brug sterile pincetter til anbring forsigtigt autoklaveret elektriske stimuleringsindretning ind i brønden. Kassér PBS fra brønden.
- Dæk kulstofstænger med 5 ml forvarmet dyrkningsmedium. Brug sterile pincetter at montere biowires i den elektriske stimulation kammeret og orientere dem vinkelret på kulstofstænger (Figur 2).
- Låget lægges oven på seks-brønds plade, men giver tilstrækkelig platintråde nå uden for denne plade til at forbinde med den elektriske stimulator. Placer de seks-brønds plade i en cellekultur inkubator ved 37 ° C, og fastgøres platintråden til den elektriske stimulator.
- Stimulere de biowires brug af et elektrisk stimulator med følgende indstilling: tofaset gentage puls, 1-ms impulsvarighed, 3 V / cm, og 1 puls per sekund (PPS). Hæv PPS hver 24 timer til følgende værdier: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, og 6. Skift mediet hver anden dag.
- Observere cardiomyocyte kontraktilitet som respons på elektrisk stimulering under et mikroskop ved 10X forstørrelse.
BEMÆRK: Efter en uges stimulering, de biowires bliver modent (se afsnittet resultater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rationalet for anvendelse af en sutur i biowires er at tjene som en template til dannelse af 3D-konstruktioner, der justeres i én akse og efterligner formen af kardiale fibre. Vi viser, at efter syv dages dyrkning i biowire, celler remodeled gelen omkring suturen (figur 3A). Cellerne samles langs aksen af suturen til dannelse justeret hjertevæv (figur 3). Efter 7 dages forkultur blev biowires underkastet 7 dage af elektrisk felt-stimulering og yderligere udviste egenskaber er forenelige med strukturel og funktionel modning af cardiomyocytter.
Human PSC-CMS i biowires udviste stærk ekspression af kardiale kontraktile proteiner, sarcomerisk α-actinin, og actin (figur 4A). Vi observerede sarcomerisk banding af hPSC-CM kontraktile apparat og opretning af myofibrilar strikturerlangs aksen af suturen. Dette er kvalitativt svarende til strukturen i den voksne hjerte (figur 4A). Sekund, sammenlignet med dem af EB'er, disse biowired embryonale-CM viste lavere celleformeringshastigheder (figur 4B). Tredje, udviste den biowired embryonale-CM forbedrede calcium håndteringsegenskaber (figur 5) og cardiomyocyte elektrofysiologi modning (figur 6). I modne cardiomyocytter, behandling med koffein inducerer en brat frigivelse af Ca2 + fra det sarkoplasmiske reticulum 8. Sådanne Ca2 + transienter blev fundet i elektrisk stimuleret embryonale-CM, men ikke i celler fra ikke-stimulerede kontroller (figur 5A-C). Reaktionen på koffein i de elektrisk stimulerede celler, sammenlignet med ikke-stimulerede kontroller, afslørede en signifikant højere amplitude af intensitet i et stimulering frekvensafhængig måde (figur 5D og E). I mellemtiden hPSC-CMi biowires viste forbedret hERG strøm og indad ensretter (I k1) densiteter, som blev yderligere forbedret ved elektrisk stimulering (figur 6A og B). Sådanne forbedringer i I k1 strøm er i overensstemmelse med en induktion på kalium indadgående ensrettede kanal gen (KCNJ2) proteinekspression i biowires (figur 6C).
En anden vigtig parameter med hensyn til modning er evnen af cardiomyocytter at slå spontant, også kendt som automatik, hvilket er et tegn på umodenhed i at arbejde cardiomyocytter (atrial og ventrikulær) 16. Automatik var signifikant højere i EB-afledte cardiomyocytter sammenlignet med kontrolgrupper biowires (figur 6D), som var sammenlignelig med den for biowires udsat for 6-Hz regime.
Tagen sammen viser disse resultater, at kulturen i biowire med elektrisk stimulering fremmet strukturelle og elektrofysiologiske modning af hPSC-CM'erne 14.
Figur 1: Biowire Culture Platform. (A) Skematisk (venstre) og faktiske (højre) PDMS støbeform biowire. Målestok = 2 mm. (B) at opsætte biowire blev en sutur monteret centralt i kanalen (I). En hESC-CM suspension i collagen type I gel blev podet omkring suturen i kanalen (II) og inkuberet i medium (III). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Biowire blev dyrket i elektrisk stimulering Afdeling i den anden uge af dyrkning. Den biowire blev anbragt vinkelret carbonelektroderne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cell Remodeling og Gel kontraherende omkring Sutur efter den 7. dag i Forkultur i Biowire. (A) lysfelt billeder af embryonale-CMS på angivne dage forkultur i biowire skabelonen. Skala bar = 200 um. (B) Kvantificering af gel komprimering på de angivne dage dyrkning (gennemsnit ± standardafvigelse). (C) Hematoxylin og eosin (H & E) og Masson Trichrome (MT) farvning af biowire sektioner (dobbelt-ledes pile repræsenterer suturen akse). scale bar = 100 um. Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fysiologi Cardiomyocytter Cultured i Biowire Platform. (A) Repræsentative konfokale billeder af ikke-stimulerede (kontrol) og elektrisk stimuleret biowires (3 Hz og 6 Hz regimer) viser cardiomyocyte tilpasning og hyppige Z-skiver (dobbelt-ledes pile repræsenterer suturen akse). Grøn, α-actinin; rød, actin. Målestokken = 20 um. (B) cardiomyocyte proliferation i biowires var lavere end i EB'er. Proliferation blev vurderet ved dobbelt farvning for sarcomerisk α-actinin og Ki67 (n = 3-4 pr tilstand, gennemsnitlige ±; sd). *, **, # og & repræsenterer statistisk signifikante forskelle i forhold til EBd34 (Students t-test). Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: elektrisk stimulering promoverede Forbedringer i Ca2 + Håndtering Egenskaber. (AC) Repræsentative spor af Ca2 + frigivelse som reaktion på koffein i ikke-stimulerede kontrolceller (A) og celler udsat for 3-Hz regime (B) og 6 Hz regime (C). (D) Koffein-induceret ændring af top fluorescensintensitet blandt forsøgsgrupper (gennemsnit ± sem efter normalisering af topfluorescens intensity før indgivelsen af koffein; kontrol versus 3 Hz, P = 1,1 x 10 - 6; kontrol versus 6 Hz, P = 2,1 x 10 - 7; 3 Hz versus 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (kontrol), n = 6 (3 Hz), og n = 9 (6 Hz) (Students t-test). (E) Repræsentativ fluorescerende registrering af Ca2 + transienter før og efter administrationen af koffein på 5 mM (pil) i celler udsat for 6 Hz regime. Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Elektrisk stimulering forbedrer elektrofysiologiske egenskaber og automatisk. Electrophysiologgiske egenskaber i enkelte cardiomyocytter isoleret fra biowires eller embryoide legemer (EBS) blev optegnet med en patch clamp. (A) hERG hale strømtæthed. (B) I K1 strømtæthed målt ved -100 mV. (C) Opregulering af kalium indadgående ensrettede kanal gen (KCNJ2). (D) Ratio af celler, som udviser spontan bankende (automatik) eller ingen spontan bankende (ingen automatik). Dataene i AD repræsenterer gennemsnittet ± SEM Forskellene mellem de eksperimentelle grupper blev analyseret ved Students t-test, chi square test, og ANOVA (parvise multiple sammenligninger, Holm-Sidak metoden). Dette tal er blevet modificeret fra henvisningen 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Protokol trin # | Kritiske trin | ||||
| 2.4 | Placer kulstofstænger 1 - 2 cm fra hinanden eller i den mindst mulige afstand for at undgå høj-energi stimulering og celledød. | ||||
| 2.6 | Test forbindelserne mellem platintråden og carbonatomet, når stimuleringen kammeret er lavet for første gang. Linke stimulering kammer til det elektriske stimulator og derefter indstille en ønsket spænding. Placer en volt føring på hver af de to kulstofstænger. Udgangsspændingen fra stimulering kammer bør være den samme spænding læses på voltmeteret. Eventuelle ukorrekte aflæsninger angiver mulig belægning af platintråden med PDMS eller en anden defekt forbindelse i systemet. | ||||
| 3.1 | Enkeltceller blev anvendt til at pode biowire. For dissociation, den incubation tid med collagenase er kritisk og bør bestemmes i en alder af cellerne og differentiering protokol (EB'er versus monolag). I denne protokol, anbefales en inkubationstid på 2 timer til dag 21 EB'er og 30 min for monolag. For celler af andre aldre, kan collagenasefordøjelse tid har brug for optimering ved at overvåge cellernes levedygtighed og kontraktile funktion efter fordøjelse. | ||||
| 3.3 | Trypsin kan beskadige cellerne; således begrænser inkubationen varighed til ikke længere end 5 min. | ||||
| 3.5 | Undgå at indføre kontaminanter ved kun at holde den ende af sprøjten til at fastgøre sprøjten til nålespidsen. Antallet af nedtrykninger er bestemt ved fravær af store klumper af celler. Minimer nål forstyrrelser for at undgå celledød. Undgå boble dannelse. I tilfælde af synlige klumper efter nålen forstyrrelser, forlænge inkubationstiden i collagenase i efterfølgende isoleringer stedet for at forøgeinkubationstid i trypsin eller antallet af nedtrykninger. | ||||
| 3.6 | Fjern supernatanten fuldstændigt før tilsætningen af gelen. Resterende medium kan fortyndes forholdet celle: gel og påvirke gelpolymerisering. | ||||
| 3.7 | Opretholde koncentrationerne af kollagengelen komponenter, når skalering op eller ned. Husk, at stamkoncentrationer kan variere i henhold til batchen eller fremstillingen af reagenser. | ||||
| 3.11 | For at sikre, at PDMS mikrobrønde bo på bunden af petriskålen, skal du sørge for, at petriskålen er tørt, og brug et par steril pincet til at skubbe PDMS mikrobrønde ned. | ||||
| 4.2 | Sørg for, at alle biowires er på plads. Dæk biowires fuldstændigt med medium i den elektriske stimulation kammer. Arrangere alle biowires vinkelret på kulstofstænger. | ||||
| 4.3 | <td kolonnespredning = "5"> undgå skader på platintråden ved at dække låget forsigtigt. Brug tape til at fastgøre låget ordentligt på pladen, hvis låget ikke lukker helt. Ved lukning Inkubatoren døre, placere tyndere del af trådene fra den elektriske stimulator ved dørlukningsmekanismen punkter for at sikre korrekt tætning af inkubatoren.|||||
| 4.4 | Afbryd den elektriske stimulator for mellemstore ændringer. Brug en P1000 til at fjerne kun den øverste del af det gamle medium og derefter tilføje frisk medium. Sørg for, at biowires altid er neddykket under medium. | ||||
Tabel 1: kritiske stadier i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette håndskrift beskriver opsætning og implementering af manipuleret platform, biowire, for at forbedre modning af hPSC-CMS. Indretningen kan fremstilles i standard microfabrication faciliteter, og biowires kan fremstilles med almindelige celledyrkningsteknikker og en elektrisk stimulator.
Så vidt vi ved, er der ingen rapporterede metode, der ligner biowires. Denne strategi afslører, at forbedrede modningsprodukter egenskaber var afhængige af den elektriske stimulation regime, som det fremgår af større modning niveau opnået i biowires udsat for højere stimulering rate ramp-up regime (6 Hz versus 3 Hz). Cardiomyocytter i biowires viste mindre automatik og højere hERG strømme og jeg k1 sammenlignet med EB'er dyrket i 20 dage (EBd20) eller 40-44 dage (EBd44). EBd20 cardiomyocytter repræsenterede celleegenskaber inden iblandingen i biowires, hvorimod EBd44 cardiomyocytter blev dyrket 10 dage longer end biowire kultur tid og viser, at selv med længere tid i kultur i EB format, kunne cardiomyocytter ikke nå tilsvarende modningsprodukter egenskaber som dem, der induceres ved elektrisk stimulering i biowires. Men de opnåede via biowires cardiomyocytter er stadig ikke så moden som voksne cardiomyocytter.
Mekanisk stimulering er blevet foreslået at være effektiv i induktionen af strukturelle proteiner af hPSC-CM. Men mekanisk stimulation ikke føre til elektrofysiologisk modning 12. Dette kunne tyde på behovet for at kombinere elektrisk stimulering og mekaniker stress, sekventielt eller samtidigt, til at inducere terminal differentiering i hPSC-afledte cardiomyocytter. Kombinationen af elektrisk stimulering med andre metoder, herunder levering af biokemiske faktorer 17 og cellejustering i 3D væv 18, kan være i stand til at opnå en mere effektiv pro-modning strategy til fremtidig in vivo studier.
Dimensionerne af biowire anordning anvendt her, er 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (længde x bredde x højde), men det er muligt at modificere indretningen på en længere biowires. Imidlertid er højden af biowires begrænset til 0,3 mm (med en radius på ~ 300 um ved gel komprimering), i betragtning af de begrænsninger i ilttilførsel i større væv. At overvinde denne begrænsning for at generere tykkere væv, ville en perfusionsmetode kræves 19. Alligevel anbefales det at opretholde forholdet 0,5 x 10 6 celler / 0,5 cm af tråd i længden. Ved længere biowires, kan collagen gelpolymerisering tage længere tid, og der kan være behov hyppigere udskiftning af medium på grund af det øgede antal celler. Hertil kommer, at den nuværende opsætning af biowire hjælp silke sutur ikke mulighed for at måle den kraft af sammentrækning genereres af de seedede cardiomyocytter. brugen af et biologisk nedbrydeligt sutur, kan dog make dette muligt i fremtiden.
Den celletype, anvendes til at gøre biowire beskrevet her er embryonale-CM ved anvendelse af Hes2 cellelinien 20. Protokollen kan også bruge hiPSC cellelinjer (fx CDI-MRB og HR-I-2Cr-2R) 14. Den cardiomyogenic evne forskellige humane stamcellelinjer kan være forskellige, og egnethed til denne platform bør bestemmes eksperimentelt og betingelserne optimeres efter behov. Der er flere kritiske trin i protokollen (se tabel 1).
Derudover blev biowires designet til at passe i en 6-brønds plade, og eksemplet her viste foretagelse af en biowire. Det er imidlertid muligt at dyrke og elektrisk stimulere flere biowires samtidigt i en brønd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling-i-støtte fra Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14 til 0.006.265), driftstilskud fra de canadiske Institutes of Health Research (137.352 og 143.066), og en JP Bickell fundament tilskud (1.013.821 ) til SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
