Summary
Kalp biowire platformu elektrik stimülasyonu ile üç boyutlu hücre ekimi birleştirerek, insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hPSC-CM) olgun için kullanılan bir in vitro yöntem olup. Bu el yazması kardiyak biowire platformunun ayrıntılı kurulum sunar.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre kökenli kardiyomyositler (hPSC-CM'ler) gelecek vaat eden hücre kaynağı olmuş ve böylece ilaç keşfi, hastalık modelleme, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp dahil kardiyak araştırmalarındaki potansiyel uygulamaların soruşturma teşvik ettik. Ancak, mevcut protokoller tarafından üretilen hücrelerin, doğal yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde kıyasla olgunlaşmamış bir dizi gösterir. Birçok çabaları şimdiye dek elde sadece ılımlı olgunlaşma, hPSC-CMS olgun yapılmıştır. Bu nedenle, biowire adı verilen bir mühendislik sistemi, in vitro olarak daha olgun bir duruma hPSC CMS kurşun fiziksel ve elektriksel iki ipuçları temin ederek oluşturulmuştur. Sistem bir giderek artan bir sıklık ile elektriksel alanla uyarıma tabi hizalanmış kardiyak doku (biowire) içine monte etmek için bir bükülmez şablon dikiş boyunca jel kolajen türü hPSC CMS tohum bir mikro-platformu kullanır. stimüle kontroller ile karşılaştırıldığında,biowired kardiyomiyositlerde yapısal ve elektrofizyolojik olgunlaşma geliştirilmiş bir derecede sergileyebilir uyarmıştır. Bu tür değişiklikler stimülasyon hızına bağlıdır. Bu yazının ayrıntılı olarak biowires tasarım ve oluşturulması açıklanmıştır.
Introduction
Hücresel tedavi kardiyak onarım / yenilenme ulaşmak için en umut verici ve incelenen stratejilerden biridir. Bu kalp doku mühendisliği ve biyomalzeme 1, 2 eş zamanlı verilmesi ile yardımcı olmuştur. En uygun hücre kaynakları hasarlı, hastalıklı veya yaşlı kalpleri 3 üzerindeki potansiyel yararlı etkileri için hayvan modellerinde incelenmiştir. Özellikle, önemli çabalar insan pluripotent kök hücresinin kullanmak için yapılmıştır (hPSC) kardiyomiyositlerde (hPSC-CM), kardiyak doku mühendisliği için potansiyel olarak sınırsız otolog hücre kaynağı -türetilmiş. hPSC-CM'ler çeşitli yerleşik protokoller 4, 5, 6 kullanılarak üretilebilir. Bununla birlikte, elde edilen hücreler yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde 7'ye göre olgunlaşmamış özelliklerinin bir dizi fetal benzeri fenotipler sergiler, 8. Bu ilaç keşif araştırma ve yetişkin kardiyak hastalık modellerinin 9 gelişiminde erişkin kalp dokusunun modelleri olarak hPSC-CM'ler uygulanmasına engel teşkil edebilir.
fenotipik olgunlaşmamışlığın bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni yaklaşımlar aktif kardiyomiyosit olgunlaşmasını teşvik etmek için araştırılmaktadır. İlk çalışmalar, siklik mekanik 10 veya elektriksel uyarım 11 aracılığıyla yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde etkili ön-olgunlaşma özellikleri açığa çıkmıştır. Jel sıkıştırma ve siklik mekanik uyarma da elektrofizyolojik ve kalsiyum kullanım özelliklerinin en az donanımıyla hPSC-CM olgunlaşması 12, 13, bazı yönlerini geliştirdiği gösterildi. Bu nedenle, "biyolojik tel" (biowire) olarak adlandırılan bir platform sistemi yapısal işaretler ve elektrik alanı stimülasyon sağlamak suretiyle geliştirildiN hPSC-cm 14 olgunlaşmasını artırmak için. Bu sistem, elektriksel alanla uyarıma müsait hizalanmış kardiyak doku oluşturmak için bir mikro-platformu kullanır. Bu hPSC-cm yapısal ve elektrofizyolojik olgunluk geliştirmek için kullanılabilir. Burada, böyle biowires yapma ayrıntılarını açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ana Tasarım ve İmalat
NOT: araç imalatı için yumuşak litografi kullanın. Polidimetilsiloksan (PDMS), kalıplanması için bir iki tabakalı SU-8 ana olun.
- Cihaz (sol, Şekil 1A), bir tasarım kullanarak ve yazılım hazırlanması tasarımı. ayrı ayrı ana her tabakası çizin. Ana 15 iki katmana tekabül eden 20.000 dpi'de iki fotoğraf maskeleri cihaz tasarımı Baskı. şeffaf gibi cihaz modeli ve koyu olarak çevredeki ayarlayın; maskeleri (diğerleri 15 tarafından tarif edildiği gibi), optik olarak litografi SU-8 üzerine cihaz desen transfer etmek için bir şablon olarak hizmet edecektir.
- 4 inçlik bir silikon gofret merkezi üzerine SU-8 ila 50 arasında, yaklaşık 4 ml koyun. Kaplama SU-8 50 eşit 30 s (RPM) yaklaşık 2000 devirde dönen bir döndürme kaplayıcı kullanılarak gofret. 10 dakika boyunca 95 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde gofret pişiriniz. Ultraviyole (UV) li gofret Açığa200 mJ GHT / cm2.
- 30 saniye süreyle 2500 RPM'de gofret ve spin merkezi üzerine SU-8 2050, yaklaşık 4 ml dökün. 15 dakika boyunca 95 ° C'de bir sıcak plaka üzerindeki fırında. Oda sıcaklığında (RT) soğutulur.
- Adımı tekrarlayın 1.3 iki kere daha.
- birinci tabaka, şeffaflık photomask ile kaplanmış gofret örtün. Ilk katman yapmak için 270 mJ / cm2 UV ışığına gofret Açığa. 15 dakika boyunca 95 ° C'de bir sıcak plaka üzerindeki fırında.
- iki adım 1.3 tekrarlayarak SU-8 2050, ikinci katman olun.
- Bir maske hizalama kullanarak ilk katman üzerinde özelliklere ikinci katman maskesini hizalayın. Daha sonra, 240 mJ / cm2 UV ışığına maruz kalmaktadır. 15 dakika boyunca 95 ° C'de pişirin.
Not: maruz kalma süresi, gereken toplam UV dozu ve kullanımdan önce günde ölçülen UV ışık çıkışı yoğunluğu ile tespit edilir. - propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA) yerleştirilmeden ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca 200 RPM'de çalkalayarak gofret geliştirin.
- yerlevhanın ortasına: dikkatlice bir Petri kutusu içine, ana ve (ağırlık olarak 1 ila 10 arasındaki bir oranda çapraz bağlayıcı baz) PDMS karışımı dökün. Tüm özellikleri örtün ve hava kabarcıklarını önlemek.
- 2 saat boyunca 70 ° C'de bir fırın içinde ısı. PDMS biowire şablonun kenarı (doğru Şekil 1A) etrafında kesmek için keskin bir bıçak kullanarak. ustadan PDMS soyun. bıçak cihazı kesin. 20 dakika boyunca 121 ° C 'de bir sterilizasyon kese ve buhar otoklavda PDMS biowire şablonu koyun.
- Biyogüvenlik kabini (BSC) olarak, bir Petri kabı içine şablona biowire PDMS yerleştirin. Tutun ve kanalın (Şekil 1B-I), her iki ucunda oluk içinde oturma PDMS kuyucuklarda kanalının merkezinde Steril cerrahi ipek sütür (6-0) 'in bir parça monte etmek için cımbız kullanarak.
Elektriksel Uyarımı Odası 2. Oluşturma
- 2 cm x: dikdörtgen polikarbonat parçaları (uzunluk x genişlik x kalınlık bir çift yapmak0.85 cm x 0.35 cm) ve elektrik stimülasyonu odasının çerçeve olarak (Resim 2).
- Her bir polikarbonat çerçeve parçasının merkez hattı boyunca 2 cm aralıklı iki 3 mm genişliğinde delik delin.
- 1.5 cm uzunluğunda karbon çubuklarının iki parça kesin. uçtan 3 mm daha kadar karbon çubuğu boyunca 1 mm çapında bir delik delin. karbon çubuk delikten bir platin tel Konu ve karbon çubuğu etrafına sararak kablo sıkın. Elektrik uyarıcı ile, daha sonra bağlantı için platin tel diğer ucuna bir klip takın.
- polikarbonat çerçeve parçalar halinde karbon çubuklar yerleştirin. altı gözlü bir plakanın bir kuyuya karbon çubuklar monte çerçeve yerleştirin.
- kuyuya PDMS 2 mL dökün. yakın PDMS yüzey düzeyde tutmak ancak karbon çubuklarının alt ulaşan değil ise PDMS polikarbonat çerçevelerinin alt daldırın. 2 saat boyunca 70 ° C'de bir fırın içinde ısı.
- altı üzerinden elektriksel uyarım odası aleh levha, 20 dakika boyunca 121 ° C'de buhar sterilizasyon için bir sterilizasyon kese içine koyun ve.
hPSC-CM'ler 3. enzimatik ayrışma
- Kurulu bir protokol 4 kullanılarak kardiyomiyositlere ayırt etmek hPSC neden.
Not: Kısaca, ofisler embriyoit gövde ile kardiyomiyositlerde oluşturmak (EB) protokolleri kemik morfogenetik protein 4, bazik fibroblast büyüme faktörü, aktivin A, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve Dickkopf homolog 1 ila 4 ile sıralı takviyesi ile kök pro ortamda. biowires yapmak için farklılaşma günden 20-34 den EBS kullanın. - Bir P1,000 pipet ucu ile düşük bağlanma plakadan EBS toplamak ve bir konik tüp aktarın. 125 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj ile pelet. ile pelet Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyon haline önceden ısıtılmış, 37 1% deoksiribonükleaz içeren ° C kollajenaz tip I (DNAz I). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edinSindirim için.
- Önceden ısıtılmış, 37 ° C 5 ml ekleyin 125 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika için orta ve santrifüj yıkayın. Süpernatant atılır. tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- % 3 ihtiva eden durdurma ortamının 1 ml ekleyin (h / h) DNaz I
- 3-5 kez 5 ml şırıngaya 20 G (0.9 mm) bir iğne takılır ve içinden EB süspansiyon geçmektedir.
- 5 dakika süre ile 280 x g'de yıkama ortamında ve santrifüj 7 mL ekleyin. Süpernatant atılır. Iscove'un değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) içinde pelletini ve buz üzerinde muhafaza edin. hemositometre ile hücre sayısını belirler. 5 dakika süre ile 280 x g'de santrifüj ile 0.5 x 10 6 hücre ve pelet al. süpernatantı.
- bir steril tüp içine katmadan önce buz üzerinde önceden soğutmak bütün jel bileşenler. takip eden kolajen jel bileşenlerinin (nihai konsantrasyon) karıştırın: 2,1 mg / ml sıçan kuyruğu I tipi kolajen, 24.9 mM glikoz, 23.8 mM NaHCO 3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, ve 1 x M199 ortamı içinde% 10 hücre dışı matris. kolajen ve son hücre dışı matriks ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
- Kollajen jel 3.5 uL, 0.5 x 10 6 hücre yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.
- 0.5 cm uzunluğunda bir kanal (Şekil 1B-II) 'hücre süspansiyonu 4 uL eklemek için bir P10 pipet kullanın. Steril forseps gerektiğinde dikiş ipliğinin pozisyonunu ayarlar.
- emin jel dokunun dikkat ederek, steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile Petri kabı alt kapak. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Hücreler (Şekil 1B-III) karşılamak için yeterli kültür ortamı 12 mL (örneğin, Pro ya da orta hücre üretici tarafından tavsiye edilen sap), PBS ile değiştirin. 1 hafta boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde kültür. günaşırı ortamı değiştirin.
Biowire Yetiştirme 4. Elektriksel Uyarımı
- İçindeBSC, bir elektrik stimülatörü odası ev sahipliği yapacak altı gözlü bir plakanın her bir oyuğuna, 2 mL PBS ilave edin. yavaşça kuyuya otoklava elektriksel uyarım aygıtını yerleştirmek için steril cımbız kullanarak. kuyudan PBS atın.
- önceden ısıtılmış kültür ortamı 5 mL karbon çubuklar örtün. Elektrik uyarımı haznesinde biowires monte etmek için steril cımbız kullanarak ve karbon çubukları (Şekil 2) dik olarak yönlendirmek.
- altı plaka üstüne kapak yerleştirin, fakat elektrik uyarıcı ile bağlanmak için plakanın dışında ulaşan yeterli platin tel bırakın. 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde altı-plaka ve elektrik stimülatörü platin tel bağlayın.
- İki fazlı tekrar darbe, 1-ms atım süresi, 3 V / cm, ve saniyede 1 darbesi (PPS), bir elektrikli aşağıdaki ayarlar ile stimülatörü kullanılarak biowires teşvik. aşağıdaki değerlere PPS 24 saatte kaldırılması: 1.83, 2.66, 3.49, 4.82, 5.15 ve 6. Değişim orta günaşırı.
- 10 kat büyütmede mikroskop altında elektriksel uyarıya tepki olarak kardiyomiyosit kasılmasını dikkate alınmalıdır.
NOT: stimülasyon bir hafta, biowires olgun hale geldikten sonra (sonuçlar bölümüne bakınız).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
biowires bir ameliyat dikiş ipliği kullanımı için rasyonel bir eksen hizalamak ve kalp liflerin şekli taklit 3D yapıları oluşturmak için bir şablon olarak hizmet etmektir. Biz biowire kültür yedi gün sonra, hücreler, ameliyat dikiş ipliği (Şekil 3A) yaklaşık jel yenilenmiş göstermektedir. Dikiş ekseni boyunca monte hücreler kalp dokusunu (Şekil 3) hizalanmış oluşturulur. ön kültür 7 gün sonra, biowires 7 elektriksel alan stimülasyonu gün kardiyomiositlerin yapısal ve fonksiyonel olgunlaşması ile uyumlu başka sergilenen özellikleri tabi tutuldu.
Biowires PSC-CM'ler insan kardiyak kontraktil proteinlerin güçlü bir ifade sarkomerik α-aktinin ve aktin (Şekil 4A) sergilemiştir. Biz myofibrilar striktür hPSC-CM kontraktil aparat ve hizalama sarkomerik bant gözlenmiştirdikiş ekseni boyunca. Bu yetişkin kalp (Şekil 4A) yapı niteliksel benzerdir. İkinci olarak, EBS kıyasla, bu biowired hESC CM'ler düşük proliferasyon oranları (Şekil 4B) gösterilir. Üçüncü olarak, biowired hESC CM'ler kalsiyum tutma özellikleri (Şekil 5) ve kardiyomiyosit elektrofizyoloji olgunlaşmasını (Şekil 6) geliştirilmiş sergilemiştir. Olgun kardiyomiyositlerinde, kafein ile tedavi Sarkoplazmik retikulum 8'den Ca2 + ani bir salımına sebep olmaktadır. Bu gibi Ca2 + geçici elektrikle uyarılan hESC CM'ler bulunan fakat non-uyarılmış kontrollere (Şekil 5A-C) hücrelerde bulundu. Uyarılmamış kontrol grubu ile karşılaştırıldığında elektrikle uyarılan hücrelerde kafein yanıt, bir uyarı frekansı bağımlı bir şekilde (Şekil 5D ve E) 'de yoğunluğu belirgin bir şekilde daha yüksek bir genliğe saptandı. Bu arada, hPSC-CM'lerbiowires de elektrik stimülasyonu (Şekil 6A ve B) tarafından geliştirilmiştir hERG akım ve rektifayer akım içeri doğru da (I k1) yoğunlukları, geliştirilmiş olduğunu göstermiştir. I k1 akımında Bu gibi iyileştirmeler, biowires (Şekil 6C) potasyum içeri doğru rektifiye kanal geni (KCNJ2) proteini ifadesinde bir endüksiyon ile uyum içindedir.
Olgunlaşması ile ilgili diğer önemli parametre, kardiyomiyositler (atriyal ve ventriküler) 16 çalışma olgunlaşmamış bir işareti olan kendiliğinden yenmek için kardiyomiyositlerin kapasitesi de, otomatisite olarak da bilinen, bir. Otomatisite 6 Hz rejime biowires bu karşılaştırılabilir kontrol biowires (Şekil 6D), ile karşılaştırıldığında EB türetilmiş kardiyomiyositlerde anlamlı düzeyde daha yüksekti.
almakN birlikte alındığında, bu sonuçlar, elektriksel uyarıya sahip olan biyolojik kök hücrenin hPSC-CM'lerin yapısal ve elektrofizyolojik olgunlaşmasını arttırdığını göstermektedir14.
Şekil 1: Biyolojik Kültür Platformu. ( A ) Şematik (solda) ve gerçek (sağdaki) PDMS biyolojik kalıp. Ölçek çubuğu = 2 mm. ( B ) Biyoyüarı kurmak için, kanalın (I) merkezinde bir dikiş monte edildi. Kolajen tip I jeldeki bir hESC-CM süspansiyonu kanada (II) dikişin etrafına ekildi ve ortamda (III) kuluçkaya yatırıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2:Biowire Yetiştirme İkinci Haftası'nda Elektrik Uyarım Odası kültürü oluşturuldu. biowire karbon elektrot dik yerleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre remodeling ve Jel Biowire içinde ön-kültüre bırakılmıştır 7 gün sonra kenet yaklaşık öngörür. (A) biowire şablonunda ön kültür belirtilen günlerde hESC CM'ler ait aydınlık görüntüler. Ölçü bar = 200 um. Kültür belirtilen günlerde jel sıkıştırmanın (B) miktarının belirlenmesi (ortalama ± SD ortalaması olarak). Biowire bölümlerin (C), hematoksilin ve eozin (H & E) ile Masson trikrom (MT) boyama (çift yönlü oklar dikiş ekseni ifade etmektedir). Ölçek bar = 100 um. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Biowire Platformu Kardiyomiyositler kültürlenen fizyolojisi. (A) uyarılmamış (kontrol) Örnek konfokal görüntü ve kardiyomiyosit hizalama ve sık Z diskleri gösteren elektriksel olarak uyarılmış biowires (3 Hz ve 6 Hz rejimleri) (çift yönlü oklar dikiş ekseni ifade etmektedir). Yeşil, α-aktinin; kırmızı, aktin. Ölçek çubuğu 20 um =. Biowires (B) kardiyomiyosit proliferasyon EBS göre daha düşüktü. Çoğalma sarkomerik α-aktinin ve Ki67 (n = 3-4 ortalama durum, ortalama ± çift boyaması yolu ile değerlendirildi; SD). *, **, #, ve & EBd34 (Student t-testi) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: Ca 2+ Elektrik Uyarım Tanıtılan İyileştirmeler Özellikler 'Handling. (AC) 3 Hz rejimi (B), ve 6 Hz rejimi (C) tabi stimüle kontrol hücreleri (A) ve hücrelerde kafein tepki olarak Ca2 + salınım Örnek izleri. (D) Deney grupları arasında en yüksek floresan yoğunluğunun Kafein-bağlı değişim (tepe floresan i normalize sonra ortalama ± SEMkafein verilmesinden önce ntensity; 3 Hz, p = 1.1 x 10 karşı kontrol - 6; 6 Hz, p = 2.1 x 10 karşı kontrol - 7; 6 Hz karşı 3Hz, p = 0.003; n = 10 (kontrol), n = 6 (3 Hz), ve n = 9 (6 Hz) (Student t-testi). (E) 2 + geçici önce ve 6 Hz rejimine tabi hücrelerde 5 mM (ok) kafein uygulanmasından sonra Ca Örnek floresan kaydı. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 6: Elektrik Pacing Elektrofizyolojik Özellikler 've otomatiklik geliştirir. Electrophysiologbiowires veya embriyoit organları (EBS) izole tek kardiyomiyositlerde ik özellikleri, yama kelepçe ile kaydedilmiştir. (A) hERG kuyruk akımı yoğunluğu. -100 mV ölçülen (B) K1 akım yoğunluğu. (C) yukarı regülasyonu potasyum içeri doğru (KCNJ2) kanal geni giderilmesi. (D), spontan bir dayak (otomatisite) ya da spontan dayak (bir otomatisite) gösteren hücrelerin oranı. AD veriler deney grupları arasındaki farklar Student t-testi, ki-kare testi ve ANOVA (ikili çoklu karşılaştırmalar, Holm-Sidak yöntemi) ile analiz edildi ortalama ± SEM temsil eder. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Protokol adım # | Kritik Adımlar | ||||
| 2.4 | 2 cm aralıklı ya da mümkün olan en küçük mesafeden yüksek enerjili uyarılması ve hücre ölümünü önlemek için 1 - karbon çubuklar yerleştirin. | ||||
| 2.6 | platin teli ve uyarma haznesi ilk kez yapıldıktan sonra karbon arasındaki bağlantıları test edin. elektrik stimülatörü uyarma haznesi bağlantı ve daha sonra arzu edilen bir gerilim ayarlayın. iki karbon çubukların her biri üzerine bir volt öne yerleştirin. stimülasyon odasından çıkış voltajı voltmetre okumak aynı gerilim olmalıdır. Herhangi bir yanlış okumalar PDMS ile platin tel olası bir kaplama ya da sistem içinde bir başka bozuk bir bağlantı göstermektedir. | ||||
| 3.1 | Tek hücreler biowire tohum için kullanılmıştır. ayrışma için, KuluçkaKolajenaz ile n-zaman kritiktir ve hücrelerin yaşı ve farklılaşma protokolü (EB'lere karşı mono tabakalar) ile belirlenmelidir. Bu protokolde, 21 EB'lik günler için 2 saatlik inkübasyon süresi ve tek katmanlılar için 30 dakika önerilir. Diğer yaştaki hücreler için kollajenaz sindirim zamanı, hücre yaşayabilirliğini ve sindirim sonrası kasılabilme fonksiyonunu izleyerek optimizasyona ihtiyaç duyabilir. | ||||
| 3.3 | Trypsin hücrelere zarar verebilir; Dolayısıyla inkübasyon süresini 5 dakikadan daha uzun olmayan bir süreye sınırlayın. | ||||
| 3.5 | Şırıngayı iğne ucuna tutturmak için şırınganın sadece ucunu tutarak kirletici maddeleri sokmaktan kaçının. Dalma sayısı, büyük hücre yığınlarının bulunmamasıyla belirlenir. Hücrenin ölümünden kaçınmak için iğne parçalanmasını en aza indirin. Kabarcık oluşumundan kaçının. İğne bozulmasından sonra görülebilen kümeler durumunda, sonraki izolasyonlarda kollajenazda inkübasyon süresini arttırmak yerine, kuluçka süresini uzatın.Tripsin veya daldırır sayısında inkubasyon süresi. | ||||
| 3.6 | jel eklenmesinden önce tamamen süpernatantı. Kalıntı ortam hücrenin oranını seyreltik edilebilir: jel ve jel polimerizasyonunu etkiler. | ||||
| 3.7 | ölçeklendirme veya aşağı zaman kolajen jel bileşenlerin konsantrasyonlarının muhafaza edin. Stok konsantrasyonları reaktiflerin yığın ya da hazırlanması göre değişebilir göz önünde bulundurun. | ||||
| 3.11 | Bu mikro-Petri kabı alt kısmında kalmak PDMS sağlamak için, Petri kabı kuru olduğundan emin olun ve PDMS mikro aşağı itmek için steril forseps bir çift kullanın. | ||||
| 4.2 | Tüm biowires yerinde olduğundan emin olun. Tamamen elektriksel stimülasyon odasında ortamı ile biowires örtün. C-dik doğrultuda her biowires düzenlemek. | ||||
| 4.3 | <td birleşmiş satır = "5"> yavaşça kapak kaplayarak platin tel zarar kaçının. Kapak tam olarak kapanmaz durumda tabakta düzgün kapağı tutturmak için bant kullanın. inkübatör kapıları kapatırken, kuluçka doğru sızdırmazlığı sağlamak için, kapı kapama noktalarında elektrik stimülatör tellerin ince kısmını yerleştirin.|||||
| 4.4 | Orta değişiklikler için elektrik stimülatörü ayırın. Eski ortamın sadece üst kısmını kaldırmak ve daha sonra taze orta eklemek için bir P1000 kullanın. biowires hep orta altında batık emin olun. | ||||
Tablo 1: Protokol Kritik adımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazının hPSC-CM'ler olgunlaşmasını geliştirmek için, mühendislik platformu, biowire kurulumunu ve uygulanmasını açıklar. Cihaz, standart mikroimalat tesislerinde yapılabilir ve biowires ortak hücre kültürü teknikleri ve bir elektrik uyarıcı ile üretilebilir.
Bildiğimiz kadarıyla, biowires benzer hiçbir rapor yöntem yoktur. Bu strateji, yüksek uyarım oranı rampa rejimi (3 Hz karşı 6Hz) tabi biowires elde edilen daha büyük bir olgunlaşma düzeyi ile kanıtlandığı gibi gelişmiş olgunlaşma özellikleri, elektriksel stimülasyon rejime bağlıdır olduğunu ortaya koymaktadır. Biowires kardiyomi az otomatisite ve daha yüksek hERG akımları gösterdi ve EBS 20 gün (EBd20) ya da 40-44 gün (EBd44) için yetiştirilen I kıyasla K1. EBd44 kardiyomiyositlerde 10 gün l kültürlenmiştir ise EBd20 kardiyomiyositlerde, biowires içine dahil edilmeden önce, hücre özelliklerini temsilonger hatta İT biçimde kültür içinde daha uzun bir süre ile, kardiyomiyositler biowires içinde elektriksel uyarımı ile uyarılan gibi eşdeğer olgunlaşma özellikleri ulaşamadı biowire kültür süresi ile gösterir daha. Ancak, biowires yoluyla elde edilen kardiyomyositler hala yetişkin kardiyomiyositlere kadar olgun değildir.
Mekanik uyarma hPSC-cm yapısal proteinlerin meydana getirmede etkili olduğu öne sürülmüştür. Ancak, mekanik uyarım elektrofizyolojik olgunlaşmasına 12 yol açmadı. Bu hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde nihai değişimi etkilemek için, sırayla ya da eş zamanlı olarak, elektriksel uyarma ve mekanik stres birleştirme ihtiyacı göstergesi olabilir. -Biyokimyasal uygulaması dahil diğer yöntemler, elektriksel uyarma kombinasyonu, 17 faktörleri ve 3D hücre hizalama daha etkili bir ön-olgunlaşma stratejilerin elde etmek mümkün olabilir, 18 dokularin vivo çalışmalar gelecek için gy.
Burada kullanılan biowire cihazın boyutları 5 mm'dir x x 0.3 mm (uzunluk x genişlik x yükseklik), 1 mm, ancak daha uzun biowires olmak için aygıtı değiştirmek mümkündür. Bununla birlikte, biowires yüksekliği (jel sıkıştırma işlemi üzerine ~ 300 um bir çapa sahip) 0.3 mm ile sınırlı büyük dokularda oksijen teslim sınırlamaları verilmiştir. Daha kalın dokuların üretilmesi, bu sınırlamayı aşmak için, bir perfüzyon yöntemi 19 gerekli olacaktır. Bununla birlikte, 0.5 x 10 6 hücre / uzunluğu telin 0.5 cm oranını korumak için tavsiye edilir. uzun biowires için, kollajen jel kullanılan polimerizasyon daha uzun sürebilir, ve daha sık ortam değişiklikler, hücre sayısındaki artış gerekli olabilir. Ayrıca, ipek sütür kullanılarak biowire mevcut ayar tohumlanmış kardiyomiyositlerde tarafından oluşturulan daralma kuvveti ölçümü için izin vermez. Bununla birlikte, biyolojik olarak parçalanabilir bir ameliyat dikiş ipliğinin kullanılması mak olabilirGelecekte bu mümkün e.
Burada tarif edilen biowire yapmak için kullanılan hücre tipi Hes2 hücre hattı 20 ile HESC-cm'dir. Protokol da hiPSC hücre çizgileri (örneğin, CDI-MRB ve HR-l-2CR-2R) 14 kullanabilir. farklı insan kök hücresi hatlarının cardiomyogenic yeteneği farklı olabilir ve bu platform için uygunluğu deneysel olarak tespit edilmelidir ve gerektiğinde koşulları optimize. (Tablo 1) protokolü içinde çeşitli kritik adımlar vardır.
Buna ek olarak, biowires 6 gözlü bir plakada uyacak şekilde tasarlanmıştır ve örneğin burada bir biowire yapılışını göstermektedir. Ancak, kültüre mevcuttur ve elektriksel bir kuyuda aynı anda birden fazla biowires uyarırlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Kalp ve İnme Kuruluşundan (G-14-0006265) hibe yardımı, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden işletme hibeleri (137352 ve 143066) ve bir JP Bickell vakfı hibesi (1013821 ) SSN'ye gönderir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
