Summary
De cardiale biowire platform is een in vitro werkwijze toegepast om menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM) rijpen combineert driedimensionale celkweek elektrische stimulatie. Dit handschrift bevat de gedetailleerde opzet van de cardiale biowire platform.
Abstract
Human pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CMS) hebben een veelbelovende bron van cellen geweest en hebben dus moedigde het onderzoek naar hun potentiële toepassingen in cardiale onderzoek, met inbegrip van de ontdekking van geneesmiddelen, de ziekte van modellering, tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Cellen die door bestaande protocollen geven een reeks onrijpheid vergeleken met natief volwassen ventriculaire hartspiercellen. Vele pogingen zijn gedaan om te rijpen HPSC-CM's, met slechts een matige rijping tot nu toe bereikt. Daarom is een ontworpen systeem, genaamd biowire is bedacht door zowel fysische en elektrische signalen leiden HPSC-CM naar volwassen toestand vitro. Het systeem gebruikt een microfabricated platform HPSC-CM zaad collageen type I gel langs een stijve matrijs hechtdraad assembleren tot uitgelijnde hartweefsel (biowire), die wordt onderworpen aan elektrisch veld stimulering met een progressief toenemende frequentie. Vergeleken met niet gestimuleerde controlesbiowired gestimuleerde cardiomyocyten vertonen een verhoogde mate van structurele en elektrofysiologische rijping. Dergelijke veranderingen zijn afhankelijk van de stimulatiefrequentie. Dit manuscript beschrijft in detail de ontwerpen en maken van biowires.
Introduction
Cel-gebaseerde therapie is een van de meest veelbelovende en onderzocht strategieën om cardiale reparatie / regeneratie te bereiken. Het is geholpen door hartweefsel engineering en co-afgifte van biomaterialen 1, 2. De meeste beschikbare bronnen van cellen zijn onderzocht in diermodellen voor hun mogelijk gunstige effecten op beschadigde, zieke of oude harten 3. In het bijzonder zijn aanzienlijke inspanningen gedaan om pluripotente stamcellen humaan gebruik (HPSC) afgeleide cardiomyocyten (HPSC-CM), een potentieel onbeperkte bron van autologe cellen voor cardiale tissue engineering. HPSC-CM's kunnen worden geproduceerd met behulp van verschillende vastgestelde protocollen 4, 5, 6. De verkregen cellen vertonen foetaal-achtige fenotypen met verschillende onvolwassen kenmerken in vergelijking met volwassen ventriculaire hartspiercellen 7, 8. Dit kan een belemmering vormen voor de toepassing van HPSC-CM's als modellen van volwassen hartweefsel in drug discovery onderzoek en in de ontwikkeling van volwassen hartziekten modellen 9 zijn.
Om deze beperking van de fenotypische onvolwassenheid te overwinnen, zijn nieuwe benaderingen actief onderzocht om cardiomyocyt rijping te promoten. Vroege studies toonden effectieve pro-rijping eigenschappen in neonatale cardiomyocyten van de rat via cyclische mechanische of elektrische 10 stimulatie 11. Gel verdichting en cyclische mechanische stimulatie werd ook aangetoond dat bepaalde aspecten van HPSC-CM maturatie 12, 13, met een minimale verhoging van de elektrofysiologische en calcium hanteringseigenschappen te verbeteren. Daarom is een platformsysteem genaamd "biologische wire" (biowire) werd ontwikkeld door zowel structurele signalen en elektrisch veld stimulatien de rijping van HPSC-CM 14 verbeteren. Dit systeem gebruikt een microfabricated platform gericht cardiaal weefsel dat geschikt is voor elektrisch veld stimulering te creëren. Dit kan worden gebruikt om de structurele en elektrofysiologische looptijd HPSC-CM verbeteren. Hier beschrijven we de details van het maken van dergelijke biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Master ontwerp en de fabricage
OPMERKING: Gebruik een zachte lithografie voor fabricage van de inrichting. Maak een tweelaags SU-8 meester voor polydimethylsiloxaan (PDMS) gieten.
- Ontwerp het apparaat met een ontwerp en conceptsoftware (Figuur 1A, links). Trekken elke laag van de master gescheiden. Druk het ontwerp apparaat twee fotomaskers bij 20.000 dpi, overeenkomen met de twee lagen van de master 15. Stel de inrichtingpatroon doorzichtig en de omgeving zo donker; de maskers zal dienen als de matrijs optisch op SU-8 overdragen inrichtingpatroon door lithografie (zoals beschreven door anderen 15).
- Afzien ongeveer 4 ml SU-8 50 op het midden van een 4 inch siliciumwafel. Coat de SU-8 50 gelijkmatig over de wafer met gebruik van een spin coater door spinnen bij 2000 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 30 s. Bak de wafer op een kookplaat 95 ° C gedurende 10 minuten. Maak de wafer aan ultraviolette (UV) livechten bij 200 mJ / cm2.
- Giet ongeveer 4 ml SU-8 2050 op het midden van de wafel en centrifugeren bij 2500 rpm gedurende 30 s. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min. Koel af tot kamertemperatuur (RT).
- Herhaal stap 1.3 twee keer.
- Bedek de beklede wafer met de eerste laagtransparantie fotomasker. Maak de wafel UV licht bij 270 mJ / cm2 aan de eerste laag te maken. Bakken op 95 ° C hete plaat gedurende 15 min.
- Maak de tweede laag van SU-8 2050 door het herhalen van stap 1,3 maal.
- Lijn de tweede laag masker om de functies op de eerste laag een masker aligner. Dan, bloot te stellen aan UV-licht bij 240 mJ / cm2. Bakken bij 95 ° C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: De belichtingstijd wordt bepaald door de vereiste totale UV-dosis en de UV lichtopbrengst intensiteit gemeten op de dag voorafgaand aan gebruik. - Ontwikkeling van de wafer door het onder te dompelen in propyleenglycol monomethylether acetaat (PGMEA) en geschud bij 200 rpm gedurende 30 minuten op een rondschudapparaat.
- Plaatsde master in een petrischaal en giet het mengsel PDMS (base verknopingsmiddel in een verhouding van 10: 1 op gewichtsbasis) in het midden van de wafel. Bedek alle functies en vermijd luchtbellen.
- Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur. Met een scherp mes rond de rand van de PDMS biowire template (Figuur 1A, rechts) te snijden. Schil de PDMS van de master. Trim de inrichting met het blad. Zet de PDMS biowire matrijs in een sterilisatie zakje en stoom autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
- In een bioveiligheid kast (BSC), plaatst u de PDMS biowire template in een petrischaal. Met een pincet te houden en monteer een stuk steriel chirurgisch zijden hechtdraad (6-0) in het midden van het kanaal van de PDMS microputjes door plaatsing in de groeven aan beide uiteinden van het kanaal (Figuur 1B-I).
2. Het creëren van de elektrische stimulatie Chamber
- Voeg een paar rechthoekige stukken polycarbonaat (lengte x breedte x dikte: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) en gebruik ze als het frame van de elektrische stimulatie kamer (figuur 2).
- Boor twee gaten 3 mm breed 2 cm uit elkaar langs de hartlijn van elk polycarbonaat kozijndeel.
- Snij twee stukken van 1,5 cm koolstofstaven. Boor een 1 mm breed gat door de koolstaaf ongeveer 3 mm van het einde. Draad een platinadraad met het koolstofatoom staafgat en draai de draad door het wikkelen rond de koolstof staaf. Bevestig een clip aan het andere einde van de platinadraad later verbinding met de elektrische stimulator.
- Plaats de koolstof staven in het polycarbonaat raambenen. Plaats de gemonteerde frame koolstof staven in een putje van een plaat met zes putjes.
- Pour 2 mL PDMS in de put. Dompel de onderkant van het polycarbonaat frames in PDMS terwijl het PDMS maaiveld dichtbij, maar de bodem van de koolstofstaven niet bereiken. Verhit in een oven bij 70 ° C gedurende 2 uur.
- Neemt de elektrische stimulatie kamer van de zes-well bord en zet het in een sterilisatie zakje voor stoomsterilisatie bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
3. Enzymatische dissociatie van HPSC-CM
- HPSC induceren te differentiëren tot hartspiercellen middels een vaststaand protocol 4.
OPMERKING: kort genereren hartspiercellen via vastgesteld embryoiden lichaam (EB) voorschriften steel pro medium door de achtereenvolgende suppletie met bot morfogenetisch proteïne 4, basische fibroblast groeifactor, activine A, vasculaire endotheliale groeifactor, en Dickkopf homoloog 1 4. Gebruik EBS vanaf dag 20-34 van differentiatie te biowires te maken. - Verzamel de EBS van de lage plaat bevestiging met een P1,000 pipetpunt en overbrengen naar een conische buis. Pellet door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met voorverwarmd, 37 ° C collagenase type I met 1% desoxyribonuclease I (DNAse I). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uurvoor de spijsvertering.
- Voeg 5 ml voorverwarmd, 37 ° C wasmedium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 125 x g en kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 ml trypsine ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing / en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml stop medium met 3% (v / v) DNase I.
- Bevestig een 20 G (0,9 mm) naald in een 5 ml spuit en laat de EB suspensie doorheen 3-5 keer.
- 7 ml wasmedium en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) en bewaar op ijs. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer. Neem 0,5 x 10 6 cellen en pellet door centrifugatie bij 280 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Pre-cool alle gelcomponenten op ijs alvorens ze te mengen in een steriele buis. Meng de volgende collageengel componenten (eindconcentratie): 2,1 mg / ml rattenstaart collageen type I, 24,9 mM glucose, 23,8 mM NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES en 10% extracellulaire matrix 1x M199 medium. Voeg de collageen en extracellulaire matrix laatste. Meng door en neer te pipetteren.
- Resuspendeer 0,5 x 10 6 cellen met 3,5 pl collageen gel en meng goed.
- Gebruik een P10 pipettip 4 pi van de celsuspensie toe te voegen van 0,5 cm lang kanaal (Figuur 1B-II). Stel de positie van de hechtdraad met een steriel pincet indien nodig.
- Bedek de bodem van de petrischaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en let niet aan de gel raken. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Vervang PBS met 12 ml kweekmedium (bijvoorbeeld stam pro of medium door de fabrikant cel), voldoende om de cellen (Figuur 1B-III) te dekken. Kweken in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 week. Verander het medium om de andere dag.
4. Elektrische stimulatie voor Biowire Teelt
- Inde BSC, voeg 2 ml PBS aan elk putje van een plaat met zes putjes die een elektrische stimulator kamer zal huisvesten. Gebruik steriele pincet plaats voorzichtig het geautoclaveerde elektrische stimulatie-inrichting in de put. Gooi de PBS uit de put.
- Bedek de koolstofstaven met 5 ml voorverwarmd kweekmedium. Gebruik steriele pincet om de biowires de elektrische stimulatie kamer monteren en richt ze loodrecht op de koolstof staven (figuur 2).
- Plaats het deksel bovenop de plaat met zes putjes, maar laat voldoende platinadraden bereiken buiten de plaat te verbinden met de elektrische stimulator. Plaats de plaat met zes putjes in een cel incubator bij 37 ° C en sluit de platinadraad de elektrische stimulator.
- Stimuleren biowires via een elektrische stimulator met de volgende instellingen: tweefasige herhalende puls 1 ms pulsduur, 3 V / cm en 1 puls per seconde (PPS). Breng de PPS elke 24 uur de volgende waarden: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, en 6. Wijziging van het medium om de andere dag.
- Let op de cardiomyocyt contractiliteit in reactie op elektrische stimulatie onder een microscoop bij 10x vergroting.
NB: Na een week van de stimulatie, de biowires volwassen wordt (zie de resultaten sectie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rationeel gebruik van een hechting in de biowires moet dienen als een matrijs voor het vormen van 3D-constructen die aansluiten op één as en bootsen de vorm van cardiale vezels. We tonen aan dat na zeven dagen van de cultuur in de biowire, cellen gerenoveerd de gel rond de hechtdraad (Figuur 3A). De cellen samengevoegd langs de as van de hechtdraad vormen uitgelijnde hartweefsel (figuur 3). Na 7 dagen voorkweek werden de biowires onderworpen aan 7 dagen elektrisch veld stimulering en verder vertoonde eigenschappen geschikt voor structurele en functionele rijping van cardiomyocyten.
Humane PSC-CM in biowires vertoonde sterke expressie van contractiele eiwitten, sarcomeer α-actinine en actine (Figuur 4A). We observeerden sarcomeer banding van de HPSC-CM contractiele apparaat en uitlijning van de myofibrilar stricturenlangs de as van de hechtdraad. Dit is kwalitatief vergelijkbaar met de constructie in het volwassen hart (Figuur 4A). Ten tweede, in vergelijking met die van EBS deze biowired hESC-CM weergegeven onderste proliferatiesnelheden (figuur 4B). Ten derde, de biowired hESC-CM vertoonden verbeterde calciumhuishouding eigenschappen (figuur 5) en cardiomyocyt electrofysiologie rijping (Figuur 6). In volwassen cardiomyocyten, behandeling met cafeïne veroorzaakt een abrupte afgifte van Ca2 + uit het sarcoplasmatisch reticulum 8. Zoals Ca2 + transiënten gevonden in elektrisch gestimuleerd hESC-CM, maar niet in cellen van niet-gestimuleerde controles (figuur 5A-C). De reactie op cafeïne in de elektrisch gestimuleerde cellen in vergelijking met niet-gestimuleerde controles toonde een significant hogere amplitude-intensiteit in een stimulatiefrequentie-afhankelijke wijze (Figuur 5D en E). Ondertussen HPSC-CMin biowires toonde verbeterde HERG en binnenwaartse stroom (k1) dichtheden, die verder werd versterkt door elektrische stimulatie (Figuur 6A en B). Dergelijke verbeteringen in I k1 stroom in overeenstemming met een inductie kalium naar binnen rectificeren kanaal gen (KCNJ2) eiwitexpressie in biowires (Figuur 6C).
Een andere belangrijke parameter met betrekking tot rijping is het vermogen van de hartspiercellen op spontane slaan, ook bekend als automatisme, wat een teken is van onrijpheid in werkende cardiomyocyten (atrium en ventrikel) 16. Automatisme was significant hoger bij EB-afgeleide cardiomyocyten vergeleken met controlewaarden biowires (figuur 6D), die vergelijkbaar is met die in biowires onderworpen aan 6-Hz regime was.
NemenCn samen geven deze resultaten aan dat cultuur biowire elektrische stimulatie bevorderde de structurele en elektrofysiologische rijping van HPSC CM-14.
Figuur 1: Biowire Culture Platform. (A) Schematisch (links) en actuele (rechts) PDMS mal van biowire. Schaal bar = 2 mm. (B) Instellen van de biowire, werd een hechting centraal in het kanaal (I) aangebracht. Een hESC-CM suspensie in type I collageen gel werd gezaaid rond de hechtdraad in het kanaal (II) en geïncubeerd in medium (III). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:Biowire werd gekweekt in de elektrische stimulatie Kamer tijdens de tweede week van de teelt. De biowire werd loodrecht op de koolstofelektroden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: celremodelering en Gel verdragsluitende rond de Hechting na 7 dagen van Precultuur in Biowire. (A) Helderveld beelden van hESC-CM's op de aangegeven dagen van voorkweek in de biowire template. Schaal bar = 200 urn. (B) Kwantificering gel verdichting op de aangegeven dagen kweken (gemiddelde ± sd). (C) met hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's trichroom (MT) biowire kleuring van secties (de dubbele pijlen geven de hechtdraad as). Scale bar = 100 urn. Dit cijfer is aangepast referentie 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Physiology of cardiomyocyten gekweekt bij Biowire Platform. (A) Vertegenwoordiger confocale beelden van niet-gestimuleerde (controle) en elektrisch gestimuleerde biowires (3 Hz en 6 Hz regimes) toont cardiomyocyten uitlijning en frequente Z-disks (de dubbele pijlen geven de hechtdraad as). Groen, α-actinine; rood, actine. Schaalstaaf = 20 urn. (B) proliferatie Cardiomyocyte in biowires lager dan in het EBS. Proliferatie werd bepaald door dubbele kleuring voor sarcomeer-α-actinine en Ki67 (n = 3-4 per conditie, gemiddelde ±; sd). *, **, # en & vertegenwoordigen statistisch significante verschillen ten opzichte van EBd34 (Student's t-test). Dit cijfer is aangepast referentie 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: elektrische stimulatie op verbeteringen in Ca 2+ Handling Eigenschappen. (AC) Representatieve sporen van Ca2 + afgifte in reactie op cafeïne in gestimuleerde controlecellen (A) en cellen blootgesteld aan het 3'-Hz regime (B) en 6 Hz regime (C). (D)-cafeïne afgeleide verandering van piek fluorescentie-intensiteit tussen experimentele groepen (gemiddelde ± sem na het normaliseren van de piek fluorescentie intensity voor de toediening van cafeïne; control versus 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; control versus 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz versus 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (controle), n = 6 (3 Hz) en n = 9 (6 Hz) (Student's t-test). (E) Representatieve fluorescente opname van Ca2 + transiënten voor en na de toediening van cafeïne met 5 mM (pijl) in cellen onderworpen aan 6 Hz regime. Dit cijfer is aangepast referentie 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Elektrische Stimulatie Verbetert Elektrofysiologische Eigenschappen en Automatisme. Electrophysiological eigenschappen in één cardiomyocyten geïsoleerd uit biowires of embryoïde lichamen (EB's) werden opgenomen met een patch clamp. (A) hERG staart stroomdichtheid. (B) I K1 stroomdichtheid gemeten bij -100 mV. (C) Opwaartse regulatie van kalium naar binnen rectificeren kanaal gen (KCNJ2). (D) Verhouding tussen cellen die spontaan kloppend (automatisme) of geen spontane kloppen (geen automatisme). De gegevens in AD geven het gemiddelde ± SEM van de verschillen tussen de experimentele groepen werden geanalyseerd met Student's t-test, chi- kwadraat test, ANOVA en (paarsgewijze meerdere vergelijkingen, Holm-Sidak methode). Dit cijfer is aangepast referentie 14. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Protocol stap # | Kritieke stappen | ||||
| 2.4 | Plaats de koolstofstaven 1 tot 2 cm uit elkaar of op de kleinste afstand om hoog energie stimulatie en celdood te vermijden. | ||||
| 2.6 | Test de verbindingen tussen de platinumdraad en de koolstof zodra de stimulatiekamer voor de eerste keer is gemaakt. Link de stimulatie kamer aan de elektrische stimulator en stel dan een gewenste spanning in. Plaats een volt leiding op elk van de twee koolstofstaven. De uitgangspanning van de stimulatiekamer moet dezelfde spanning zijn die op de voltmeter wordt gelezen. Eventuele onjuiste aflezingen geven de mogelijke bekleding van de platina draad aan met PDMS of een andere defecte aansluiting in het systeem. | ||||
| 3.1 | Enkele cellen werden gebruikt om de biowire te zaaien. Voor dissociatie, de incubatieN tijd met collagenase is kritisch en moet bepaald worden door de leeftijd van de cellen en het differentiatieprotocol (EBs versus monolayers). In dit protocol wordt een incubatietijd van 2 uur aanbevolen voor dag 21 EB en 30 min voor monolayers. Voor cellen van andere leeftijden, zou de collagenase verteringstijd mogelijk optimalisatie moeten hebben door de levensduur van de cel en contractiele functie na de spijsvertering te monitoren. | ||||
| 3.3 | Trypsine kan de cellen beschadigen; Dus de incubatietijd beperken tot niet meer dan 5 minuten. | ||||
| 3.5 | Vermijd het plaatsen van verontreinigingen door alleen het uiteinde van de spuit vast te houden om de spuit aan de naaldpunt te bevestigen. Het aantal stukken wordt bepaald door de afwezigheid van grote klompen cellen. Minimaliseer naaldverstoring om de dood van de cel te vermijden. Vermijd belvorming. In geval van zichtbare klontjes na naaldafbreking, verleng de incubatietijd bij collagenase in daaropvolgende isolaties in plaats van het verhogen van deincubatietijd in trypsine of het aantal stort. | ||||
| 3.6 | De bovenstaande vloeistof volledig voorafgaand aan de toevoeging van gel. Resten van het medium kan de verhouding van cellen te verdunnen: gel en beïnvloeden gelpolymerisatie. | ||||
| 3.7 | Handhaaf de concentraties van de componenten collageengel tijdens het schalen omhoog of omlaag. Onthoud dat bestand concentraties kunnen variëren afhankelijk van de lading of de bereiding van de reagentia. | ||||
| 3.11 | Om ervoor te zorgen dat PDMS microputjes blijven op de bodem van de petrischaal, ervoor zorgen dat de petrischaal is droog en gebruik een paar steriele tang om de PDMS microwells beneden te duwen. | ||||
| 4.2 | Zorg ervoor dat alle biowires op hun plaats zitten. Bedek de biowires volledig met medium in elektrische stimulatie kamer. Regelen alle biowires loodrecht op koolstof staven. | ||||
| 4.3 | <td colspan = "5"> Voorkom beschadiging van de platinadraad door het bedekken van het deksel zachtjes. Gebruik tape om het deksel goed te beveiligen op de plaat in het geval dat het deksel niet volledig sluiten. Bij het sluiten van de incubator deur, plaats het dunnere deel van de draden van de elektrische stimulator bij de deur sluitpunten om een goede afdichting van de incubator waarborgen.|||||
| 4.4 | Koppel de elektrische stimulator voor het medium verandert. Gebruik een P1000 om alleen het bovenste gedeelte van het oude medium te verwijderen en voeg dan vers medium. Zorg ervoor dat de biowires altijd ondergedompeld onder medium. | ||||
Tabel 1: kritische stappen in het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft de opzet en uitvoering van de gemanipuleerde platform, biowire, om de rijping van HPSC-CM's te verbeteren. De inrichting kan worden vervaardigd in standaard microfabricage faciliteiten en biowires kunnen worden met gemeenschappelijke celkweek technieken en een elektrische stimulator.
Voor zover wij weten, is er geen methode gerapporteerd vergelijkbaar met biowires. Deze strategie blijkt dat een betere rijping eigenschappen waren afhankelijk van de elektrische stimulatie regime, zoals blijkt uit de hoger maturatieniveau verkregen op biowires onderworpen aan hogere aanlooptijd regime stimulatiefrequentie (6 Hz versus 3 Hz). Cardiomyocyten als biowires wees minder automatisme en hogere hERG stromen en ik k1 tegenover EBS gedurende 20 dagen (EBd20) of 40-44 dagen (EBd44) gekweekt. EBd20 hartspiercellen vertegenwoordigde de cel eigenschappen voor hun opname in biowires, terwijl EBd44 hartspiercellen gekweekt 10 dagen lOnger dan biowire kweektijd en laat zien dat zelfs met langere tijd in kweek in EB-formaat, cardiomyocyten kon niet gelijkwaardig rijping eigenschappen als die geïnduceerd door elektrische stimulatie bij biowires bereiken. Echter, de verkregen via biowires hartspiercellen zijn nog niet zo volwassen als volwassen hartspiercellen.
Mechanische stimulatie gesuggereerd effectief bij de inductie van structurele proteïnen van HPSC-CM zijn. Echter, mechanische stimulatie niet leiden tot elektrofysiologische rijping 12. Dit kan aanleiding zijn om elektrische stimulatie en mechanische stress te combineren, achtereenvolgens of gelijktijdig aan terminale differentiatie in HPSC afgeleide cardiomyocyten induceren. De combinatie van elektrische stimulatie met andere methoden, zoals de afgifte van biochemische factoren 17 en celuitlijning in 3D weefsels 18, zou kunnen een efficiëntere pro-rijping strate verwezenlijkengy voor toekomstig in vivo studies.
De afmetingen van de inrichting biowire worden daarbij 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (lengte x breedte x hoogte), maar het is mogelijk de inrichting te wijzigen om meer biowires maken. Echter, is de hoogte van de biowires beperkt tot 0,3 mm (met een straal van -300 urn op gel verdichten), gezien de beperkingen in zuurstoflevering in grotere weefsels. Om deze beperking te genereren dikkere weefsels krijgen zullen een perfusie methode vereist 19. Toch verdient het aanbeveling om de verhouding van 0,5 x 10 6 cellen / 0,5 cm draad lengte behouden. Voor langere biowires kan collageengel polymerisatie langer en frequenter mediumveranderingen nodig zijn als gevolg van het toegenomen aantal cellen. Bovendien is de huidige instelling van de biowire behulp zijden hechtdraad niet mogelijk voor het meten van de samentrekkingskracht die door de geënte cardiomyocyten. Echter kan het gebruik van een biologisch afbreekbare hechtdraad make dit mogelijk in de toekomst.
Het gebruikte celtype de hier beschreven biowire maken is hESC-CM middels de Hes2 cellijn 20. Het protocol kan ook iPSC cellijnen (bijvoorbeeld CDI-MRB en HR-I-2Cr-2R) 14. Cardiomyogene de mogelijkheid van andere menselijke stamcellijnen kunnen verschillen en geschiktheid voor dit platform moet proefondervindelijk worden bepaald en de omstandigheden geoptimaliseerd nodig. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol (zie tabel 1).
Bovendien werden de biowires ontworpen om te passen in een 6-well plaat, en het voorbeeld hier bleek het maken van een biowire. Het is echter mogelijk om de cultuur en elektrisch stimuleren biowires meerdere tegelijk in één putje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie-in-steun van de Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), operationele subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (137.352 en 143.066), en een JP Bickell stichting subsidie (1.013.821 ) aan SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
