Summary
منصة أسلاك القلب هو وسيلة في المختبر المستخدمة لتنضج الجنينية البشرية والمستحثة الجذعية الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية (هسك-سم) من خلال الجمع بين زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مع التحفيز الكهربائي. تقدم هذه المخطوطة الإعداد المفصل لمنصة أسلاك القلب.
Abstract
وقد الجذعية المحفزة المشتقة من الخلايا العضلية البشرية (hPSC-CMS) مصدر خلية واعد ووهكذا شجعت التحقيق في التطبيقات المحتملة في مجال البحوث القلب، بما في ذلك اكتشاف المخدرات، والنمذجة المرض، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي. ومع ذلك، والخلايا التي تنتجها البروتوكولات القائمة عرض مجموعة من النضج مقارنة مع العضلية البطين الكبار الأم. وقد بذلت الكثير من الجهود لتنضج hPSC-مضادة، مع نضوج المعتدل فقط يتحقق حتى الآن. لذلك، نظام هندسيا، ودعا biowire، وقد وضعت من خلال تقديم العظة على حد سواء الفيزيائية والكهربائية لقيادة hPSC-مضادة إلى حالة أكثر نضجا في المختبر. ويستخدم هذا النظام منصة microfabricated البذور hPSC-مضادة في نوع الكولاجين I هلام على طول الخيط قالب جامد لتجميع في أنسجة القلب الانحياز (biowire)، التي تخضع لتحفيز الحقل الكهربائي مع التكرار المتزايد تدريجيا. مقارنة مع الضوابط nonstimulated،حفز biowired العضلية يحمل درجة محسنة من النضج الهيكلي والكهربية. هذه التغيرات تعتمد على معدل التحفيز. توضح هذه المخطوطة في التفاصيل تصميم وإنشاء biowires.
Introduction
العلاج خلية القاعدة هي واحدة من الاستراتيجيات الواعدة والتحقيق لتحقيق إصلاح القلب / تجديد. تم بمساعدة من قبل هندسة الأنسجة القلبية وشارك في تسليم المواد الحيوية 1 و 2. وقد تم دراسة معظم المصادر خلية المتاحة في النماذج الحيوانية للالتأثيرات الايجابية على التالفة، المريضة، أو قلوب الذين تتراوح أعمارهم بين 3. على وجه الخصوص، وقد بذلت جهودا كبيرة لاستخدام الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC) -derived العضلية (hPSC-CM)، مصدر خلية ذاتي قد يكون غير محدود لهندسة الأنسجة القلبية. hPSC-مضادة يمكن أن تنتج باستخدام العديد من البروتوكولات المعمول 4 و 5 و 6. ومع ذلك، فإن الخلايا التي تم الحصول عليها عرض الظواهر الجنين مثل، مع مجموعة من الخصائص غير ناضج مقارنة العضلية البطين الكبار 7، 8. هذا يمكن أن يكون عائقا أمام تطبيق hPSC-مضادة كنماذج من أنسجة القلب الكبار في مجال البحوث اكتشاف المخدرات وفي تطوير نماذج مرض القلب الكبار 9.
ومن أجل التغلب على هذا الحد من عدم النضج المظهري، وقد تم التحقيق في نهج جديدة بنشاط لتعزيز cardiomyocyte النضج. وكشفت الدراسات المبكرة خصائص المؤيدة للنضوج فعالة في العضلية الفئران حديثي الولادة عن طريق دوري الميكانيكية 10 أو التحفيز الكهربائي 11. عرضت الضغط جل والتحفيز الميكانيكي دوري أيضا إلى تحسين بعض جوانب hPSC-CM نضوج 12، 13، مع تعزيز الحد الأدنى من الخصائص التعامل الكهربية والكالسيوم. ولذلك، فقد تم ابتكار نظام منصة تسمى "سلك البيولوجي" (biowire) عن طريق توفير العظة الهيكلية والكهربائية stimulatio الحقلن لتعزيز نضوج hPSC-مضادة 14. يستخدم هذا النظام منصة microfabricated لخلق أنسجة القلب الانحياز التي هي قابلة للتحفيز الحقل الكهربائي. وهذا يمكن أن تستخدم لتحسين النضج الهيكلي والكهربية من hPSC-مضادة. هنا، نحن تصف تفاصيل اتخاذ مثل biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ماجستير تصميم وتصنيع
ملاحظة: استخدام الطباعة الحجرية لينة لتصنيع الجهاز. جعل اثنين من طبقة سو-8 سيد ل بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) صب.
- تصميم الجهاز باستخدام تصميم وصياغة البرمجيات ( الشكل 1A ، يسار). رسم كل طبقة من سيد بشكل منفصل. طباعة تصميم الجهاز على اثنين من الضوئيات في 20،000 نقطة في البوصة، المقابلة لطبقتين من سيد 15 . تعيين نمط الجهاز شفافة والمنطقة المحيطة بها كما الظلام. والأقنعة بمثابة قالب لنقل بصريا نمط الجهاز على سو-8 بواسطة الطباعة الحجرية (كما هو موضح من قبل الآخرين 15 ).
- الاستغناء عن 4 مل من سو-8 50 على مركز رقاقة السيليكون 4 بوصة. معطف سو-8 50 بالتساوي على الرقاقة باستخدام المغطي تدور من قبل الغزل في 2000 دورة في الدقيقة (رم) لمدة 30 ثانية. خبز الرقاقة على 95 درجة مئوية موقد لمدة 10 دقيقة. فضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية (أوف) ليGHT على 200 ميغا جول / سم 2.
- صب حوالي 4 مل من SU-8 2050 على مركز الرقاقة وتدور في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. خبز على 95 درجة مئوية موقد لمدة 15 دقيقة. بارد لدرجة حرارة الغرفة (RT).
- كرر الخطوة 1.3 مرتين أكثر.
- تغطية الرقاقة المغلفة مع الشفافية الضوئية الرئيسية الطبقة الأولى. فضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية في 270 ميغا جول / سم 2 لجعل الطبقة الأولى. خبز على 95 درجة مئوية موقد لمدة 15 دقيقة.
- جعل الطبقة الثانية من SU-8 2050 بتكرار الخطوة 1.3 ضعف.
- محاذاة قناع الطبقة الثانية إلى الميزات على الطبقة الأولى باستخدام اليجنر قناع. ثم، تعرض للأشعة فوق البنفسجية في 240 ميغا جول / CM2. تخبز في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يتم تحديد وقت التعرض على مجموع جرعة الأشعة فوق البنفسجية المطلوبة وضوء الأشعة فوق البنفسجية كثافة الانتاج قياسها في اليوم قبل استخدامها. - تطوير رقاقة عن طريق غمر في بروبيلين غليكول خلات monomethyl الأثير (PGMEA) وتهتز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري.
- مكانسيد في طبق بتري وبعناية صب PDMS خليط (قاعدة لcrosslinker في نسبة 10: 1 من حيث الوزن) في وسط الرقاقة. تغطية جميع الميزات وتجنب فقاعات الهواء.
- الحرارة في الفرن على 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. استخدام شفرة حادة لقطع حول حافة القالب biowire PDMS (الشكل 1A، يمين). قشر PDMS من سيد. تقليم الجهاز مع النصل. وضع القالب biowire PDMS في الحقيبة التعقيم والبخار الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- في خزانة السلامة البيولوجية (BSC)، ضع PDMS biowire القالب في طبق بتري. استخدام ملاقط لعقد وجبل قطعة معقمة خياطة الحرير الجراحية (6-0) في مركز القناة للmicrowell PDMS من الجلوس في الأخاديد على طرفي القناة (الشكل 1B-I).
2. إنشاء غرفة تحفيز الكهربائية
- جعل زوج من القطع البولي مستطيلة (طول × عرض × سماكة: 2 سم ×0.85 سم × 0.35 سم) واستخدامها كإطار للغرفة التحفيز الكهربائي (الشكل 2).
- حفر اثنين من الثقوب 3 مم واسعة 2 سم بعيدا على طول خط الوسط من كل إطار البولي قطعة.
- قطع قطعتين من 1.5 سم قضبان الكربون طويلة. حفر حفرة 1 ملم واسعة من خلال قضيب الكربون حوالي 3 ملم من نهاية المباراة. كاتب الموضوع سلك البلاتين من خلال ثقب قضيب الكربون وتشديد السلك الاشارات حول قضيب الكربون. إرفاق مقطع إلى الطرف الآخر من سلك البلاتين للاتصال لاحق مع التحفيز والتشجيع والكهربائية.
- إدراج قضبان الكربون في قطع إطار البولي. وضع إطار تجميعها مع قضبان الكربون في بئر من لوحة ستة جيدا.
- صب 2 مل من PDMS في البئر. غمر الجزء السفلي من إطارات البولي في PDMS مع الحفاظ على مستوى سطح PDMS بالقرب من ولكن لا تصل إلى الجزء السفلي من قضبان الكربون. الحرارة في الفرن على 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- خذ غرفة التحفيز الكهربائي من ستةلوحة حسنا ووضعها في الحقيبة التعقيم في التعقيم بالبخار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. الأنزيمية تفكك hPSC-مضادة
- حمل hPSC على التمايز إلى العضلية باستخدام بروتوكول المعمول 4.
ملاحظة: لفترة وجيزة، وتوليد العضلية عبر الجسم مضغي أنشئت (EB) البروتوكولات في الجذعية المتوسطة الموالية من خلال مكملات متتابعة مع بروتين مخلق العظام 4، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية، activin A، عامل النمو البطاني الوعائي، وDickkopf homolog 1 4. استخدام EBS من يوم 20-34 التمايز لجعل biowires. - جمع EBS من لوحة مرفق منخفضة مع P1،000 ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي الشكل. بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 125 x ج وRT. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه مع درجة حرارة مسبقا، 37 ° C نوع كولاجيناز I تحتوي على 1٪ ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعةللهضم.
- إضافة 5 مل من قبل تحسنت، 37 درجة مئوية غسل المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 125 x ج و رت. تجاهل طاف. ريسوسبيند بيليه مع 2 مل من التربسين / إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) حل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من المتوسطة وقف تحتوي على 3٪ (الخامس / الخامس) دناز I.
- إرفاق 20 G (0.9 مم) إبرة إلى حقنة 5 مل وتمرير تعليق إب من خلال ذلك 3-5 مرات.
- إضافة 7 مل من غسل المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 280 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. ريسوسبيند بيليه في إيسكوف المعدلة في دولبيكو المتوسطة (إدم) وتخزينها على الجليد. تحديد عدد الخلايا مع عدادة الكريات. خذ 0.5 × 10 6 خلايا وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 280 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
- قبل تبريد جميع مكونات هلام على الجليد قبل خلطها في أنبوب معقمة. مزيج من مكونات هلام الكولاجين التالية (التركيز النهائي): 2.1 ملغ / مل الفئران ذيل نوع الكولاجين الأول، 24.9 ملي الجلوكوز، 23.8 ملي ناهCO 3، 14.3 ملي هيدروكسيد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، والمصفوفة خارج الخلية 10٪ في 1X M199 المتوسطة. إضافة الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية الأخيرة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- إعادة تعليق 0.5 × 10 6 خلايا مع 3.5 ميكرولتر من هلام الكولاجين وتخلط جيدا.
- استخدام P10 ماصة لإضافة 4 ميكرولتر من تعليق خلية في القناة 0.5 سم طويلة (الشكل 1B-II). ضبط الموقف من الدرز مع ملقط معقم إذا لزم الأمر.
- تغطية الجزء السفلي من طبق بيتري العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، والتأكد من عدم لمس هلام. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- استبدال PBS مع 12 مل من مستنبت (على سبيل المثال، وقف الموالية أو المتوسطة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة الخلية)، وهو ما يكفي لتغطية الخلايا (الشكل 1B-III). الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. تغيير المتوسط كل يوم.
4. التنبيه الكهربائي لBiowire زراعة
- فيوBSC، إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني على كل بئر من لوحة ستة جيدا الذي سيضم في غرفة مشجعا الكهربائية. استخدام ملاقط معقمة لوضع بلطف تعقيمها جهاز التحفيز الكهربائي في البئر. تجاهل PBS من البئر.
- تغطية قضبان الكربون مع 5 مل من مستنبت قبل تحسنت. استخدام ملاقط معقمة لتركيب biowires في غرفة التحفيز الكهربائي وتوجيهها عمودي على قضبان الكربون (الشكل 2).
- وضع غطاء على رأس لوحة ستة جيدا، ولكن ترك أسلاك البلاتين كافية تصل إلى خارج لوحة للتواصل مع التحفيز والتشجيع والكهربائية. وضع لوحة ستة جيدا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية وتوصيل سلك البلاتين إلى التحفيز والتشجيع والكهربائية.
- تحفيز biowires باستخدام التحفيز والتشجيع والكهربائية مع الإعداد التالي: ثنائي الطور نبض تكرار، مدة النبضة 1 مللي، 3 V / سم، و1 النبض في الثانية الواحدة (PPS). رفع PPS كل 24 ساعة إلى القيم التالية: 1.83، 2.66، 3.49، 40.82، 5.15، و6. تغيير المتوسط كل يوم.
- مراقبة انقباض cardiomyocyte ردا على التحفيز الكهربائي تحت المجهر في 10X التكبير.
ملاحظة: بعد أسبوع واحد من التحفيز، وbiowires يصبح ناضجة (راجع قسم النتائج).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرشيد لاستخدام الخيط في biowires هو بمثابة قالب لتشكيل بنيات 3D التي تتفق في محور واحد وتقليد الشكل من ألياف القلب. وتبين لنا أنه بعد سبعة أيام من الثقافة في biowire، تشكيلها خلايا هلام حول خياطة (الشكل 3A). الخلايا تجميعها على طول محور خياطة لتشكيل محاذاة أنسجة القلب (الشكل 3). بعد 7 أيام من preculture، تعرضوا للbiowires إلى 7 أيام من التحفيز الحقل الكهربائي وخصائص أخرى عرضت متوافقة مع النضج الهيكلي والوظيفي للالعضلية.
الإنسان PSC-مضادة في biowires عرضت تعبير قوي عن البروتينات مقلص القلب، الساركومير α-actinin، والأكتين (الشكل 4A). لاحظنا النطاقات الساركومير من جهاز مقلص hPSC-CM والمواءمة بين القيود myofibrilarعلى طول محور خياطة. وهذا مشابه نوعيا للهيكل في قلب الكبار (الشكل 4A). ثانيا، مقارنة مع تلك التي EBS، عرض هذه biowired HESC-مضادة انخفاض معدلات انتشار (الشكل 4B). ثالثا، عرضت على biowired HESC-مضادة تحسن التعامل مع خصائص الكالسيوم (الشكل 5)، ونضوج cardiomyocyte الكهربية (الشكل 6). في العضلية الناضجة، والمعاملة مع الكافيين الحث على الافراج المفاجئ من الكالسيوم 2+ من شبكية الهيولى العضلية 8. تم العثور على هذا الكالسيوم 2+ العابرين في حفز كهربائيا HESC-مضادة، ولكن ليس في الخلايا من الضوابط غير حفز (الشكل 5A-C). وردا على الكافيين في الخلايا تحفز كهربائيا، مقارنة مع الضوابط غير المنبهة، كشفت عن وجود السعة أعلى بكثير من كثافة في التحفيز التي تعتمد على التردد بطريقة (الشكل 5D و E). وفي الوقت نفسه، hPSC-مضادةفي biowires أظهرت تحسن قناة- herg الحالي والباطنة مقوم التيار (I K1) الكثافة، التي تعززت مزيدا من التحفيز الكهربائي (الشكل 6A و B). هذه التحسينات في I K1 الحالية تتفق مع لمحة تعريفية في البوتاسيوم تصحيح باطنه التعبير الجيني قناة (KCNJ2) البروتين في biowires (الشكل 6C).
معلمة هامة أخرى تتعلق النضج هو القدرة على العضلية للفوز من تلقاء أنفسهم، والمعروف أيضا باسم التلقائية، وهو علامة على النضج في العمل العضلية (الأذيني والبطيني) 16. كانت تلقائية أعلى بكثير في العضلية المستمدة EB-مقارنة biowires التحكم (الشكل 6D)، والتي كانت مماثلة لتلك التي في biowires تخضع لنظام 6 هرتز.
يأخذن معا، وتشير هذه النتائج إلى أن الثقافة في biowire مع التحفيز الكهربائي شجعت النضج الهيكلي والكهربية من hPSC-مضادة 14.
الشكل 1: Biowire منصة الثقافة. (A) تخطيطي (يسار) والفعلي (يمين) PDMS القالب من biowire. شريط مقياس = 2 مم. (B) لإعداد biowire، وقد شنت خياطة مركزي في قناة (I). وكان المصنف A تعليق HESC-CM في نوع الكولاجين جل I حول خياطة في قناة (II) وحضنت في المتوسط (III). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:كان مثقف Biowire في غرفة التحفيز الكهربائي خلال الأسبوع الثاني من زراعة. وضعت biowire عمودي على أقطاب الكربون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعادة عرض خلية وجل مقاولات حول خياطة بعد 7 أيام من Preculture في Biowire. (A) وصور Brightfield من HESC-مضادة في الأيام المشار إليها من preculture في القالب biowire. شريط مقياس = 200 ميكرون. (B) الكمي من الضغط جل في الأيام المشار الثقافة (متوسط ± SD). (C) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) وماسون ثلاثي الألوان (MT) تلطيخ أقسام biowire (الأسهم برأسين تمثل محور خياطة). با نطاقص = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فسيولوجيا العضلية مثقف في منهاج Biowire. (A) صور متحد البؤر التمثيلية للغير حفز (السيطرة) وbiowires حفز كهربائيا (3 هرتز و 6 نظم هرتز) تظهر محاذاة cardiomyocyte والأقراص Z متكررة (الأسهم برأسين تمثل محور خياطة). أخضر، ألفا-actinin. الحمراء، الأكتين. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. كان (B) انتشار Cardiomyocyte في biowires أقل مما كانت عليه في EBS. تم تقييم انتشار عن طريق تلطيخ مزدوج لالساركومير α-actinin وKi67 (ن = 3-4 في حالة ومتوسط ±. التنمية المستدامة). *، **، #، ووتمثل فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة EBd34 (الطالب ر -test). تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التنبيه الكهربائي تحسينات رقي في كا 2+ التعامل مع خصائص. (AC) آثار التمثيلية من الكالسيوم 2+ الإفراج ردا على الكافيين في الخلايا nonstimulated سيطرة (A) والخلايا تخضع لنظام 3-هرتز (B) ونظام 6 هرتز (C). (D) التغيير الناجم عن الكافيين من شدة ذروة مضان بين المجموعات التجريبية (يعني ± ووزارة شؤون المرأة بعد تطبيع ذروة مضان طntensity قبل إدارة الكافيين. السيطرة مقابل 3 هرتز، P = 1.1 X 10-6. السيطرة مقابل 6 هرتز، P = 2.1 X 10-7. 3 هرتز مقابل 6 هرتز، P = 0.003. ن = 10 (السيطرة)، ن = 6 (3 هرتز)، و n = 9 (6 هرتز) (الطالب ر -test). (E) الممثل تسجيل فلوري من الكالسيوم قبل 2+ العابرين وبعد إدارة الكافيين في 5 مم (السهم) في الخلايا تخضع لنظام 6 هرتز. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يخطو الكهربائية يحسن خصائص الكهربية والتلقائية. Electrophysiolog وسجلت خصائص كال في العضلية واحدة معزولة عن biowires أو الهيئات مضغي (EBS) مع المشبك التصحيح. (A) قناة- herg ذيل الكثافة الحالية. الكثافة الحالية (B) I K1 قياسها -100 بالسيارات. (C) Upregulation من البوتاسيوم تصحيح باطنه قناة الجين (KCNJ2). (D) نسبة الخلايا التي تظهر الضرب العفوي (التلقائية) أو أي الضرب العفوي (لا التلقائية). البيانات في AD تمثل متوسط ± SEM تم تحليل الاختلافات بين المجموعات التجريبية التي كتبها الطالب -test ر، خي مربع اختبار، وANOVA (مقارنات متعددة البشرى، طريقة هولم-Sidak). تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوة بروتوكول # | خطوات حاسمة | ||||
| 2.4 | وضع قضبان الكربون 1-2 سم بعيدا أو في أصغر مسافة ممكنة لتجنب التحفيز ذات الطاقة العالية وموت الخلايا. | ||||
| 2.6 | اختبار الاتصالات بين سلك البلاتين والكربون مرة واحدة يتم الغرفة التحفيز للمرة الأولى. ربط غرفة التحفيز للمشجعا الكهربائية ومن ثم تحديد الجهد المطلوب. وضع الرصاص فولت على كل من قضبان الكربون اثنين. يجب أن يكون الجهد الناتج من غرفة تحفيز الجهد نفسه على قراءة الفولتميتر. أي قراءات غير صحيحة تشير إلى طلاء ممكن من سلك البلاتين مع PDMS أو اتصال خلل آخر في النظام. | ||||
| 3.1 | وتستخدم الخلايا واحد إلى البذور وbiowire. لالتفكك، وincubatioن الوقت مع كولاجيناز أمر بالغ الأهمية وينبغي أن تحدد من قبل عمر الخلايا وبروتوكول التمايز (EBS مقابل الطبقات الوحيدة). في هذا البروتوكول، لذا ينصح باستخدام أي فترة حضانة من 2 ساعة ليوم 21 EBS و 30 دقيقة عن الطبقات الوحيدة. للخلايا من الأعمار الأخرى، في الوقت الهضم كولاجيناز قد تحتاج الأمثل من خلال رصد بقاء الخلية وظيفة مقلص بعد الهضم. | ||||
| 3.3 | التربسين يمكن ان يسبب تلفا للخلايا. وبالتالي، تحديد مدة الحضانة لمدة لا تزيد على 5 دقائق. | ||||
| 3.5 | تجنب إدخال الملوثات من خلال عقد فقط نهاية حقنة لنعلق حقنة لطرف الإبرة. يتم تحديد عدد من يغرق بسبب عدم وجود كتل كبيرة من الخلايا. تقليل إبرة انقطاع لتجنب موت الخلايا. تجنب تشكيل فقاعة. في حالة كتل مرئية بعد انقطاع إبرة، وإطالة فترة حضانة في كولاجيناز في العزلة اللاحقة بدلا من زيادةفترة حضانة في التربسين أو عدد يغرق. | ||||
| 3.6 | إزالة طاف مسبق تماما لإضافة هلام. متوسطة المتبقية قد يخفف من نسبة الخلايا: جل ويؤثر جل البلمرة. | ||||
| 3.7 | الحفاظ على تركيزات المكونات هلام الكولاجين عند تحجيم أعلى أو لأسفل. نضع في اعتبارنا أن تركيزات الأسهم قد تختلف وفقا لدفعة أو إعداد الكواشف. | ||||
| 3.11 | للتأكد من أن PDMS microwells البقاء في الجزء السفلي من طبق بيتري، تأكد من أن طبق بيتري جافة واستخدام زوج من ملقط معقم لدفع PDMS microwells أسفل. | ||||
| 4.2 | التأكد من أن جميع biowires في مكانها الصحيح. تغطية biowires تماما مع المتوسطة في غرفة التحفيز الكهربائي. ترتيب كل biowires عمودي على قضبان الكربون. | ||||
| 4.3 | <الدفتيريا كولسبان = "5"> تجنب أي ضرر للسلك البلاتين عن طريق تغطية الغطاء بلطف. استخدام الشريط لتأمين الغطاء بشكل صحيح على لوحة في حالة غطاء لا تغلق بشكل كامل. عند إغلاق الأبواب حاضنة، ضع الجزء أرق من الأسلاك من التحفيز والتشجيع والكهربائية في نقاط إغلاق الباب لضمان ختم الصحيح للحاضنة.|||||
| 4.4 | افصل مشجعا الكهربائية للتغييرات المتوسطة. استخدام P1000 لإزالة فقط الجزء العلوي من المتوسط القديم ثم قم بإضافة متوسطة جديدة. تأكد من أن biowires وغرقت دائما تحت المتوسط. | ||||
الجدول 1: الخطوات الحاسمة في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المخطوطة إعداد وتنفيذ المهندسة منصة، biowire، لتحسين نضوج hPSC-مضادة. يمكن جعل الجهاز في مرافق التصنيع الدقيق القياسية، ويمكن أن تنتج biowires مع تقنيات زراعة الخلايا المشتركة ومشجعا الكهربائية.
على حد علمنا، لا توجد طريقة وذكرت مماثلة لbiowires. تكشف هذه الاستراتيجية أن تحسين خصائص النضج كانت تعتمد على نظام التحفيز الكهربائي، كما يدل على ذلك مستوى أكبر النضج التي تم الحصول عليها في biowires تعرض لارتفاع معدل تحفيز نظام منحدر المتابعة (6 هرتز مقابل 3 هرتز). أظهرت العضلية في biowires أقل تلقائية وارتفاع التيارات قناة- herg وأنا K1 مقارنة EBS المزروعة لمدة 20 يوما (EBd20) أو 40-44 يوما (EBd44). تمثل EBd20 العضلية خصائص الخلية قبل إدماجها في biowires، في حين كانت العضلية EBd44 مثقف 10 يوما لonger من الوقت ثقافة biowire ويظهر أنه حتى مع قتا أطول في الثقافة في شكل EB، يمكن العضلية لا تصل إلى خصائص النضج ما يعادلها مثل تلك الناجمة عن التحفيز الكهربائي في biowires. ومع ذلك، فإن العضلية التي تم الحصول عليها عن طريق biowires لا تزال غير ناضجة كما العضلية الكبار.
وقد اقترح التحفيز الميكانيكي لتكون فعالة في تحريض البروتينات الهيكلية للhPSC-مضادة. ومع ذلك، فإن التحفيز الميكانيكي لا تؤدي إلى نضوج الكهربية 12. هذا قد يوحي الحاجة إلى الجمع بين التحفيز الكهربائي وإجهاد ميكانيكي، بالتتابع أو بالتزامن، للحث على التمايز النهائي في العضلية المستمدة hPSC. الجمع بين التحفيز الكهربائي مع الطرق الأخرى، بما في ذلك تسليم البيوكيميائية عوامل 17 و محاذاة الخلايا في الأنسجة 3D 18، قد تكون قادرة على تحقيق إستراتيجيات أكثر فعالية مؤيدة للنضوجغراي للمستقبل في الدراسات المجراة .
أبعاد الجهاز بيوير المستخدمة هنا هي 5 مم × 1 مم × 0.3 مم (طول × العرض × الارتفاع)، ولكن من الممكن تعديل الجهاز لجعل أسلاك أطول. ومع ذلك، فإن ارتفاع الأسلاك الحيوية يقتصر على 0.3 ملم (مع دائرة نصف قطرها ~ 300 ميكرون على ضغط هلام)، نظرا للقيود في تسليم الأوكسجين في الأنسجة الكبيرة. للتغلب على هذا الحد من توليد الأنسجة سمكا، وطريقة نضح سيكون مطلوبا 19 . ومع ذلك، فمن المستحسن للحفاظ على نسبة 0.5 × 10 6 خلايا / 0.5 سم من الأسلاك في الطول. أما بالنسبة إلى الأسلاك الحيوية الطويلة، فقد تستغرق عملية بلمرة جل الكولاجين وقتا أطول، وقد تكون هناك حاجة إلى تغييرات متوسطة أكثر تكرارا بسبب زيادة عدد الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد الحالي من الأسلاك الحيوية باستخدام خياطة الحرير لا تسمح لقياس قوة انكماش الناتجة عن العضلية المصنفة. ومع ذلك، فإن استخدام خياطة قابلة للتحلل قد ماكالبريد هذا ممكنا في المستقبل.
نوع من الخلايا التي استخدمت لصنع biowire الموصوفة هنا هو HESC-CM باستخدام خط الخلية Hes2 20. ويمكن للبروتوكول أيضا استخدام خطوط الخلايا hiPSC (على سبيل المثال، CDI-MRB وHR-I-2Cr-2R) 14. القدرة cardiomyogenic من مختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية يمكن أن تكون مختلفة، ومدى ملاءمتها لهذا النظام الأساسي يجب أن تحدد تجريبيا والظروف الأمثل حسب الحاجة. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول (انظر الجدول 1).
بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم biowires لتناسب في لوحة 6 جيدا، والمثال أظهرت هنا صنع biowire واحد. ومع ذلك، فمن الممكن للثقافة وتحفيز كهربائيا biowires متعددة في وقت واحد في بئر واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة في والمساعدات من القلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا (G-14-0006265) والمنح التشغيل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (137352 و 143066)، ومنحة مؤسسة جب بيكيل (1013821 ) إلى SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
