Summary
La plate - forme BIOWIRE cardiaque est un procédé in vitro utilisé pour arriver à maturité embryonnaire humain et induit des cardiomyocytes dérivés de cellules-souches pluripotentes (HPSC-CM) en combinant la culture de cellules en trois dimensions avec une stimulation électrique. Ce manuscrit présente la configuration détaillée de la plate-forme BIOWIRE cardiaque.
Abstract
Les cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) ont été une source cellulaire prometteuse et ont donc encouragé la recherche de leurs applications potentielles dans la recherche cardiaque, y compris la découverte de médicaments, la modélisation de la maladie, l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. Cependant, les cellules produites par des protocoles existants présentent une gamme d'immaturité par rapport aux cardiomyocytes ventriculaires adultes adultes. De nombreux efforts ont été faits pour maturité des HPSC-CM, avec une maturation modérée atteinte jusqu'ici. Par conséquent, un système d'ingénierie, appelé biowire, a été conçu en fournissant des indices physiques et électriques pour conduire les CMH-CM à un état plus mature in vitro . Le système utilise une plate-forme microfabricée pour semer les hPSC-CM dans le gel de collagène de type I le long d'une suture de modèle rigide pour assembler en tissu cardiaque aligné (biowire), qui est soumis à une stimulation de champ électrique avec une fréquence progressivement croissante. Par rapport aux contrôles non stimulés,stimulées biowired cardiomyocytes présentent un degré accru de maturation structurelle et électrophysiologiques. Ces changements dépendent du taux de stimulation. Ce manuscrit décrit en détail la conception et la création de biowires.
Introduction
la thérapie à base de cellules est l'une des stratégies les plus prometteuses et une enquête pour parvenir à la réparation / régénération cardiaque. Il a été aidé par l' ingénierie tissulaire cardiaque et la co-livraison de 1, 2 biomatériaux. La plupart des sources cellulaires disponibles ont été étudiés dans des modèles animaux pour leurs effets potentiellement bénéfiques sur endommagés, malades ou âgés de 3 coeurs. En particulier, des efforts importants ont été faits pour utiliser les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) cardiomyocytes (HPSC dérivée de-CM), une source de cellules autologues potentiellement illimitée pour l'ingénierie tissulaire cardiaque. HPSC-CMS peut être produite en utilisant plusieurs protocoles établis 4, 5, 6. Cependant, les cellules obtenues présentent des phénotypes de type foetaux, avec une gamme de caractéristiques immatures par rapport à des cardiomyocytes ventriculaires adultes 7, 8. Cela peut être un obstacle à l'application de HPSC- en tant que modèles de CMs tissu cardiaque adulte dans la recherche de la découverte de médicaments et dans le développement de modèles de maladies cardiaques adultes 9.
Afin de surmonter cette limitation de l'immaturité phénotypiques, de nouvelles approches ont été étudiées activement pour favoriser la maturation des cardiomyocytes. Les premières études ont révélé des propriétés efficaces pro-maturation dans les cardiomyocytes de rats nouveau - nés par mécanique cyclique 10 ou la stimulation électrique 11. Le compactage du gel et de la stimulation mécanique cyclique ont été montrés également à améliorer certains aspects de la maturation HPSC-CM 12, 13, avec la mise en valeur minimale des propriétés de manipulation et de calcium électrophysiologiques. Par conséquent, un système de plate-forme appelée « fil biologique » (de BIOWIRE) a été conçu en fournissant les deux signaux de structure et champ électrique stimulationn pour améliorer la maturation des HPSC-CM 14. Ce système utilise une plate-forme microfabriqué pour créer un tissu cardiaque alignés qui se prête à une stimulation de champ électrique. Cela peut être utilisé pour améliorer la maturité structurelle et électrophysiologique de HPSC-Cms. Nous décrivons ici les détails de fabrication de ces biowires.
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Protocol
1. Maître Conception et fabrication
REMARQUE: Utilisez la lithographie douce pour la fabrication de l'appareil. Faire un SU-8 à deux couches maître pour le moulage de polydiméthylsiloxane (PDMS).
- Concevoir l'appareil à l' aide d' un logiciel de conception et de rédaction (figure 1A, gauche). Dessiner chaque couche du maître séparément. Imprimer la conception du dispositif sur deux photomasques à 20.000 dpi, correspondant aux deux couches du maître 15. Régler le motif de dispositif en tant que transparent et la région environnante aussi sombre; les masques servira de matrice pour transférer optiquement le motif de dispositif sur SU-8 par lithographie (comme décrit par d' autres 15).
- Répartir environ 4 mL de SU-8 50 sur le centre d'une plaquette de silicium de 4 pouces. Enduire la uniformément SU-8 50 sur la tranche en utilisant une tournette par centrifugation à 2.000 tours par minute (RPM) pendant 30 s. Faire cuire au four la pastille sur une plaque chauffante à 95 ° C pendant 10 min. Exposer la plaquette aux rayons ultraviolets (UV) lilutte à 200 mJ / cm 2.
- Verser environ 4 mL de SU-8 2050 sur le centre de la tranche et la rotation à 2500 tours par minute pendant 30 s. Faire cuire au four sur la plaque chauffante 95 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir à température ambiante (RT).
- Répétez l'étape 1.3 deux fois de plus.
- Couvrir la plaquette revêtue de la première couche de transparence photomasque. Exposer la tranche à de la lumière UV à 270 mJ / cm 2 pour faire la première couche. Faire cuire au four sur la plaque chauffante 95 ° C pendant 15 min.
- Faire de la seconde couche de SU-8 2050 en répétant l'étape 1.3 à deux reprises.
- Aligner le masque de deuxième couche pour les caractéristiques sur la première couche en utilisant un aligneur de masque. Ensuite, exposer à la lumière UV à 240 mJ / cm2. Faire cuire au four à 95 ° C pendant 15 min.
NOTE: Le temps d'exposition est déterminé par la dose d'UV totale requise et l'intensité de sortie de lumière UV mesuré le jour avant l'utilisation. - Développer la plaquette en la plongeant dans de l'acétate de propylène glycol monométhyl éther (PGMEA) et agitation à 200 tours par minute pendant 30 min sur un agitateur orbital.
- Endroitle maître dans une boîte de Petri et soigneusement verser le mélange PDMS (base d'agent de reticulation à un rapport de 10: 1 en poids) sur le centre de la plaquette. Couvrir toutes les caractéristiques et éviter les bulles d'air.
- La chaleur dans un four à 70 ° C pendant 2 h. Utiliser une lame tranchante pour découper le pourtour du modèle de BIOWIRE PDMS (Figure 1A, à droite). Peler les PDMS du maître. Couper le dispositif avec la lame. Placez le modèle de BIOWIRE PDMS dans un sachet de stérilisation et autoclave à vapeur à 121 ° C pendant 20 min.
- Dans une enceinte de sécurité biologique (BSC), placez le PDMS BIOWIRE modèle dans une boîte de Petri. Utiliser des pinces pour tenir et fixer un morceau de fil de suture en soie chirurgicale stérile (6-0) dans le centre du canal de la cupule PDMS par celui - ci des sièges dans les rainures au niveau des deux extrémités du canal (figure 1B-I).
2. Création de la Chambre de stimulation électrique
- Faire une paire de pièces de polycarbonate rectangulaire (longueur x largeur x épaisseur: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) et les utiliser en tant que trame de la chambre de stimulation électrique (figure 2).
- Percer deux trous de 3 mm de largeur 2 cm de distance le long de la ligne centrale de chaque pièce de cadre en polycarbonate.
- Coupez deux morceaux de tiges de carbone longue de 1,5 cm. Percer un trou de 1 mm de largeur à travers la tige de carbone d'environ 3 mm de l'extrémité. Enfiler un fil de platine à travers le trou de la tige de carbone et serrer le fil en l'enroulant autour de la tige de carbone. Attacher une pince à l'autre extrémité du fil de platine pour une connexion ultérieure avec le stimulateur électrique.
- Insérer les tiges de carbone dans les parties de cadre de polycarbonate. Placer le cadre assemblé avec des tiges de carbone dans un puits d'une plaque à six puits.
- Verser 2 ml de PDMS dans le puits. Immerger le bas des cadres de polycarbonate dans PDMS tout en maintenant le niveau de la surface PDMS proche mais pas d'atteindre le fond des tiges de carbone. La chaleur dans un four à 70 ° C pendant 2 h.
- Prenez la chambre de stimulation électrique des six-Bien plaque et le mettre dans une poche de stérilisation pour la stérilisation à la vapeur à 121 ° C pendant 20 min.
3. Dissociation des HPSC-Enzymatic CMs
- Provoquer HPSC de se différencier en cardiomyocytes à l' aide d' un protocole établi 4.
NOTE: En bref, générer des cardiomyocytes via des protocoles corps embryoïdes (EB) établi dans la tige support pro travers la supplémentation séquentielle avec la protéine morphogénétique osseuse 4, le facteur de croissance des fibroblastes basique, l' activine A, le facteur de croissance endothélial vasculaire, et Dickkopf homolog 1 4. Utilisez du jour 20-34 EBs de différenciation pour faire biowires. - Recueillir les EBs de la plaque de fixation basse avec une pointe de pipette de P1,000 et transférer dans un tube conique. Pellet par centrifugation pendant 5 minutes à 125 xg et RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot avec pré-chauffé à 37 ° C collagénase de type I contenant 1% de désoxyribonucléase I (DNase I). Incuber à 37 ° C pendant 2 hpour la digestion.
- Ajouter 5 mL de pré-chauffé à 37 ° C milieu de lavage et centrifugation pendant 5 minutes à 125 xg et RT. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot avec une solution de 2 ml d'acide trypsine / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 1 ml de milieu d'arrêt contenant 3% (v / v) DNase I.
- Fixer une aiguille 20 G (0,9 mm) à une seringue de 5 mL et passer la suspension à travers elle EB 3-5 fois.
- Ajouter 7 ml de milieu de lavage et centrifugation à 280 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot dans un milieu (IMDM) de Dulbecco modifié par Iscove et stocker sur la glace. Déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Prendre 0,5 x 10 6 cellules et culot par centrifugation à 280 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant.
- Pré-refroidir tous les composants du gel sur la glace avant de les mélanger dans un tube stérile. Mélanger les composants du gel de collagène suivants (concentration finale): 2,1 mg / ml de collagène de type de queue de rat I, 24,9 mM de glucose, 23,8 mM de NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM de HEPES et 10% de la matrice extracellulaire dans du milieu M199 1x. Ajouter la matrice extracellulaire de collagène et dernier. Mélanger par pipetage de haut en bas.
- Remettre en suspension 0,5 x 10 6 cellules avec 3,5 pL de gel de collagène et bien mélanger.
- Utiliser un embout de pipette P10 pour ajouter 4 pi de la suspension cellulaire dans 0,5 cm de long canal (figure 1B-II). Ajustez la position de la suture avec une pince stérile si nécessaire.
- Couvrir le fond de la boîte de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, en prenant soin de ne pas toucher le gel. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Remplacer le PBS avec 12 mL de milieu de culture (par exemple, la tige pro ou un milieu recommandé par le fabricant de la cellule), suffisamment pour recouvrir les cellules (figure 1B-III). La culture dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 semaine. Changer le support tous les jours.
4. La stimulation électrique pour BIOWIRE Culture
- Dansle BSC, ajouter 2 ml de PBS à chaque puits d'une plaque à six puits qui hébergera une chambre de stimulateur électrique. Utiliser des pinces stériles pour placer délicatement le dispositif de stimulation électrique à l'autoclave dans le puits. Jeter le PBS du puits.
- Couvrir les tiges de carbone avec 5 ml de milieu de culture préchauffé. Utiliser des pinces stériles pour monter les biowires dans la chambre de stimulation électrique et les orienter perpendiculairement aux tiges de carbone (figure 2).
- Placer le couvercle sur le dessus de la plaque à six puits, mais laisser des fils de platine suffisantes atteignant l'extérieur de la plaque pour se connecter avec le stimulateur électrique. Placer la plaque à six puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et connecter le fil de platine au stimulateur électrique.
- Stimuler les biowires en utilisant un stimulateur électrique avec le réglage suivant: impulsion biphasique répéter, 1 ms durée d'impulsion, 3 V / cm, et une impulsion par seconde (PPS). Soulever le PPS toutes les 24 h pour les valeurs suivantes: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 et 6. Changer le support tous les jours.
- Observer la contractilité des cardiomyocytes en réponse à une stimulation électrique sous un microscope à un grossissement de 10X.
NOTE: Après une semaine de stimulation, les biowires devient mature (voir la section des résultats).
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Representative Results
La raison pour l'utilisation d'un fil de suture dans les biowires est de servir de matrice pour la formation de constructions en 3D qui correspondent à un axe et imitent la forme de fibres cardiaques. Nous montrons que , après sept jours de culture dans le BIOWIRE, les cellules remodelés le gel autour de la suture (figure 3A). Les cellules assemblées le long de l'axe de la suture pour former un tissu cardiaque alignés (figure 3). Après 7 jours de préculture, les biowires ont été soumis à 7 jours de stimulation par un champ électrique et d'autres propriétés exposées compatibles avec la maturation structurelle et fonctionnelle des cardiomyocytes.
Human PSC-CMS en biowires présentaient une forte expression de protéines contractiles cardiaques, sarcomère α-actinine, et de l' actine (figure 4A). Nous avons observé des bandes sarcomère de l'appareil contractile HPSC-CM et l'alignement des sténoses myofibrilarLe long de l'axe de la suture. Ceci est qualitativement similaire à la structure du coeur adulte ( Figure 4A ). Deuxièmement, par rapport à ceux des EB, ces CMH-CM biologiques ont affiché des taux de prolifération plus faibles ( figure 4B ). Troisièmement, les hESC-CM biologiques ont présenté des propriétés améliorées de manipulation du calcium ( Figure 5 ) et la maturation de l'électrophysiologie des cardiomyocytes ( Figure 6 ). Dans les cardiomyocytes matures, le traitement par la caféine induit une libération abrupte de Ca 2+ du réticulum sarcoplasmique 8 . De tels transitoires de Ca 2+ ont été trouvés dans des hESC-CM inhibés électriquement, mais pas dans les cellules à partir de témoins non stimulés ( Figure 5A-C ). La réponse à la caféine dans les cellules stimulées électriquement, par rapport aux témoins non stimulés, a révélé une amplitude d'intensité significativement plus élevée d'une manière dépendante de la fréquence de stimulation ( Figure 5D et E ). Pendant ce temps, hPSC-CMsdans biowires hERG ont montré une amélioration des densités de courant et vers l' intérieur le courant de redresseur (I k1), qui a été renforcée par une stimulation électrique (figure 6A et B). De telles améliorations dans le courant I k1 sont conformes à une induction de l'expression de la protéine du gène de canal potassique à rectification entrante (KCNJ2) dans les biowires (Figure 6C).
Un autre paramètre important en ce qui concerne la maturation est la capacité des cardiomyocytes à battre spontanément, également connu sous le automaticité, ce qui est un signe d'immaturité dans les cardiomyocytes de travail (auriculaire et ventriculaire) 16. Automaticité était significativement plus élevée dans les cardiomyocytes dérivés EB par rapport à biowires de commande (figure 6d), ce qui était comparable à celle de biowires soumis au traitement de 6 Hz.
Prendren ensemble, ces résultats indiquent que la culture en BIOWIRE avec la stimulation électrique a favorisé la maturation structurelle et électrophysiologique des HPSC-CM 14.
Figure 1: Culture BIOWIRE Plate - forme. (A) Schéma ( à gauche) et réel ( à droite) de moule PDMS BIOWIRE. Barre d'échelle = 2 mm. (B) Pour configurer le BIOWIRE, un fil de suture a été monté en position centrale dans le canal (I). Une suspension hESC-CM dans un gel de collagène de type I a été ensemencée autour de la suture dans le canal (II) et on incube dans un milieu (III). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2:BIOWIRE a été cultivée dans la Chambre de stimulation électrique au cours de la deuxième semaine de la culture. Le BIOWIRE a été placée perpendiculairement aux électrodes de carbone. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Le remodelage cellulaire et Gel contractants autour de la suture après sept jours de préculture en BIOWIRE. (A) des images de fond clair hESC-CMs les jours indiqués de préculture dans le modèle de BIOWIRE. Barre d'échelle = 200 um. (B) Quantification de compactage du gel les jours indiqués de culture (moyenne ± écart type). (C) hématoxyline et l' éosine (H & E) et le trichrome de Masson (MT) coloration de sections de BIOWIRE (les doubles flèches représentent l'axe de fil de suture). ba écheller = 100 um. Ce chiffre a été modifié de la référence 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Physiologie de cardiomyocytes Cultivé dans la plate - forme BIOWIRE. (A) représentatifs des images confocales de (témoin) non stimulé et biowires stimulé électriquement (3 Hz et 6 des schémas Hz) montrant l' alignement des cardiomyocytes et fréquents disques Z (les doubles flèches représentent l'axe de fil de suture). Vert, α-actinine; rouge, actine. Barre d'échelle = 20 pm. (B) la prolifération des cardiomyocytes dans les biowires était plus faible que dans les ballasts électroniques. La prolifération a été évaluée par une double coloration de α-actinine sarcomère et Ki67 (n = 3-4 par condition, ± moyenne; Dakota du Sud). *, **, # et et représentent des différences statistiquement significatives par rapport à EBd34 ( ' t -test de l' étudiant). Ce chiffre a été modifié de la référence 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: stimulation électrique Amélioration de Ca 2+ Promu propriétés de manipulation. (AC) des traces représentatives de la libération de Ca2 + en réponse à la caféine dans les cellules témoins non stimulées (A) et les cellules soumises au traitement de 3 Hz (B) et le schéma 6 Hz (C). (D) de changement de caféine induite par l' intensité de fluorescence de pic entre les groupes expérimentaux (moyenne ± SEM après la normalisation de la fluorescence de pic intensity avant l'administration de la caféine; contrôle par rapport à 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; contrôle contre 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz par rapport à 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (témoin), n = 6 (3 Hz), et n = 9 (6 Hz) (t - Test de Student). (E) l' enregistrement fluorescent représentatif de Ca 2 + transitoires avant et après l'administration de caféine à 5 mM (flèche) dans des cellules soumises au régime 6 Hz. Ce chiffre a été modifié de la référence 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Pacing électrique améliore les propriétés électrophysiologiques et automaticité. ElectrophysiologLes propriétés histologiques chez les cardiomyocytes isolés isolés à partir de biowires ou de corps embryoïdes (EB) ont été enregistrées avec une pince à patch. ( A ) densité de courant de queue hERG. ( B ) I K1 densité de courant mesurée à -100 mV. ( C ) Régulation ascendante du gène de canal de rectification interne du potassium ( KCNJ2 ). ( D ) Ratio des cellules affichant un battement spontané (automaticité) ou pas de battement spontané (sans automatisme). Les données en AD représentent la moyenne ± SEM Les différences entre les groupes expérimentaux ont été analysées par le test t de Student, le test chi-carré et l'ANOVA (comparaisons par paires, méthode Holm-Sidak). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 14 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Protocole étape | étapes critiques | ||||
| 2.4 | Placer les tiges de carbone 1 - 2 cm de distance ou à la plus petite distance possible pour éviter la stimulation à haute énergie et la mort cellulaire. | ||||
| 2.6 | Tester les connexions entre le fil de platine et le carbone une fois que la chambre de stimulation est faite pour la première fois. Relier la chambre de stimulation pour le stimulateur électrique et ensuite définir une tension souhaitée. Placer un conducteur de volt sur chacune des deux tiges de carbone. La tension de sortie de la chambre de stimulation doit être la même tension de lecture sur le voltmètre. Toutes les lectures incorrectes indiquent le revêtement possible du fil de platine avec PDMS ou d'une autre connexion défectueuse dans le système. | ||||
| 3.1 | Les cellules individuelles ont été utilisés pour semer la BIOWIRE. Pour la dissociation, la incubatioN temps avec la collagénase est critique et devrait être déterminé par l'âge des cellules et le protocole de différenciation (EBs versus monocouches). Dans ce protocole, un temps d'incubation de 2 h est recommandé pour le jour 21 EB et 30 min pour les monocouches. Pour les cellules d'autres âges, le temps de digestion de la collagénase pourrait nécessiter une optimisation en surveillant la viabilité cellulaire et la fonction contractile post-digestion. | ||||
| 3.3 | La trypsine peut endommager les cellules; Limitent ainsi la durée d'incubation à plus de 5 min. | ||||
| 3.5 | Évitez d'introduire des contaminants en maintenant uniquement la fin de la seringue pour attacher la seringue à la pointe de l'aiguille. Le nombre de plombs est déterminé par l'absence de grands groupes de cellules. Minimiser la perturbation de l'aiguille pour éviter la mort cellulaire. Éviter la formation de bulles. En cas de touffes visibles après la rupture de l'aiguille, prolonger le temps d'incubation dans la collagénase dans les isolats suivants au lieu d'augmenterTemps d'incubation dans la trypsine ou le nombre de plombs. | ||||
| 3.6 | Retirez complètement le surnageant avant l'addition de gel. Le milieu résiduel peut diluer le rapport de la cellule: le gel et la polymérisation du gel affectant. | ||||
| 3.7 | Maintenir les concentrations des composants du gel de collagène lors de la mise à l'échelle ou vers le bas. Gardez à l'esprit que les concentrations de stock peuvent varier en fonction du lot ou de la préparation des réactifs. | ||||
| 3.11 | Pour s'assurer que les micropuits PDMS restent au fond de la boîte de Petri, assurez-vous que la boîte de Petri est sèche et que vous utilisez une pince stérile pour pousser les micropuits PDMS vers le bas. | ||||
| 4.2 | Assurez-vous que tous les biowires sont en place. Couvrir complètement les biowires avec du milieu dans la chambre de stimulation électrique. Disposer tous les biowires perpendiculaires aux tiges de carbone. | ||||
| 4.3 | <td colspan = « 5 »> éviter d'endommager le fil de platine, en recouvrant le couvercle doucement. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le couvercle correctement sur la plaque dans le cas où le couvercle ne ferme pas complètement. Lors de la fermeture des portes de l'incubateur, placer la portion plus mince des fils du stimulateur électrique au niveau des points de fermeture de la porte pour assurer une bonne étanchéité de l'incubateur.|||||
| 4.4 | Débranchez le stimulateur électrique pour les changements de taille. Utilisez un P1000 pour enlever seulement la partie supérieure de l'ancien milieu, puis ajouter du milieu frais. Assurez-vous que les biowires sont toujours submergées sous moyenne. | ||||
Tableau 1: étapes critiques dans le Protocole.
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Discussion
Ce manuscrit décrit l'installation et la mise en œuvre de la plate-forme d'ingénierie, biowire, pour améliorer la maturation des CMH-CM. Le dispositif peut être fabriqué dans des installations de microfabrication standard, et les biowires peuvent être produits avec des techniques communes de culture cellulaire et un stimulateur électrique.
À notre connaissance, il n'y a pas de méthode rapportée semblable à celle de Biowires. Cette stratégie révèle que les propriétés de maturation améliorées dépendent du schéma de stimulation électrique, comme en témoigne le niveau de maturation plus élevé obtenu dans les biowires soumis au régime de progression de la stimulation (6 Hz versus 3 Hz). Les cardiomyocytes chez les biowires ont démontré moins d'automaticité et plus de courants hERG et I K1 par rapport aux EB cultivés pendant 20 jours (EBd20) ou pendant 40-44 jours (EBd44). Les cardiomyocytes EBd20 représentaient les propriétés cellulaires avant leur incorporation dans les biowires, tandis que les cardiomyocytes EBd44 ont été cultivés 10 jours longer que le temps de culture BIOWIRE et montre que même avec le temps plus dans la culture au format EB, cardiomyocytes ne pouvaient pas atteindre les propriétés de maturation équivalentes à celles induites par la stimulation électrique biowires. Cependant, les cardiomyocytes obtenus par biowires ne sont toujours pas aussi mature que les cardiomyocytes adultes.
La stimulation mécanique a été suggéré pour être efficace dans l'induction de protéines structurales du HPSC-Cms. Cependant, la stimulation mécanique n'a pas conduit à la maturation électrophysiologique 12. Cela pourrait suggérer la nécessité de combiner la stimulation électrique et le stress mécanique, successivement ou simultanément, pour induire la différenciation terminale dans les cardiomyocytes dérivés HPSC. La combinaison de la stimulation électrique avec d' autres méthodes, y compris la fourniture de facteurs biochimiques 17 et l' alignement des cellules dans les tissus 3D 18, susceptible d' être en mesure de réaliser une strate pro-maturation plus efficacegy pour l' avenir des études in vivo.
Les dimensions du dispositif de BIOWIRE utilisés ici sont 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (longueur x largeur x hauteur), mais il est possible de modifier le dispositif pour rendre plus longs biowires. Cependant, la hauteur des biowires est limitée à 0,3 mm (avec un rayon d'environ 300 pm sur le compactage du gel), compte tenu des limitations de l'apport d'oxygène dans les tissus plus grandes. Pour remédier à cette limitation de générer des tissus plus épais, une méthode de perfusion serait nécessaire 19. Néanmoins, il est recommandé de maintenir le rapport de 0,5 x 10 6 cellules / 0,5 cm de fil de longueur. Pour biowires plus, la polymérisation en gel de collagène peut prendre plus de temps, et les changements de taille plus fréquents peuvent être nécessaires en raison du nombre accru de cellules. De plus, la configuration actuelle de l'BIOWIRE en utilisant une suture de soie ne permet pas la mesure de la force de contraction produite par les cardiomyocytes graines. Cependant, l'utilisation d'une suture biodégradable peut make ce possible à l'avenir.
Le type de cellule utilisé pour fabriquer le BIOWIRE décrit ici est CSEh-CM en utilisant la lignée cellulaire hES2 20. Le protocole peut également utiliser des lignées cellulaires hiPSC (par exemple, CDI-MRB et HR-I-2Cr-2R) 14. La capacité cardiomyogénique des différentes lignées de cellules souches humaines pourrait être différente, et l'aptitude à cette plate-forme doit être déterminée expérimentalement et les conditions optimisées selon les besoins. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole (voir le tableau 1).
De plus, les biowires ont été conçus pour tenir dans une plaque de 6 puits, et l'exemple ici ont montré la fabrication d'un BIOWIRE. Cependant, il est possible de la culture et de stimuler électriquement plusieurs biowires simultanément dans un puits.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'État du cœur et la Fondation des maladies du Canada (G-14-0006265), les subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé (137352 et 143066), et une subvention de la Fondation JP Bickell (1.013.821 ) à SSN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
