Summary
Сердца biowire платформа является методом в пробирке используется для зрелых человеческих эмбриональных и индуцированных клеток , полученных кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых (HPSC-CM) путем объединения трехмерного культивирования клеток с электрической стимуляцией. Эта рукопись представляет подробную установку сердечной biowire платформы.
Abstract
Человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоциты (HPSC-КМВ) был многообещающим источником клеток и таким образом поощрять исследование их потенциальных применений в сердечной исследований, в том числе открытия новых лекарств, моделирование болезни, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, клетки, полученные существующими протоколами показывают диапазон незрелости по сравнению с носителями взрослых желудочковых кардиомиоцитов. Много усилий было сделано, чтобы созреть HPSC-КМВ, с умеренным созревании достиг до сих пор. Таким образом, разработано система, названная biowire, была разработана путем предоставления как физические и электрических сигналов , чтобы привести HPSC-CMs к более зрелому состоянию в пробирке. Система использует платформу микроизготовленной семени HPSC-CMs в коллагене типа I гелеобразованию вдоль жесткого шаблона шовного материала, чтобы собрать в выровненную ткань сердца (biowire), который подвергается воздействию электрического поля стимуляции с постепенно возрастающей частотой. По сравнению с нестимулированным управлением,стимулировал biowired кардиомиоцитов проявляют повышенную степень структурного и электрофизиологического созревания. Такие изменения зависят от скорости стимуляции. Эта рукопись подробно описывает конструкцию и создание biowires.
Introduction
Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных и исследуемых стратегий для достижения сердца ремонта / восстановления. Это было облегчено инженерии сердечной ткани и совместной доставки биоматериалов 1, 2. Большинство доступных источников клеток, были изучены на животных моделях для их потенциально благотворное воздействие на поврежденные, больные, или престарелыми сердца 3. В частности, значительные усилия были предприняты, чтобы использовать человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSC) -derived кардиомиоцитов (HPSC-CM), потенциально неограниченный источник аутологичных клеток для инженерии сердечной ткани. HPSC-МС может быть получен с использованием нескольких установленных протоколов 4, 5, 6. Однако полученные клетки обладают эмбриональными-подобными фенотипами, с диапазоном незрелых характеристик по сравнению со взрослыми желудочковых кардиомиоцитов 7, 8. Это может быть препятствием для применения HPSC-CMs в качестве моделей взрослой ткани сердца в исследовании обнаружения наркотиков и в развитии взрослых сердечных моделей заболеваний 9.
Для того, чтобы преодолеть это ограничение фенотипической незрелости, новые подходы активно исследуются в целях содействия кардиомиоцитов созреванию. Ранние исследования показали , эффективные свойства про-созревания в неонатальных кардиомиоцитов крыс с помощью циклического механического 10 или электрической стимуляции 11. Гель для уплотнения и циклическое механическое раздражение также показали , чтобы улучшить некоторые аспекты HPSC-CM созревания 12, 13, с минимальным усилением электрофизиологических и кальцием свойств обработки. Таким образом, система платформы называется «биологическая провод» (biowire) была разработана путем предоставления как структурных сигналов и электрическое поле stimulatioп для повышения созревания HPSC-МС 14. Эта система использует микроизготовленную платформу для создания выровненной сердечной ткани, которая поддается электрической стимуляция поля. Это может быть использовано для улучшения структурных и электрофизиологические зрелостей HPSC-CMs. Здесь мы описываем деталь изготовления такого biowires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мастер Дизайн и изготовление
Примечание: Используйте мягкую литографию для изготовления устройства. Сделать двухслойные мастер в SU-8 для полидиметилсилоксана (PDMS) под давление.
- Конструкция устройства с помощью проектирования и черчения программного обеспечения (рисунок 1A, слева). Draw каждый слой мастера отдельно. Печать дизайн устройства на двух фотошаблонов на 20000 точек на дюйм, что соответствует двум сло мастера 15. Установка модели устройства в качестве прозрачного и его окрестностей как темная; маски будут служить в качестве матрицы для оптического переноса шаблона устройства на SU-8 с помощью литографии (как описано других 15).
- Разливают около 4 мл SU-8 50 на центр 4 дюйма кремниевой пластины с. Покрыть СУ-8 50 равномерно на подложке с использованием спиной для нанесения покрытий центрифугирования при 2000 оборотах в минуту (RPM) в течение 30 сек. Выпекать пластины на 95 ° C плитке в течение 10 мин. Защита пластины к ультрафиолетовому (УФ) LiGHT при 200 мДж / см 2.
- Налейте около 4 мл SU-8 2050 на центр пластины и спина при 2500 оборотов в минуту в течение 30 с. Испеките на 95 ° C плитке в течение 15 мин. Охлаждают до комнатной температуры (RT).
- Повторите шаг 1,3 еще два раза.
- Накройте пластину, покрытую с первым слоем прозрачности фотошаблоном. Защиту пластины к УФ - светом при 270 мДж / см 2 , чтобы сделать первый слой. Испеките на 95 ° C плитке в течение 15 мин.
- Сделать второй слой SU-8 2050, повторяя шаг 1,3 раза.
- Выравнивание маски второго слоя к функциям на первый слой с использованием маской выравнивателя. Затем, подвергать воздействию УФ-света при 240 мДж / см2. Выпекать при температуре 95 ° С в течение 15 мин.
Примечание: Время экспозиции определяется требуемой суммарной дозы ультрафиолета и выходной интенсивности УФ-света, измеренной в день перед использованием. - Разработка пластины путем погружения его в пропиленгликоля ацетат монометилового эфира (PGMEA) и встряхивании при 200 оборотов в минуту в течение 30 мин на орбитальном шейкере.
- Местомастер в чашку Петри и осторожно влить PDMS смеси (основание, чтобы сшивающий в соотношении 10: 1 по массе) от центра пластины. Накройте все возможности и избежать воздушных пузырей.
- Тепло в печи при 70 ° С в течение 2 ч. Используйте острое лезвие , чтобы отрезать вокруг края шаблона biowire PDMS (рис 1А, справа). Пил PDMS от мастера. Обрежьте устройство с лезвием. Поместите шаблон biowire PDMS в стерилизации мешок и паровой автоклав при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
- В биозащите (BSC), поместите PDMS biowire шаблона в чашку Петри. Используйте пинцет , чтобы удерживать и смонтировать кусок стерильной хирургической шелковой нити (6-0) в центре канала микролунки PDMS путем сидения его в пазах на обоих концах канала (рис 1B-I).
2. Создание электростимуляции палаты
- Сделать пару прямоугольных деталей из поликарбоната (длина х ширина х толщина: 2 см х0,85 см х 0,35 см) и используют их в качестве рамки электрической стимуляции камеры (рисунок 2).
- Пробурить две 3 мм шириной отверстия 2 см друг от друга вдоль центральной линии каждого кадра из поликарбоната кусок.
- Вырезать два куска 1,5 см длиной углеродных стержней. Дрель мм шириной отверстия 1 через угольный стержень около 3 мм от конца. Автор платиновой проволоки через отверстие стержня углерода и затянуть проволоку, окружив его вокруг угольного стержня. Присоединить зажим к другому концу платиновой проволоки для последующего соединения с электрическим стимулятором.
- Вставьте углеродных стержней в поликарбонат рамы штук. Поместите собранный каркас с углеродными стержней в лунку шесть-луночного планшета.
- Налейте 2 мл PDMS в скважину. Погрузите в нижней части поликарбоната кадров в PDMS, сохраняя при этом уровне поверхности PDMS вблизи, но не доходит до нижней части углеродных стержней. Тепло в печи при 70 ° С в течение 2 ч.
- Возьмите электрическую стимуляцию камеры из шести-на пластина и поместить его в сумке стерилизации для стерилизации паром при 121 ° С в течение 20 мин.
3. Ферментативная диссоциация HPSC-CMs
- Индуцируют HPSC дифференцироваться в кардиомиоциты с использованием установленного протокола 4.
Примечание: Если коротко, то генерируют кардиомиоцит через установленный эмбриоидном тела (EB) протоколы в стволовых про среды через последовательный добавок с костными морфогенетическим белком 4, основным фактором роста фибробластов, активин А, фактором роста эндотелия сосудов, и Dickkopf гомологом-4. Использование ЭТ со дня 20-34 дифференциации сделать biowires. - Сбор ЭТ от низкой пластины крепления с P1,000 наконечником пипетки и переносят в коническую пробирку. Гранул путем центрифугирования в течение 5 мин при 125 мкг и РТ. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок с предварительно нагревают, 37 ° C Тип коллагеназы I, содержащего 1% дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I). Инкубируют при 37 ° С в течение 2 чдля пищеварения.
- Добавьте 5 мл подогретого, 37 ° C мыть среду и центрифуги в течение 5 мин при 125 мкг и РТ. Жидкость над осадком сливают. Ресуспендируют осадок с 2 мл раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты трипсин / (ЭДТА) и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
- Добавить 1 мл стоп-среды, содержащей 3% (об / об) ДНКазы I.
- Приложить 20 г (0,9 мм) иглу в 5 мл шприца и передать суспензии EB через него в 3-5 раз.
- Добавить 7 мл промывочного раствора и центрифугируют при 280 х г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают. Ресуспендирует осадок в Исках, модифицированного Дульбекко среды (IMDM) и хранить на льде. Определить количество клеток с помощью гемоцитометра. Взять 0,5 × 10 6 клеток и осадок центрифугированием при 280 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант.
- Предварительное охлаждение всех компоненты геля на льде перед смешиванием их в стерильной пробирке. Смешайте следующие компоненты геля коллагена (конечная концентрация): 2,1 мг / мл крысиного хвоста типа коллагена I, 24,9 мМ глюкозы, 23,8 мМ NaHСО 3, 14,3 мМ NaOH, 10 мМ HEPES и 10% внеклеточный матрикс в 1x среде M199. Добавьте коллагена и межклеточного матрикса последнего. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Ресуспендирует 0,5 × 10 6 клеток с 3,5 мкл коллагеном геля и хорошо перемешать.
- Используйте P10 наконечник пипетки , чтобы добавить 4 мкл клеточной суспензии в 0,5 см длиной канала (рис 1B-II). Отрегулируйте положение шва стерильным пинцетом в случае необходимости.
- Обложка дна чашки Петри стерильным фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), убедившись в том, чтобы не задеть гель. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
- Заменить PBS с 12 мл культуральной среды (например, стволовые про или среда , рекомендованные производителем клеток), достаточно , чтобы покрыть клетки (рис 1B-III). Культура в термостате при 37 ° С в течение 1 недели. Изменение среды каждый день.
4. Электрическая стимуляция для Biowire Выращивание
- ВКБС, добавляют 2 мл PBS в каждую лунку шесть-луночного планшета, который будет размещен электрический стимулятор камеру. Используйте стерильный пинцет, чтобы аккуратно разместить автоклавное устройство электрической стимуляции в скважину. Выбросьте PBS из скважины.
- Покрытие углеродных стержней с 5 мл подогретой культуральной среды. Используйте стерильный пинцет , чтобы смонтировать biowires в электрической стимуляции камере и ориентировать их перпендикулярны углеродные стержни (рисунок 2).
- Поместите крышку на верхней части шесть-луночного планшета, но оставить достаточное количество провода платины идущие вне пластины для соединения с электрическим стимулятором. Поместите шесть-луночный планшет в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 ° C и подключить платиновую проволоку к электрическому стимулятору.
- Стимулируйте biowires с помощью электрического стимулятора со следующей установкой: двухфазный повторения импульсов, длительность импульса 1 мс, 3 В / см, и 1 импульс в секунду (PPS). Повысить ППС каждые 24 ч до следующих значений: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 и 6. Изменение среды каждый день.
- Обратите внимание на сократимость кардиомиоцитов в ответ на электрическую стимуляцию под микроскопом при 10-кратном увеличении.
Примечание: После того, как одна неделя стимуляции biowires становится зрелой (смотрите раздел результатов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рациональное для использования шовного материала в biowires, чтобы служить в качестве шаблона для формирования 3D-конструкций, которые выравнивают на одной оси, и имитируют форму сердечных волокон. Показано , что после семи дней культивирования в biowire, клетка перестроенного гель вокруг шовного (фиг.3А). Клетки , собранные вдоль оси шовного материала для образования выровнена сердечная ткань (рисунок 3). После 7 дней предкультуры, то biowires были подвергнуты 7 дней электрической стимуляции поля и дополнительно экспонируемых свойства, совместимых со структурным и функциональным созреванием кардиомиоцитов.
Человек ККП-МС в biowires показал сильную экспрессию сердечных сократительных белков, саркомер альфа-актинин и актин (фиг.4А). Мы наблюдали саркомера полосатость из сократительного аппарата HPSC-CM и выравнивания myofibrilar стриктурвдоль оси шва. Это качественно подобна структуре у взрослого сердца (рис 4A). Во- вторых, по сравнению с теми ЭТ, эти biowired чЭСК-КМ показаны более низкие нормы пролиферации (рис 4В). В- третьих, biowired чЭСК-КМ выставлены улучшенной обработки свойства кальция (рисунок 5) и кардиомиоциты электрофизиологии созревания (рисунок 6). В зрелых кардиомиоцитов, лечение с кофеином вызывает резкое высвобождение Са 2+ из саркоплазматического ретикулума 8. Такие Са 2+ были найдены в электрический стимулированном чЭСКе-КМ, но не в клетках из нестимулированного управления (Рис 5A-C). Реакция на кофеин в электрически стимулированных клеток, по сравнению с не-стимулированных контроля, показали значительно более высокую амплитуду интенсивности в стимуляции частотно-зависимым образом (рис 5D и Е). В то же время, HPSC-CMsв biowires показали улучшение тока и внутрь выпрямителя тока (I K1) плотности HERG, который еще более усиливается электрической стимуляции (рис 6A и В). Такие улучшения тока k1 I в соответствии с индукцией экспрессии гена канала (KCNJ2) белка калия внутрь выпрямления в biowires (фиг.6С).
Другим важным параметром в отношении созревания является способность кардиомиоцитов бить спонтанно, также известный как автоматизма, который является признаком незрелости в работе кардиомиоцитов (предсердий и желудочков) 16. Автоматичность была значительно выше в EB-производных кардиомиоцит по сравнению с контрольным biowires (рис 6D), который был сравнит с , что в biowires подвергнутого режим 6 Гц.
приниматьп вместе, эти результаты указывают на то, что культура в biowire с электрической стимуляцией способствует структурной и электрофизиологическое созревание HPSC-МС 14.
Рисунок 1: Biowire Культура платформы. (А) Схематическое (слева) и фактическое (справа) ПДМС плесень biowire. Шкала бар = 2 мм. (Б) Для того, чтобы настроить biowire, шовный материал был смонтирован по центру в канале (I). ЧЭСК-CM суспензии в I геля коллагена типа была посеяна вокруг шовного материала в канале (II) и инкубировали в среде (III). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:Biowire культивируют в электростимуляции палате во время второй недели культивирования. Biowire был помещен перпендикулярно к угольным электродам. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сотовый ремоделирования и гель Договаривающиеся вокруг Suture после того, как 7 -й день прекультуры в Biowire. (А) Светлые образа чЭСКа-КМ на указанные дни прекультуры в шаблоне biowire. Шкала бар = 200 мкм. (В) Количественное гель уплотнения в указанные дни культуры (среднее ± стандартное отклонение). (С) гематоксилином и эозином (H & E) и Массона трехцветный (МТ) окрашивание срезов biowire (стрелки двуглавые представляют ось шва). Масштабные баR = 100 мкм. Эта цифра была изменена из ссылки 14 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Физиология кардиомиоцитов, культивируемых на платформе Biowire. ( A ) Репрезентативные конфокальные изображения нестимулированных (контролируемых) и электрически стимулированных биопроводов (схемы 3 и 6 Гц), показывающие выравнивание кардиомиоцитов и частые Z-диски (двунаправленные стрелки обозначают ось шва). Зеленый, α-актинин; Красный, актин. Шкала шкалы = 20 мкм. ( B ) Пролиферация кардиомиоцитов в биореакторах была ниже, чем в EB. Пролиферацию оценивали двойным окрашиванием для саркомерного α-актинина и Ki67 ( n = 3-4 на состояние, среднее ±; сд). *, **, # и & представляют статистически значимые различия по сравнению с EBd34 (Стьюдента -теста). Эта цифра была изменена с 14 ссылки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Электрическая стимуляция продвигаемых Улучшения в Са 2+ Handling Свойства. (АС) Характерные следы Ca 2+ высвобождения в ответ на кофеин в нестимулированных контрольные клетках (А) и клетки , подвергнутые режим 3 Гц (В) и 6 Гц режим (C). (D) , Кофеин-индуцированная изменение интенсивности пика флуоресценции среди экспериментальных групп (среднее значение ± SEM после нормализации пика флуоресценции яntensity до введения кофеина; контроль по сравнению с 3 Гц, P = 1,1 · 10 - 6; Контроль против 6 Гц, P = 2,1 × 10 - 7; 3 Гц против 6 Гц, P = 0,003; п = 10 (контроль), п = 6 (3 Гц), и п = 9 (6 Гц) (т -test Стьюдента). (Е) представитель флуоресцентной записи Са 2+ до и после введения кофеина при 5 мМ (стрелка) в клетках , подвергнутых режим 6 Гц. Эта цифра была изменена с 14 ссылки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Электрическая Стимуляция улучшает Электрофизиологические свойства и автоматизм. Electrophysiologприм свойства в отдельных кардиомиоцитов, выделенных из biowires или эмбриональных телец (ЭТ) были записаны с помощью зажима заплаты. (А) HERG хвоста плотности тока. (Б) Я К1 плотность тока измеряется при -100 мВ. (С) Положительной регуляцией калия внутрь выпрямление гена канала (KCNJ2). (D) Отношение клеток , воспроизводящих самопроизвольное биение (автоматизм) или не спонтанное биения (без автоматизма). Данные в AD представляют собой среднее ± SEM Различия между экспериментальными группами были проанализированы с помощью т -TEST Стьюдента, хи-квадрат тест, и ANOVA (попарных сравнений, множественных метод Holm-Сидака). Эта цифра была изменена с 14 ссылки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Шаг Протокол # | Критические шаги | ||||
| 2,4 | Поместите углерода стержней 1 - 2 см друг от друга, или на минимально возможном расстоянии, чтобы избежать стимуляции высокой энергии и гибель клеток. | ||||
| 2,6 | Проверьте соединения между платиновой проволокой и углеродом, как только стимуляцией камера выполнена в первый раз. Ссылка на стимуляцию камеры к электрическим стимулятором, а затем установить желаемое напряжение. Поместите вольт свинец на каждый из двух углеродных стержней. Выходное напряжение от стимуляции камеры должно быть таким же напряжением чтения на вольтметре. Любые неправильные показания указывают на возможное покрытие из платиновой проволоки с PDMS или другой дефектный соединение в системе. | ||||
| 3,1 | Отдельные клетки были использованы для затравки biowire. Для диссоциации, то incubatioп раз с коллагеназы имеет решающее значение и должно определяться возрастом клеток и протокол дифференцировки (ЭТ) в сравнении с монослоев. В этом протоколе, время инкубации 2 ч рекомендуется день 21 ЭТ и 30 мин для монослоев. Для клеток других возрастов, время пищеварения коллагеназы может потребоваться оптимизация мониторинга жизнеспособности клеток и сократительная функция пост-пищеварение. | ||||
| 3,3 | Трипсин может повредить клетки; Таким образом, ограничить продолжительность инкубации до не более чем 5 мин. | ||||
| 3,5 | Избегайте введения загрязняющих веществ путем проведения только конец шприца, чтобы прикрепить шприц к кончику иглы. Количество погружается определяется отсутствие крупных комков клеток. Минимизировать нарушение иглы, чтобы избежать гибели клеток. Избегайте образования пузырьков. В случае видимых комков после разрушения иглы, продлить время инкубации в коллагеназы в последующих обособлениях вместо увеличенияВремя инкубации в трипсине или количестве погружается. | ||||
| 3,6 | Удалить супернатант полностью перед добавлением геля. Остаточная среда может разбавить соотношение клетки: гель и гель влияет на полимеризацию. | ||||
| 3,7 | Поддержание концентрации компонентов коллагена геля при масштабировании вверх или вниз. Следует помнить, что в наличии концентрация может меняться в зависимости от партии или подготовок реагентов. | ||||
| 3,11 | Для того, чтобы PDMS Микролунки оставаться на дне чашки Петри, убедитесь, что чашка Петри сухая и использовать пару стерильных пинцетов раздвинуть PDMS мироплансает вниз. | ||||
| 4,2 | Убедитесь, что все biowires на месте. Накройте biowires полностью со средой в электрической стимуляции камеры. Расположить все biowires перпендикулярно к углеродных стержней. | ||||
| 4,3 | <тд = Объединение столбцов «5»> Во избежание повреждения платиновой проволоки, покрыв крышку осторожно. Используйте ленту, чтобы закрепить крышку должным образом на пластине в случае, если крышка не закрывается полностью. При закрытии двери инкубатора, поместите тонкую часть провода от электрического стимулятора при закрытии двери точек, чтобы обеспечить надлежащее уплотнение инкубатора.|||||
| 4,4 | Отсоедините электрический стимулятор для изменения среды. Используйте P1000, чтобы удалить только верхнюю часть старой среды, а затем добавить свежую среду. Убедитесь в том, что biowires всегда погружены в среду. | ||||
Таблица 1: Критические шаги в Протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает установку и внедрение спроектированной платформы, biowire, чтобы улучшить созревание HPSC-CMs. Устройство может быть выполнено в стандартных объектах микрообработки, и biowires может быть получен с обычными методами клеточной культуры и электрическим стимулятором.
Насколько нам известно, не существует сообщил метод похож на biowires. Эта стратегия показывает, что улучшенные свойства созревания зависят от электрической схемы стимуляции, о чем свидетельствует более высокий уровень созревания, полученного в biowires, подвергнутых более высокой скорости стимуляции линейного нарастания режима (6 Гц по сравнению с 3 Гц). Кардиомиоциты в biowires продемонстрировал меньше автоматизма и более высокие токи HERG , и я K1 по сравнению с ЭТ культивировали в течение 20 дней (EBd20) или 40-44 дней (EBd44). EBd20 кардиомиоциты представлены свойства клеток перед их включением в biowires, тогда как EBd44 кардиомиоциты культивировали 10 дней лЧем время культивирования биологической культуры, и показывает, что даже при более длительном времени культивирования в формате ЕВ кардиомиоциты не могут достичь эквивалентных свойств созревания, как те, которые вызываются электрической стимуляцией в биопроводах. Тем не менее, кардиомиоциты, полученные с помощью биочипов, все еще не столь зрелые, как у взрослых кардиомиоцитов.
Было предложено, чтобы механическая стимуляция была эффективной при индукции структурных белков hPSC-CM. Однако механическое раздражение не привело к электрофизиологическому созреванию 12 . Это может указывать на необходимость сочетать электростимуляцию и механический стресс, последовательно или одновременно, для индукции терминальной дифференцировки в кардиомиоцитах, полученных из hPSC. Комбинация электростимуляции с другими методами, включая доставку биохимических факторов 17 и выравнивание клеток в трехмерных тканях 18 , могла бы обеспечить более эффективную просозревающую стратуг на будущее в естественных условиях исследования.
Размеры biowire устройства, используемые здесь, 5 мм х 1 мм х 0,3 мм (длина х ширина х высота), но можно модифицировать устройство, чтобы сделать более длинные biowires. Тем не менее, высота biowires ограничена до 0,3 мм (с радиусом ~ 300 мкм при уплотнении геля), с учетом ограничений по доставке кислорода в больших тканях. Чтобы преодолеть это ограничение генерации толстых тканей, метод перфузии потребовалось бы 19. Тем не менее, рекомендуется , чтобы поддерживать соотношение 0,5 × 10 6 клеток / 0,5 см проволоки длиной. Для более длинных biowires, полимеризация коллагеновый гель может потребоваться больше времени, и более частые изменения среднего могут быть необходимы в связи с увеличением количества клеток. Кроме того, в настоящее время установка в biowire с использованием шелковой нити не позволяет для измерения силы сжатия, порожденной посеянных кардиомиоцитов. Тем не менее, использование биоразлагаемой шву может маке это возможно в будущем.
Тип клеток используется , чтобы сделать biowire описанный здесь чЭСК-CM с использованием клеточной линии Hes2 20. Протокол может также использовать клеточные линии hiPSC (например, CDI-и HR МСБ-I-2cR-2R) 14. Cardiomyogenic способность различных линий стволовых клеток человека может быть различной, и пригодность для этой платформы должна быть определена экспериментально и условия оптимизированы по мере необходимости. Есть несколько важных шагов в рамках протокола (смотрите таблицу 1).
Кроме того, biowires были разработаны, чтобы соответствовать 6-луночного планшета, и пример здесь показал изготовление одной biowire. Тем не менее, можно культуры и электрически стимулировать несколько biowires одновременно в одной скважине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом-в-помощь от сердца и инсульта Фонда Канады (G-14-0006265), операционные гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения (137352 и 143066) и грантом фонда Джп Бикелл (1013821 ) к ССН.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11825015 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4 inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
