Summary
Den amerikanske bullfrog s (Rana catesbeiana) sacculus tillader direkte undersøgelse af hår-celle fysiologi. Her dissektion og forberedelse af bullfrog s sacculus for biofysiske undersøgelser beskrives. Vi viser repræsentative eksperimenter fra disse hårceller, herunder beregning af et bundt s force-forskydning forhold og måling af dets utvungne bevægelse.
Abstract
Studiet af hørelse og balance hviler på indsigt hentet fra biofysiske undersøgelser af modelsystemer. En sådan model, den sacculus af den amerikanske bullfrog, er blevet en grundpille i auditiv og vestibulær forskning. Undersøgelser af dette organ har afsløret, hvordan sensoriske celler hår kan aktivt detektere signaler fra omgivelserne. På grund af disse undersøgelser, vi nu bedre forstå den mekaniske gating og lokalisering af et hår celles transduktion kanaler, calcium rolle i mekanisk tilpasning, og identiteten af hår celle strømme. Denne meget tilgængelig orgel fortsætter med at give indsigt i arbejdet i hårceller. Her beskriver vi udarbejdelsen af bullfrog s sacculus for biofysiske undersøgelser af dens hårceller. Vi inkluderer den komplette dissektion procedure og giver specifikke protokoller til forberedelse af sacculus i bestemte sammenhænge. Vi inkluderer desuden repræsentative resultater ved hjælp af dette præparat, herunder beregning afet hår bundle øjeblikkelige kraft-forskydning forhold og måling af et bundt spontane oscillation.
Introduction
De acousticolateralis organer af pattedyr i besiddelse af en kompleks arkitektur og ligger inden for en anatomisk niche, der kan være svært at få adgang. For eksempel den mammale cochlea omfatter en spiral labyrint og er indlejret i den tykke temporale knogle. Isolering af cochlea ofte forårsager mekanisk beskadigelse af sensoriske celler ligger inden den og har derfor vist sig at være en vanskelig opgave 1. Neuroforskere har således vendt til at modellere systemer, som er lettere ekstraheret fra sanctum af øret.
En af disse modelsystemer, den sacculus af den amerikanske bullfrog (Rana catesbeiana), har i årtier gav generaliseres indsigt i funktionen af auditive og vestibulære system. Den sacculus er et blandet funktion orgel med sensoriske roller i både lavfrekvente hørelse og seismisk sensation. De sensoriske celler i sacculus er dens hårceller, specialiserede transducere, der konverterer mekanisk energitil elektriske signaler inden for vores auditive og vestibulære organer. Rager ud fra den apikale overflade af hvert hår celle en mekanosensitive hår bundt, der omfatter en gradueret tot forstørret mikrovilli kaldet stereocilia. Spidserne af hosliggende stereocilia er indbyrdes forbundet med filamentøse tip-link proteiner, mekanisk gate ionkanaler som respons på mekanisk stimuli 2, 3. Selvom auditive og vestibulære organer reagerer på forskellige typer af stimuli, de deler en fælles afsløring mekanisme. Denne ensartethed ligger til grund for mange erfaringer, der opnås i hår-celle mechanotransduction gennem studier af bullfrog sacculus. For eksempel har håret cellens aktiv proces blevet omfattende undersøgt i dette organ 4, 5, 6, 7, og håret bundt anvender en energikrævende proces at fremstille mekaniskearbejde. Ikke alene er det blevet vist, at hårceller genererer aktivt arbejde 6, men distinkte mekanismer bag den aktive proces og et hår celles tuning karakteristika er blevet afsløret gennem studier af Bullfrog acousticolateralis organer. Disse omfatter aktive hår-bundt motilitet 8 og hår celle elektrisk resonans 9, 10, 11 i sacculus og frekvens selektivitet på håret cellens bånd synapse 12 i amfibiedyr papil.
Den bullfrog er sacculus appellerer til sensoriske hjerneforskere for mange grunde. I modsætning til pattedyr-cochlea, dette organ ligger inden for lettilgængelig otiske kapsel. For det andet kan hårceller i dette organ forbliver sunde i flere timer under passende betingelser 13, 14. Dette tillader experimentation på disse celler over lange tidsskalaer i forhold til deres pattedyr kolleger. For det tredje, orglet bærer lille krumning, tillader let manipulation. Fjerde, hvert organ omfatter en tusind eller flere hårceller 15, giver både en høj produktion og en høj sandsynlighed for at finde et passende sæt hårceller i en bestemt eksperiment. Endelig er det oksefrøen s sacculus let visualiseret grund tyndhed dette organ og store størrelse af sine hårceller.
Disse egenskaber giver stor alsidighed til studiet af sanseceller i oksefrøen s sacculus. Afhængig af spørgsmålet ved hånden, kan der opnås en af flere eksperimentelle præparater fra sacculus. Den simpleste af disse er den ene-kammer præparat. Her sacculus immobiliseres i et kammer fyldt med kunstig perilymfe, et natrium--rige og høj-calcium saltvand. Dette præparat muliggør studiet af hår celle strømme og grundlæggende hår bundle mekanik. En anden konfiguration, to-kammer-præparat, kan anvendes til undersøgelse af spontane hårbundt bevægelser. Her den apikale side af hårceller er udsat for en kalium-rige og calcium-fattig saltvand betegnes kunstig endolymfe, mens den basolaterale side er badet i kunstig perilymfe. Disse to rum efterligne in vivo arrangement af saltopløsninger og skabe et miljø, der tillader hårbundterne at oscillere spontant.
Vi beskriver i dette papir udarbejdelsen af bullfrog s sacculus for biofysisk undersøgelse af dets sensoriske hårceller. Vi først give en detaljeret skildring af isolering af dette organ fra frøen indre øre. Vi beskriver derefter både en- og to-kammer eksperimentelle præparater og omfatter repræsentative resultater for de forskellige konfigurationer.
Protocol
Etik Statement: Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på The Rockefeller University.
1. Pre-eksperimenterende Prespanparation
- Løsninger
- Forbered eugenol løsning (2,5 g · L -1 · kg -1 frog). Forbered saltopløsninger (tabel 1).
BEMÆRK: For en enkelt kammer forberedelse, forberede kunstig perilymfe; for en to-kammer forberedelse, forberede både kunstige perilymfe og kunstig endolymfe.
- Forbered eugenol løsning (2,5 g · L -1 · kg -1 frog). Forbered saltopløsninger (tabel 1).
2. eksperimentelle værktøjer
- Fremstilling af glas stimulation fiber
- Indsnævre et borsilikatglas kapillarrør med en elektrode aftrækker i en én-line pull med høj varme og høj hastighed. Læg trukket kapillarrør i en solenoide-drevet aftrækker.
- Bring kapillarrøret tip mod et filament med en glaskuglesmeltet på det, indtil de kapillære kontakter glaskugletypen.
- Tænd glødetråden at smelte spidsen af kapillaret i glasperle. Når en tynd bro af glas former mellem kapillære og perlen, slukke glødetråden og omkring samme tid aktivere magnetventil aftrækker.
BEMÆRK: Denne vil trække glaskapillar i en ret vinkel til dennes længdeakse og skabe et solidt fiber. - Sikre, at fiberens diameter er højst 0,5 - 1 um, og at dens længde ikke overstiger 100 - 300 pm. Hvis fiberens længde overskrider denne dimension, trimme det med iris saks. Brug en saks, der allerede er kedeligt at undgå at beskadige dissektion værktøjer.
- Kan forbedre optisk kontrast, sputter belægge fiber. Brug en pådampningsbelægningsmaskinen med en guld-palladium kilde. Lodret indlæse hver fiber i en pådampningsbelægningsmaskinen med sin tilspidsede ende mod kilden. Bring fiberens spids til en afstand på 1 - 2 cm fra guld-palladium kilde.
- Lukpådampningsbelægningsmaskine kammer til at danne en sæl og tænde den. Gentagne gange skylle den omgivende luft med argon. Efter skylning luften, reducere trykket i kammeret til 10 Pa (70 mTorr).
- Sputter frakke i 10 s pulser med 10 s forsinkelser over en kurs på 120 s.
BEMÆRK: fiber tip bliver mørkere over varigheden af denne protokol, hvis katodeforstøvningscoatingssystem var en succes.
- Fremstilling af skarpe mikroelektroder
- Træk et glas kapillarrør med en indre filament ved hjælp af en en-line med høj varme pull. Elektroder bør have en modstand på 100 - 300 MOhm når den er fyldt med 3 M KCI. Fyld hver elektrode med 3 M KCI.
- Bend hver elektrodens spids med microforge at gøre det vinkelret på håret celle apikale overflade når den er monteret i forstærkeren hovedtrin 16.
- Fremstilling af iontophoretiske pipetter
- Træk et glaskapillar med en internfilament til en 50 MOhm tip. Fyld med koncentreret opløst stof (f.eks 500 mM gentamicin sulfat).
- Fremstilling af aluminium montering ligge
- Skær en 1 cm x 1 cm firkant af aluminiumsfolie. Perforere folien i centrum med spidsen af en stav til rygmarvsstødning eller andre skarpe genstande. Forme perforeringen, så den er cirkulær og ca. 1 mm i diameter.
- Udarbejdelse af vakuum fedt fyldt injektionssprøjte.
- Fjern stemplet fra en 5 ml sprøjte. Fyld sprøjten fra bagsiden med vakuum fedt. Udskifte stemplet.
- Fremstilling af polytetrafluorethylen limpåfører
- Foretag en 2 mm lang aksial skåret ind i enden af en træ applikatorpind. Spalten skal være i centrum af applikatoren, når den ses fra enden.
- Med skarpe saks eller et barberblad, skære en 2 mm x 4 mm rektangel af polytetrafluorethylen fra en plade på 1 mm tykkelse. Bruge et barberblad til tynde en af de 2 mm lange kanter af polytetrafluorethylen rektangel. Begyndende i midten af rektanglet, reducere tykkelsen af rektanglet ved skæring udad for at danne en affasning på spidsen af rektanglet.
- Sæt polytetrafluorethylen rektangel i træ applikator slids, således at den skrå kant vender bort fra pinden. Påfør 5 min epoxy til bunden af polytetrafluorethylen rektangel for at fastgøre den på plads. Tillad limapplikatoren hærde i 1 time ved stuetemperatur.
- Fremstilling af nederste halvdel af to-kammer mount
- Maskine eller 3D udskrive den nederste halvdel af de to-kammer mount (Supplemental fil 2). Identificer cirkel med en diameter forsænket 20 mm på den nedre overflade af kammeret.
- Påfør et tyndt lag af epoxy til de laterale mest 3 mm af den forsænkede cirkel. Påfør et 18 mm cirkulært dækglas på epoxy. Tillad epoxyen hærde i 1h.
3. Udvinding af indre-øre Organer
- Bedøver en amerikansk bullfrog ved at placere den i en lille spand, som indeholder eugenol bedøvende løsning i 10 min. Juster lydstyrken af løsningen, så frøen humero-skulderblad fælles løgne lige over væske-luft-grænsefladen.
- Aflive den bedøvede bullfrog ved at dobbeltklikke rygmarvsstødning.
- Tag fat i bedøvet frøen med en finger på toppen sin næse og en anden under kæben og drej frøen hoved frem.
- Hurtigt kaste rygmarvsstødning stang ind i kraniehulen hvælving gennem foramen magnum, som findes på midterlinjen mellem frøen s occipitale processer.
- Træk langsomt og drej stangen indtil dens spids afviger fra foramen magnum. Tvinge stangen kaudalt gennem vertebrale foramina at ødelægge rygmarven.
- Bekræft, at frøen er blevet ordentligt dobbelt pithed ved at observere, at dets nedre ekstremiteter er udvidet.
- Tag fat frøen med en tommelfinger oven på næsen og første finger gribe de vomerine tænder for forbedret stabilitet. Halshugge frøen ved overskæring kæbeleddet bilateralt og efterfølgende skære vinkelret på rostrocaudal akse. For at sikre, at de indre-øre organer i kraniet forbliver intakt, at snittet er kaudalt for både tympana.
- Ved hjælp af en stereodissection mikroskop, udføre en midterlinjen skære gennem palatinale væv fra vomerine tænder til den mest posteriore udstrækning af vævet (figur 1A).
- Afskære og klar med vandrette udskæringer af skalpellen enhver muskel liggende under palatinale væv for at afsløre den posteriore brusk. Efter fjernelse musklen, observere slikkepind formen af den tidsmæssige brusk danner grænsen af otiske kapsel.
- Sever den Columella på sit kontaktpunkt med otiske kapsel brusk.
- Gentagne gange barbere tynde lag af denne brusk ved at gøre shallow vandret skærer igennem det. Undgå dybe nedskæringer for at forhindre skader på indre-øre organer. Dette åbner otiske kapsel findes inden for slikkepind struktur tidsmæssige brusk (figur 1B). Inden for den otiske kapsel er frog indre-øre organer (figur 1C).
- Trim den bageste og sidekanter otiske kapsel, pas på ikke at beskadige indre-øre organer. Under dissektion, ofte flyde saltvand i løbet af de indre øre organer for at sikre, at de forbliver neddykket og hydreret.
- Find de to cirkulære åbninger i den temporale knogle ved den mediale forbindelse af brusk med midterlinjen. Skær nedad gennem mest mediale åbning til at briste tindingebenet.
- Lav en anden nedadgående snit gennem otiske kapsel på sit posterolateral lateral kant. Fjern det stykke brusk mellem denne og den tidligere snit til at give adgang til de indre-øre organer.
- Pry løs brusk mellem snittene fra trin 3.8 ennd 3,9 og skære det væk fra otiske kapsel. Denne handling skærer den nærmeste halvcirkelformede kanalen, som derefter kan anvendes som håndtag for yderligere manipulationer.
- Pas på ikke at røre ved sacculus, bryde den VIII th kranienerve.
- Hold ampulla af den nærmeste halvrunde kanalen. Drej forsigtigt indre øre for at blotlægge de resterende to halvcirkulære kanaler. Ved at udsætte hver kanal, bryde det.
- Hold nerve eller en halvrund kanal ampulla, udtrække det indre øre fra hovedet og læg den i et fad fyldt med kølet iltet kunstig perilymfe. Fjernelse af det indre øre tillader visualisering af passagerne inden tindingebenet hvorigennem Buegangene engang igennem (figur 1D).
BEMÆRK: Gentag disse trin for at udtrække den anden øre.
4. One-kammer Fremstilling
- Isolering af sacculus
- Find sacculus ved at identificere sin store pinsemandage masse af otoconia og Sækformet nerve, der ligger oven på det (fig 1E). Pas på ikke at fysisk traumatisere sacculus i de følgende trin for at bevare integriteten af Sækformet hårceller.
- Trim halvrunde kanaler at gøre det indre øre mere manøvredygtig.
- Fjern perilymfatisk cisterne ligger over neurale side af sacculus. Lav blide snit langs kanten af cisternen. Næste skille de små søjler af væv, bro cisterne membran til den neurale side af sacculus.
- Fjern Lagena og dens tilhørende nerve.
- Hold Sækformet nerve, forsigtigt løfte sacculus og skære gennem den tynde membran otoconial vej. Som otoconia spill ud af sækken, befri sacculus ved at skære omkring sin omkreds.
BEMÆRK: Efter at isolere sacculus, kan de resterende indre-øre organer gemmes, hvis det ønskes. Fjernelse af sacculus letter identifikation af andre strukturer, såsompadder og basilaris papiller. - Brug en saks eller en pincet til forsigtigt at tørre væk enhver otoconia tilbage på sacculus. Pas på ikke at røre ved sacculus under denne proces.
- Trim resterende otoconial vej membran fra sacculus 'kant. Denne membran har en tendens til at klæbe til plast og glas overflader og dens fjernelse minimerer udfordringer i håndtering af væv.
- Flyde forsigtigt saltvand over sacculus med en Pasteur-pipette til at fjerne eventuelt resterende otoconia (figur 1F).
BEMÆRK: Gentag denne procedure for den anden sacculus, som er et spejlbillede af den første.
- Fordøjelse og montering
- Brug af bagenden af en Pasteur-pipette med spidsen brækket, overføre det isolerede sacculi til en petriskål indeholdende 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV i kunstig perilymfe.
BEMÆRK: Denne protease behandling fordøjer links tøjring hver kinociliary pære til otolithicmembran, hvilket muliggør fjernelse af membranen uden at beskadige de sensoriske hår bundter. - Inkuber vævet i 30 minutter ved 22 ° C (eller 35 min ved 21 ° C). Overfør hver fordøjet sacculus til et åbent-faced eksperimentelle kammer og fastgør vævet med magnetiske ben.
- Den Sækformet gule plet ligger direkte under otolithic membran og er den del af sacculus der indeholder hårceller. Identificer det og fjern forsigtigt sin overliggende otolithic membran med en fin øjenvipper, pas på ikke at røre ved Sækformet gule plet.
- Brug af bagenden af en Pasteur-pipette med spidsen brækket, overføre det isolerede sacculi til en petriskål indeholdende 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV i kunstig perilymfe.
5. To kammer Fremstilling
- Isolering af sacculus
- Isoler sacculus fra indre-øre organer som i afsnit 4.1.
- Montering og fordøjelse
- Fyld monteringsblokken (Supplemental fil 3) med kunstig perilymfe og placere den perforerede aluminium folie på en åbning, ved hjælp af to pletter af vakuumfedt at holde det på plads og danne en svag forsegling.
- Overfør en sacculus til folien og centrere det på toppen af hullet med den gule plet nedad og nerve stump opad.
- Fjern saltvand omgiver sacculus med et stykke snoet væv. Væge saltvandet til at tørre overfladen af aluminium ligge omkring sacculus.
- Brug polytetrafluorethylen applikator til at anvende cyanoacrylat lim til at danne en tæt forsegling langs grænsen mellem kanten af sacculus og aluminium pladsen. Sørg for, at hele omkredsen af sacculus er dækket med lim.
BEMÆRK: Proceeding for langsomt tillader cyanoacrylat lim til at krybe over neurale side af sacculus og til sidst dække det. Det er derfor bydende nødvendigt at fuldføre denne opgave hurtigt. - Placer en dråbe saltvand oven på den monterede væv for at hærde limen. En tynd film af lim kan danne oven på dråbe saltvand; fjerne det med en pincet.
- Fjern forsigtigt than folie fra monteringsblokken. Vend monterede væv over, så den makulært side af sacculus vender opad og flyde det på en kunstig perilymfe fyldt petriskål.
- Tilføj en dråbe protease XXIV opløsning på toppen af macula og inkuberes i 30 minutter ved 22 ° C (eller 35 min ved 21 ° C). Fyld den nederste kanal af de to-kammer apparat (Supplemental fil 2) med perilymfe og sted vakuum fedt omkring den centrale kammer.
- Placer folie monteret sacculus på det nedre kammer med sin nerve vender mod kammerets overflade. Tilføj fedt omkring omkredsen af folien.
- Placer det øverste kammer (Supplemental fil 1) af præparatet på folien, der tager sig til at danne en komplet forsegling med vakuum fedt. Fyld det øverste kammer med boblede kunstig endolymfe og fjern forsigtigt otolithic membran med en øjenvippe.
Representative Results
Den sensoriske epithel af bullfrog s sacculus kan anvendes i forskellige konfigurationer til at probe fysiologi hårceller. Fordi vævet er relativt fladt, kan den monteres i både en- og to-kammer præparater. Den ene-kammer konfiguration giver en enkel opsætning til elektrofysiologiske og mikromekaniske optagelser af hårceller. Præparatet to-kammer stedet simulerer både endolymfatiske og perilymfatisk rum på henholdsvis apikale og basale sider af hårceller. Disse rum tilsammen giver en fysiologisk relevant miljø for studiet af mechanotransduction af hårceller.
Følsomhed og transduktion karakteristika hårceller ligger til grund for deres elektriske respons på mekanisk stimulation. For at undersøge disse funktioner, vi samtidigt optaget fra en individuel hår celle position dets bundle ogcellens receptor potentiale (figur 2). Vi først fastgjort en fleksibel glasfiber til kinociliary pære af et hår bundt til at anvende kraft impulser. Vi målte derefter hårbundtet deplacement bruger en dual fotodiode System 2 (figur 2A). Vi samtidig erhvervede håret cellens potentiale ved spidde cellen med en skarp mikroelektrode. Vi opnåede en forskydning-responskurve ved afbildning spidsspændingen respons fremkaldt af hvert mekanisk stimulus mod håret bundt har en tilsvarende forskydning (figur 2B). Håret cellens elektriske respons mætter for både positiv- negativ-forskydning ekstrema. Reduktionen af membranpotentiale med negative forskydning trin indikerer tilstedeværelsen af en hvilende indadgående mechanotransduction strøm. Denne hvilende strøm moduleres ved virkningen af Ca2 + på både hurtig og langsom tilpasning 17, 18, 19, 20, 21.
En hår celles adfærd afhænger ikke kun på dens elektriske egenskaber, men også på de mikromekanik dens sensoriske hår bundt. De to-kammer konfiguration efterligner adskillelse af endolymfe og perilymfe in vivo, hvilket giver ideelle betingelser for studiet af et hår bundle mekanikere. Under disse betingelser og med den otolithic membran fjernet, kan hår bundter svinge spontant 6. Her anvendes vi de to-kammer forberedelse til at vurdere mikromekanik enkelte bundter. Vi indspillede de spontane svingninger af et hår bundle ved støbning sin skygge på en dual-fotodiode forskydning monitor (figur 3). For at vurdere rollen af aminoglycosidantibiotikum gentamicin på mechanotransduction, vi iontoforetisk rele ased gentamicin direkte på håret bundt (figur 3). Koncentrationen af frigivet gentamicin stiger proportionalt med strømmen ledes gennem mikropipetten. Gentamicin inhiberer et hår bundt s svingninger og inducerer en statisk offset af bundtet mod dets høje side. Disse virkninger afspejler rolle gentamicin som en åben-kanal blokker, der fastholder den åbne tilstand af mechanotransduction kanaler, mens blokere deres gennemtrængning pore. Iontoforese af ladede kemikalier tillader lokaliseret og kvantificerbar frigivelse af kemikalier i forskellige koncentrationer i fravær af fluidstrømning-induceret mekanisk sprængning og er således velegnet til studiet af mekanosensitive organeller såsom håret bundt 22.
En hår bundle spontane bevægelse skyldes samspillet mellem tilpasning og ikke-lineær bundt stivhed 7,xref "> 8, 23, 24. Denne spontane bevægelse er en underskrift af hår bundt aktive proces, som konverterer signalet energi til mekanisk arbejde for at overvinde væskemodstand. bundter hår har vist sig at udvise lineær øjeblikkelige stivhed i det vestibulære 2, auditive 25, og lateral-line systemer 26.
Vi direkte målte øjeblikkelige stivhed af en individuel hår bundt fra oksefrøen s sacculus (figur 4). For at opnå dette, vi koblet spidsen af en fleksibel glasfiber til håret bundle s kinociliary pære (figur 4A). Vi leverede kræfter til håret bundle ved forskydning af fiberen base. Kraften udøvet på håret bundle af stimulus fiber svarer til forskellen mellem forskydningerne af fibrenes base og tip, multipliceret med fiberens stivhed 2, 27. Levering af impulser på tværs af en række af kræfter afslører et forhold mellem kraft, der virker på bundtet og bundtet er efterfølgende forskydning. Hældningen af denne kraft-forskydning forhold svarer til håret bundle øjeblikkelige stivhed (figur 4A).
Denne metode tillod os at måle en individuel bundt øjeblikkelige stivhed som funktion af dens deformation (figur 4B). Den øjeblikkelige kraft-forskydningskurven viser en ulineær relation, afslører en ulineær stivhed af bundtet over et område på ca. 20 nm omkring sin hvileposition. Uden for dette område, håret bundle opfører sig som en Hookean materiale, dets stivhed er lineær for større størrelse udbøjninger.
Disse resultater demonstBedøm alsidighed bullfrog sacculus i studiet af håret-celle-fysiologi. Ved hjælp af disse og andre præparater, kan man udforske mechanotransduction på flere stadier i videregivelse af oplysninger fra bundtet mod hjernen.
Figur 1: Dissektion af Bullfrog s indre øre. (A) Visning af bullfrog øvre gane fra dens ventrale side muliggør identifikation af det eustakiske rør (cirkel). Lateral reflektion af huden, der dækker den højre side af den øvre gane afslører placeringen af det indre øre (stiplede boks). (B) Fjernelse af brusken på den ventrale side af frøen tidsmæssige knogle åbner otiske kapsel (stiplet linie). (C), der vises, er en højere forstørrelse billede af otiske kapsel, hvori sacculus, Lagena, CN VIII, og SACC ular nerve let kan identificeres. (D) En visning af otiske kapsel efter fjernelse af de indre-øre organer afslører placeringen af de halvrunde kanaler. (E) Efter fjernelse af det isolerede indre øre, det sacculus, Lagena, og VIII th kranienerve (CN VIII) kan let identificeres. (F) Den isolerede sacculus besidder en kort stump af Sækformet nerve og en otolithic membran liggende oven dets sensoriske epithel. Etiketter svarer til (i) sacculus, (ii) Lagena, (iii) CN VIII, (iv) Sækformet nerve, og (v) otolithic membran. Axis etiketter P og A svarer til henholdsvis de bageste og forreste retninger. Scale søjler repræsenterer 1 cm (A, B), 1 mm (C, D, E), og 400 um (F).
Klik her for at se en større version af dette tal.
s "target =" _ blank "> Klik her for at downloade en vektor version af dette tal.
Figur 2: Forskydning-respons kurve for et enkelt hår celle. (A) Spidsen af et glas stimulus fiber blev koblet til kinociliary pære af et hår bundt og fiberens base blev efterfølgende forskydes tværs ni diskrete trin. Bundtet holdning blev sporet på en dual-fotodiode-system, og dens potentielle receptoren blev samtidigt målt med en mikroelektrode, hvis produktion blev passeret gennem en forstærker i bridge mode. Elektrodens spids modstand var 95 MOhm og bundtet potentiale hvilende membran var -47 mV. (B) Et plot af bundtet s receptor potentiale som funktion af dens bevægelse afslører en ulineær relation mellem bundtet respons og densposition. Hvert punkt svarer til gennemsnittet potentiale og betyder forskydning over en 2,5 ms tidsvindue, begyndende 2,5 ms efter starten af mekanisk stimulering. Hver farve repræsenterer en række tidsserier svarende til den samme forskydning puls.
Klik her for at se en større version af dette tal.
Klik her for at downloade en vektor version af dette tal.
Figur 3: Virkning af Gentamicin på Spontan Hair Bundle svingning. Den spontane bevægelse af et hår bundt i en to-kammer præparat blev registreret ved anvendelse af et dobbelt fotodiode system. I mangel af iontophoretisk afgivelse af gentamicin (0 nA), håretbundt viser symmetriske svingninger. Som størrelsen af strøm ledes gennem en iontoforetisk pipette fyldt med 500 mM gentamicinsulfat vokser (10 nA, 20 nA) frekvensen af hår-bundt ekskursioner falder på en dosis-afhængig måde og bundtet er forskudt mod sin høje kant i længere tid tidsperioder.
Klik her for at se en større version af dette tal.
Klik her for at downloade en vektor version af dette tal.
Figur 4. Beregning et hår Bundle øjeblikkelige Stivhed. (A) En stimulus fiber (rød) af stivhed K F er koblet to kinociliary pære (brun) af en individuel hårbundt (gul). Forskyde bunden af fiberen en kendt afstand X F bevirker bundtet at bevæge en afstand X B. Forskellen mellem forskydningerne af fiberen og bundtet er proportional med kraften udøvet på bundtet af stimulus, fiber, F F. Gentage denne over et område af kræfter giver en øjeblikkelig kraft-forskydning forhold (til højre), hvis hældning svarer til håret bundle øjeblikkelige stivhed. (B) En individuel bundt blev underkastet tvinge impulser af stigende størrelse og dens bevægelse inden for de første 50 ms efter pulsen indtræden blev målt (blå punkter). Her hårbundtet viser en ikke-lineær øjeblikkelig stivhed over et område på ca. 20 nm omkring sin hvileposition. Den røde kurve svarer til en egnet til relationen F = k * X - 60 * z * (1 / (1 + exp (- z * (X - X 0) / (k B * T))) + F 0, hvori F er den kraft, hvormed bundtet, X er bundtet deplacement, k = 790 ± 51 μN ∙ m -1 er bundtet konstant stivhed, når alle kanaler er enten lukket eller åben, z = 0,43 ± 0,04 PN kraften fra en enkelt gating fjeder, X 0 = 2 ± 1,9 nm er bundtet holdning ved hvilken 50% af sine kanaler er åbne, k B er Boltzmanns konstant, T er temperaturen, og F 0 = 11,7 ± 1,3 PN en offset kraft. Pasformen har en koefficient på bestemmelse af 0,98. Stimulus fiber havde en stivhed på 107 μN ∙ m -1.
Klik her for at se en større version af dette tal.
es / ftp_upload / 55.380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> Klik her for at downloade en vektor version af dette tal.
| solut | Formel Vægt (g / mol) | Tilføj til 1 L | |
| Kunstig perilymfe | Kunstig endolymfe | ||
| NaCl | 58,4 | 6,54 g | 0,117 g |
| KCI | 0,149 | 0,149 g | 8,62 g |
| CaCl2 ⦁ 2H 2 O | 147 | 2 ml 1 M CaCl2 lager | 250 pi af 1 M CaCl2 lager |
| HEPES | 238,3 | 1,19 g | 1,19 g |
| D - (+) - glucose | 180,2 | 0,541 g | 0. 541 g |
Tabel 1. Løsninger til Dissektion og Eksperimentel forberedelse. Vises i denne tabel er de opskrifter på kunstig perilymfe og kunstige endolymfe løsninger, der anvendes i dissektion og i en- eller to-kammer præparater. Løsningerne bør bringes til pH 7,2-7,4 med omkring 2 ml NaOH (perilymfe) eller 2 ml KOH (endolymfe). Den osmotiske styrke bør læse ca. 230 mmol · kg -1 grund af ufuldstændig ionisk dissociation.
Discussion
Inden for bullfrog s sacculus ligge flere tusinde lettilgængelige sensoriske hårceller. Her demonstrerer vi udvinding og forberedelse af sacculus for en- og to-kammer optagelser. Disse to præparater tillader både mikromekaniske og elektrofysiologiske studier af hårceller og deres tilknyttede bundter. Fordi vævet kan overleve i flere timer med hyppig udskiftning af iltet saltvand, kan eksperimenter fortsætte i lange varigheder. Hår celler i disse præparater typisk forbliver levedygtige i mikroelektrode optagelse i op til seks timer efter dissektion, mens hår bundter svinger spontant i op til 24 timer efter ekstraktion.
Vellykket udvinding og montering af sacculus hængsler på overvinde flere fælles udfordringer. Først bør undgås direkte kontakt med den apikale overflade af Sækformet macula hele fremstillingsproceduren. Den Sækformet nerve giver en praktisk håndtag til sikker manipuning af sacculus. Når befriet fra resten af de indre-øre organer, bør sacculus overføres ved anvendelse af en stor boring pipette, mens de resterende nedsænket i væske for at undgå mekanisk beskadigelse af dets sensoriske epithel. Fjernelsen af otoconia fra makulært overflade skal være afsluttet uden mekaniske skader på hårceller. Fordi otoconia ligger direkte oven på gule plet, kan hårceller blive beskadiget af utilsigtet kontakt mellem dissektion værktøjer og den otolithic membran, mens du fjerner otoconia. For at undgå skader, anbefaler vi, at der afholdes den gelatinøse masse otoconia på et sted langt fra den gule plet og fjernes som en enkelt masse. Derved undgår opsplitning af det otoconial masse i talrige klynger, som hver især vil blive individuelt udtrukket. Hvis små klynger af otoconia forbliver de kan fjernes med blide væsketryk leveret af en Pasteur-pipette. En sidste udfordring involverer dannelsen af en tæt forsegling mellem sacculus og aluminium montering ligge ito-kammer præparat. Anvender en firkant med en perforering lille nok til at tillade overlapning på ca. 100 um mellem sacculus og de omgivende aluminium tillader fuldstændig forsegling af vævet. Limen bør bringes i kontakt med ca. 100 um af Sækformet væv omkring macula perimeter for at danne en tæt forsegling.
Koncentrationen af frit Ca2 + er en vigtig overvejelse i studiet af hårceller. Ca2 + regulerer både hurtig og langsom tilpasning og bestemmer således kinetikken for mechanotransduction apparater samt egenskaber for håret bundle aktive-proces fænomener, herunder spontan bundt bevægelighed 8, 23. Endolymfatisk calcium in vivo er til stede ved 250 uM, derfor de mest fysiologisk relevant kinetik vurderes ved denne koncentration (Maunsell JHR, R. Jacobs, og AJ Hudspeth. UnpublisHED observationer 16). Imidlertid mikroelektrode optagelser fra hårceller kræve en ekstern calcium koncentration over 2 mM for korrekt tætning af den cellulære membran omkring mikroelektrode. Det er derfor bydende nødvendigt at bruge en høj-calcium saltvand i disse eksperimenter. Endelig kan man ønsker at studere virkningerne af ekstern calcium upon mechanotransduction ved hjælp af forskellige calcium-koncentrationer. I disse tilfælde er det vigtigt at huske, at calcium koncentrationer under 1 uM typisk føre til tip-link brud og uoprettelige tab af transduktion 28.
De to eksperimentelle præparater beskrevet her mulighed for en række biofysiske målinger på hårceller. Dog kan yderligere målinger foretages med mindre ændringer af disse præparater. I den foldede Sækformet fremstilling er hårbundterne visualiseret lateralt. Imaging hår-bundle bevægelse fra dette udsigtspunkt afslører sammenhængende motion af både korte og høje stereocilia 29. Her Sækformet macula skilles først fra dens underliggende væv og efterfølgende foldes langs aksen defineret af Sækformet nerve, således at hårbundterne vender udad og visualiseres lateralt på folden. En anden modifikation, hår-celle dissociation, muliggør studiet af både hår cellens bundt og dens soma. Hårceller mekanisk dissocieret på en glasplade for billedbehandling og elektrofysiologiske optagelse 30. Endelig kan hårceller ekstruderes fra epithelet ved at følge en lignende dissociation protokollen, men uden den mekaniske dissociation trin. Denne behandling resulterer i hårceller som gradvis ekstruderes ud af epitelet, der giver basolaterale adgang for elektrofysiologiske optagelser samtidig minimere mekaniske skader. Disse præparater og deres mange modifikationer demonstrerer alsidigheden af frøen sacculus som et modelsystem til biofysiskeundersøgelse af sansehårceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
