Summary
Den amerikanske Bullfrog-tallet (Rana catesbeiana) sacculus tillater direkte undersøkelse av hår-cellefysiologi. Her disseksjon og forberedelse av Bullfrog er sacculus for biofysiske studier er beskrevet. Vi viser representative eksperimenter fra disse hårcellene, herunder beregning av en bunt styrke-fortrengning forhold og måling av sin utvungen bevegelse.
Abstract
Studiet av hørsel og balanse hviler på innsikt trukket fra biofysiske studier av modellsystemer. En slik modell, sacculus av den amerikanske Bullfrog, har blitt en bærebjelke i auditiv og vestibular forskning. Studier av dette organ har avslørt hvor sanseceller hår aktivt kan detektere signaler fra omgivelsene. På grunn av disse studiene, har vi nå bedre forstå den mekaniske gating og lokalisering av et hår cellens transduksjon kanaler, kalsium rolle i mekanisk tilpasning, og identiteten til håret celle strømninger. Denne svært tilgjengelig organ fortsetter å gi innsikt i arbeidet i hårcellene. Her beskriver vi utarbeidelsen av Bullfrog er sacculus for biofysiske studier på sine hårcellene. Vi inkluderer den fullstendige disseksjon fremgangsmåte og tilveiebringe spesifikke protokoller for fremstilling av den sacculus i bestemte sammenhenger. Vi i tillegg omfatte representative resultater ved hjelp av dette preparatet, herunder beregning aven hårbunt største momentane kraftforskyvningsforhold, og måling av en bunt spontane oscillasjon.
Introduction
De acousticolateralis organer av pattedyr har en kompleks arkitektur og ligger innenfor en anatomisk nisje som kan være vanskelig å få tilgang. For eksempel omfatter pattedyr cochlea en spiral labyrint og er integrert i den tykke tinningbenet. Isolering av sneglehuset forårsaker ofte mekanisk skade på sanseceller som ligger innenfor den og har derfor vist seg å være en vanskelig oppgave 1. Nevrologer har dermed snudd til å modellere systemer som er lettere hentet fra sanctum av øret.
En av disse modellsystemer, den sacculus av den amerikanske Bullfrog (Rana catesbeiana), har i flere tiår gitt generaliseres innsikt i funksjon av auditive og vestibulærsystemet. Den sacculus er en blandet funksjon organ med sanse roller i både lavfrekvent hørsel og seismikk sensasjon. Sansecellene i sacculus er dens hårceller, spesialiserte transdusere som konverterer mekanisk energitil elektriske signaler innenfor våre auditive og vestibulære organer. Prosjektering fra den apikale overflaten av hvert hår celle er en mechanosensitive hår pakke som består av en gradert dusk av forstørret microvilli kalt stereocilia. Spissen av tilstøtende stereocilia er innbyrdes forbundet ved trådformede spiss-link proteiner som mekanisk port ionekanaler som respons på mekanisk stimuli 2, 3. Selv om det auditive og vestibular organer svare på forskjellige typer stimuli, de deler en felles deteksjonsmekanisme. Dette alminnelighet ligger til grunn for de mange innsikter fått inn hår-celle mechanotransduction gjennom studier av Bullfrog sacculus. For eksempel har hår cellens aktive prosess blitt studert inngående for dette organ 4, 5, 6, 7, og hårbunten anvender en energikrevende prosess for å produsere mekaniskarbeid. Ikke bare har det vist seg at hårcellene genererer aktivt arbeid 6, men forskjellige mekanismene bak aktiv prosess og et hår cellens tuning egenskaper har blitt avduket gjennom studier av Bullfrog acousticolateralis organer. Disse inkluderer aktiv hår-bunt motilitet 8 og hårcelle elektrisk resonans 9, 10, 11 i sacculus og frekvens selektivitet på håret cellens bånd synapse 12 i den amfibier papilla.
Den Bullfrog er sacculus appellerer til sensoriske nevrologer for mange grunner. I motsetning til pattedyr cochlea, ligger denne organ i lett tilgjengelig otic kapsel. For det andre kan hårcellene i dette organet forbli sunn i flere timer under egnede forhold 13, 14. Dette tillater experimentation på disse cellene over lange tidsskalaer i forhold til sine pattedyr kolleger. Tredje, bærer organ lite kurvatur, tillater enkel manipulasjon. For det fjerde omfatter hvert organ tusen eller flere hårceller 15, noe som gir både en høy kapasitet og en høy sannsynlighet for å finne et passende sett av hårceller for et gitt eksperiment. Til slutt blir den bullfrog s sacculus lett visualiseres på grunn av tynnheten av dette organ og store størrelsen av dens hårcellene.
Disse egenskapene gir stor allsidighet for studiet av sansecellene i Bullfrog er sacculus. Avhengig av spørsmålet på hånden, kan en av flere eksperimentelle preparater fås fra sacculus. Den enkleste av disse er det en kammeret preparat. Her sacculus er immobilisert i et kammer fylt med kunstig perilymph, en natrium-rik og høy kalsiumsaltløsning. Dette preparatet gjør studiet av håret celle strømmer og grunnleggende hår bundle mekanikk. En andre konfigurasjon, to-kammer preparat, kan brukes til å studere spontane hårbunten bevegelser. Her den apikale side av hårceller er utsatt for en kalium-rik og kalsium-fattig saltvann betegnet kunstig endolymph, mens basolateral side er badet i kunstig perilymph. Disse to kamre etterligne in vivo arrangement av salines og tilveiebringe et miljø som gjør at hårbunter å oscillere spontant.
Vi beskriver i denne artikkelen utarbeidelsen av Bullfrog er sacculus for biofysiske studie av sensoriske hårceller. Vi gir først en detaljert skildring av isolering av dette organet fra frosken indre øret. Vi beskriver deretter både en- og to-kammer eksperimentelle forberedelser og inkluderer representative resultater for hver konfigurasjon.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) på The Rockefeller University.
1. Pre-eksperimentell Prespanparation
- Solutions
- Klargjør eugenol løsning (2,5 g · L -1 · kg -1 frosk). Klargjør saltløsninger (tabell 1).
MERK: For en en-kammer forberedelse, forberede kunstig perilymph; for en to-kammer forberedelse, forberede både kunstig perilymph og kunstig endolymph.
- Klargjør eugenol løsning (2,5 g · L -1 · kg -1 frosk). Klargjør saltløsninger (tabell 1).
2. Eksperimentelle Verktøy
- Utarbeidelse av glass stimulering fiber
- Begrens et borsilikatglass kapillær med en elektrode avtrekker i en en-linje trekke med høy varme og høy hastighet. Last trakk kapillært til en solenoid-drevet avtrekker.
- Ta med kapillær tips mot et filament med en glassperlesmeltes på det før kapillære kommer i kontakt med glass bead.
- Slå på filamentet for å smelte enden av kapillæret inn i glassperle. Når en tynn bro av glassformer mellom kapillær og perlen, slå av filament og rundt samme tid aktivere magnet avtrekker.
MERK: Dette vil trekke glasskapillar ved en rett vinkel til lengdeaksen og skape en solid fiber. - Sørge for at fiberens diameter er ikke mer enn 0,5 til 1 mikrometer, og at dens lengde ikke overskrider 100-300 um. Hvis fiber lengde overstiger denne dimensjonen, trimme den med iris saks. Bruk saks som allerede er kjedelig å unngå å skade disseksjon verktøy.
- For å forbedre optisk kontrast, frese belegge fiberen. Bruk en frese belegger med en gull-palladium kilde. Vertikalt laste hver fiber i en frese belegger med sin spisse enden mot kilden. Ta med fiber tips til en avstand på 1 - 2 cm fra gull-palladium kilde.
- Lukkfrese belegger kammer for å danne en forsegling og slå den på. Gjentatte ganger spyle ut luften med argon. Etter spyling av luft, å redusere trykket i kammeret til 10 Pa (70 mTorr).
- Frese pels i 10 s pulser med 10 s forsinkelser over en periode på 120 s.
MERK: Fiber tips vil mørkne over varigheten av denne protokollen hvis frese belegget var en suksess.
- Utarbeidelse av skarpe mikroelektroder
- Trekk et glass kapillær med en intern filament ved hjelp av en en-linje høy varme pull. Elektroder bør ha en motstand på 100 til 300 Megohm når de er fylt med 3 M KCl. Fyll hver elektrode med 3 M KCl.
- Bend hver elektrode tips med microforge å gjengi det vinkelrett på håret celle apikale overflaten når den er montert i forsterkeren heads 16.
- Utarbeidelse av iontoforese pipetter
- Trekk et glasskapillar med en innvendigfilament til en 50 Megohm tips. Fyll med konsentrert oppløst stoff (for eksempel 500 mM gentamicin sulfate).
- Utarbeidelse av aluminium montering torget
- Skjær et 1 cm x 1 cm firkant av aluminiumsfolie. Perforere folie i midten med tuppen av en pithing stang eller annen skarp gjenstand. Forme perforering, slik at det er sirkulær og ca. 1 mm i diameter.
- Fremstilling av vakuum fettfylt sprøyte.
- Fjern stempelet fra en 5 ml sprøyte. Fyll sprøyten fra baksiden med vakuum fett. Skift ut stempelet.
- Utarbeidelse av polytetrafluoretylen lim applikator
- Lag en 2 mm lang aksial kuttet i slutten av en tre applikator pinne. Spalten bør være i sentrum av applikatoren når sett end-on.
- Med skarp saks eller et barberblad, skjære et 2 mm x 4 mm rektangel av polytetrafluoretylen av en plate av 1 mm tykkelse. Bruk et barberblad for å tynne en av de 2 mm lange kantene av polytetrafluoretylen rektangelet. Starter i midten av rektangelet, redusere tykkelsen av rektangelet ved å skjære utover for å danne en skråkant på spissen av rektangelet.
- Sett polytetrafluoretylen rektangel til tre applikator slit slik at den skrå kanten vender bort fra pinnen. Påfør 5 min epoxy til bunnen av polytetrafluoretylen rektangelet for å feste den på plass. La limet applikator for å herde i 1 time ved romtemperatur.
- Fremstilling av nedre halvdel av to-kammer-monterings
- Maskin eller 3D skrive ut den nedre halvdelen av de to-kammer mount (Supplemental fil 2). Identifiserer diameteren forsenkede sirkel 20 mm på den nedre overflate av kammeret.
- Påføre et tynt lag av epoksy til de laterale mest 3 mm av den forsenkede sirkelen. Påfør en 18 mm sirkulært glass dekkglass på epoxy. Tillat epoxy å kurere for enh.
3. Utvinning av indre øret Organs
- Anesthetize en amerikansk Bullfrog ved å plassere den i en liten bøtte som inneholder eugenol bedøvelse løsning for 10 min. Juster volumet av løsningen slik at frosken humero-scapulær felles løgner like over væskeluftgrensesnittet.
- Avlive den bedøvet Bullfrog ved å dobbelt pithing.
- Ta tak i bedøvet frosk med en finger på toppen av sin nese og en annen under kjeven og roter frosken hode fremover.
- Raskt stupe pithing stang inn i skallen hvelvet gjennom foramen magnum, som finnes på midtlinjen mellom frog occipital prosesser.
- Sakte trekke og dreie stangen til tuppen går fra foramen magnum. Tving stangen caudally gjennom ryggvirvel foramina å ødelegge ryggmargen.
- Bekreft at frosken har blitt skikkelig dobbelt pithed ved å observere at dets nedre ekstremiteter er utvidet.
- Ta tak i frosk med en tommel på toppen av nesen og første finger fatte vomerine tennene for bedre stabilitet. Halshogge frosken ved å kutte kjeveledd bilateralt og deretter kutte ortogonalt til rostrocaudal aksen. For å sikre at de indre øret organer i skallen forblir intakt, sørge for at kuttet er hale både tympana.
- Ved hjelp av en stereodissection mikroskop, utføre en midtlinjen skjære gjennom palatinal vev fra vomerine tennene til den bakre omfanget av vev (figur 1A).
- Sever og tydelig med horisontale kutt av skalpell noen muskel liggende under palatal vev for å avsløre den bakre brusk. Etter fjerning av muskelen, observere slikkepinnen form av tinning brusk som danner grensen for otic kapselen.
- Sever columella på sitt kontaktpunkt med otic kapsel brusk.
- Gjentatte ganger barbere tynne lag av denne brusk ved å gjøre shallow horisontale skjærer gjennom det. Unngå dype kutt for å hindre skade på indre øret organer. Dette åpner otic kapselen funnet i lollipop strukturen av tinning brusk (figur 1B). Innenfor otic kapselen er frosk indre øret organer (figur 1C).
- Trim bakre og laterale kanter av otic kapsel, tar seg ikke å skade indre øret organer. Under disseksjon, ofte flyte saltvann over indre øret organer for å sikre at de forblir under vann og hydrert.
- Finn de to sirkulære åpninger i tinningbenet på den mediale tilkobling av brusk til midtlinjen. Kutt ned gjennom den mest mediale åpning til å sprekke tinningbenet.
- Lag en andre nedadgående kutt gjennom otic kapsel på sitt postero-lateral kant. Fjern stykke brusk mellom denne og den forrige kutt for å gi tilgang til de indre øret organer.
- Lirk løs brusk mellom kuttene fra trinn 3.8 ennd 3.9 og klippe det bort fra otic kapsel. Denne handlingen kutter den nærmeste halvsirkelformet kanal, som deretter kan brukes som et håndtak for ytterligere manipulasjoner.
- Ta vare ikke berører sacculus, kutte VIII th hjernenerve.
- Hold ampulla av nærmeste halvsirkelformet kanalen. Forsiktig rotere det indre øret for å avdekke de resterende to halvsirkelformede kanaler. Ved å eksponere hver kanal, bryte den.
- Hold nerve eller en halvsirkelformet kanalen ampulla, trekke ut det indre øret fra hodet og legg den i en skål fylt med kjølt oksygen kunstig perilymph. Fjerning av det indre øret tillater visualisering av passasjene innenfor tinningbenet gjennom hvilken den halvsirkelformede kanaler når passert (figur 1D).
MERK: Gjenta disse trinnene for å hente ut den andre øret.
4. En-kammer Forberedelse
- Isolering av sacculus
- Finn sacculus ved å identifisere sin store white masse otoconia og saccular nerve som ligger på toppen av den (figur 1E). Pass på å ikke fysisk traumatize sacculus under følgende trinn for å opprettholde integriteten til saccular hårceller.
- Trim den halvsirkelformede kanaler for å gjengi det indre øret mer manøvrerbare.
- Fjern det perilymphatic sisternen ligger over det nevrale side av sacculus. Gjør milde kutt rundt omkretsen av sisternen. Neste bryte de små søyler av vev som bro over sisternen membran til nevrale siden av sacculus.
- Fjern det Lagena og dens tilhørende nerve.
- Hold saccular nerve, løfter forsiktig sacculus og skjære gjennom tynn membran av otoconial sac. Som otoconia spill ut av sekken, frigjøre sacculus ved å kutte rundt sin omkrets.
MERK: Etter å ha isolert sacculus, kan de resterende indre øret organer bli frelst hvis ønskelig. Fjerning av sacculus letter identifikasjon av andre strukturer, så somamfibier og basilaris papiller. - Bruk saks eller pinsett for å forsiktig tørke vekk otoconia igjen på sacculus. Pass på å ikke berøre sacculus under denne prosessen.
- Trim eventuelle gjenværende otoconial-sac membran fra sacculus 'edge. Denne membranen har en tendens til å overholde plast og glassflater og fjerning minimerer utfordringer i håndtering av vev.
- Forsiktig flyte saltvann over sacculus med en Pasteur pipette for å fjerne eventuelle gjenværende otoconia (figur 1F).
MERK: Gjenta denne prosedyren for den andre sacculus, som er et speilbilde av den første.
- Fordøyelse og montering
- Bruke den bakre delen av en Pasteur pipette med sin spiss brutt, overføre den isolerte sacculi til en petriskål som inneholder 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV i kunstig perilymph.
MERK: Dette protease behandling fordøyer linkene tethering hver kinociliary pære til otolithicmembran, slik at fjernelse av membranen uten å skade de sensoriske hårbuntene. - Inkuber vevet i 30 minutter ved 22 ° C (eller 35 minutter ved 21 ° C). Overfør hver spaltet sacculus til en åpen front forsøkskammeret og sikre vev med magnetnålene.
- Den saccular makula ligger direkte under otolithic membranen og er den del av sacculus som inneholder hårcellene. Identifisere den og forsiktig fjerne sin liggende otolithic membran med en fin øyenvippe, tar seg ikke å røre saccular makula.
- Bruke den bakre delen av en Pasteur pipette med sin spiss brutt, overføre den isolerte sacculi til en petriskål som inneholder 3 ml 67 mg ∙ L -1 protease XXIV i kunstig perilymph.
5. To-kammer Fremstilling
- Isolering av sacculus
- Isoler sacculus fra indre øret organer som i punkt 4.1.
- Montering og fordøyelse
- Fyll monteringsblokken (Supplemental fil 3) med kunstig perilymph og plasser perforert aluminiumsfolie på en åpning, med to flekker av vakuumfett for å holde den på plass og danner en svak forsegling.
- Overføring en sacculus til folien og sentrere den på toppen av hullet med makula vendt ned og nerve stubben opp.
- Ta av saltvann rundt sacculus med et stykke vridd vev. Veke saltvann for å tørke overflaten av aluminium kvadrat som omgir sacculus.
- Bruk polytetrafluoretylen applikatoren til å gjelde cyanoakrylatlim for å danne en tett forsegling langs grensen mellom kanten av sacculus og aluminium firkantet. Sørg for at hele omkretsen av sacculus er dekket med lim.
MERK: Fortsetter for sakte lar cyanoakrylatlim å krype over nevrale siden av sacculus og til slutt dekke det. Det er derfor viktig å fullføre denne oppgaven raskt. - Plassere en dråpe av saltløsning på toppen av den monterte vev for å herde limet. En tynn film av lim kan dannes på toppen av dråpe saltvann; fjerne den med pinsett.
- fjerne t nøyehan folie fra monteringsblokken. Vend montert vev over slik at macula siden av sacculus vender oppover og flyter det på en kunstig perilymph fylt petriskål.
- Tilsett en dråpe protease XXIV oppløsning på toppen av makula og inkuberes i 30 min ved 22 ° C (eller 35 minutter ved 21 ° C). Fylle den nedre kanalen i to-kammerapparat (Supplemental fil 2) med perilymph og sted vakuum fett rundt det sentrale kammer.
- Plasser folie montert sacculus på det nedre kammer med sin nerve som vender mot kammerets overflate. Legg fett rundt omkretsen av folien.
- Plasser det øvre kammer (Supplemental fil 1) av preparatet på folien, å ta vare for å danne en fullstendig forsegling med vakuumfett. Fyll øvre kammer med boblet kunstig endolymph og fjern forsiktig otolithic membran med en øyenvippe.
Representative Results
Den sensoriske epitel av Bullfrog er sacculus kan brukes i ulike konfigurasjoner for å sondere fysiologi av hårceller. På grunn av at vevet er forholdsvis flat, kan den monteres på både en- og to-kammer preparater. Den ene kammer konfigurasjonen gir et enkelt oppsett for elektrofysiologiske og mikromekaniske opptak av hårceller. De to-kammer forberedelse stedet simulerer både endolymfatiske og perilymphatic avdelinger på henholdsvis apikale og basale sider av hårceller. Disse avdelingene sammen gir en fysiologisk relevant miljø for studiet av mechanotransduction av hårceller.
Følsomheten og transduksjon karakteristikker av hårceller grunn for sin elektriske respons på mekanisk stimulering. For å undersøke disse funksjonene, vi opp samtidig fra en enkelt hår celle posisjonen sin pakke ogcellens reseptor potensial (figur 2). Vi først festet et fleksibelt glassfiber til kinociliary pære av et hår bunt bruk makt pulser. Vi deretter målt håret bunt deplasement bruker doble fotodiode system 2 (figur 2A). Vi samtidig kjøpte håret celle potensial ved impaling cellen med en skarp microelectrode. Vi har oppnådd en forskyvning-respons-kurve ved å plotte toppspenningen respons utløst ved hver mekanisk stimulus mot hårbunten er tilsvarende forskyvning (figur 2B). Håret cellens elektriske respons syrer både positivt og negativt forskyvning ekstrem. Reduksjonen av membranpotensialet med negativ forskyvningstrinn indikerer tilstedeværelsen av en hvilende innover mechanotransduction strøm. Denne hvilestrøm moduleres ved innvirkning av Ca 2+ på både hurtig og langsom tilpasning 17, 18, 19, 20, 21.
En hår celle atferd avhenger ikke bare på sine elektriske egenskaper, men også på de micromechanics av sin sanse hår bundle. De to-kammerkonfigurasjonsetterligner separasjon av endolymph og perilymph in vivo, og gir ideelle forhold for studiet av et hår bunt mekanikere. Under disse betingelser og med det otolithic membranen fjernet, kan hårbunter svinge spontant 6. Her anvendes vi to-kammer forberedelse for å vurdere de mikromekanikk de enkelte bunter. Vi registrerte spontane svingninger av et hår bundle ved å kaste sin skygge på en dual-fotodiode forskyvning monitor (figur 3). For å vurdere rollen til den aminoglykosidantibiotikum gentamicin på mechanotransduction, vi iontoforetisk rele ased gentamicin direkte på hårbunten (figur 3). Konsentrasjonen av frigjort gentamicin stiger proporsjonalt med den strøm føres gjennom mikropipette. Gentamicin hemmer et hår bunt er svingninger og induserer en statisk oppveid av bunten mot sin høye side. Disse effektene gjenspeiler rollen som gentamicin som en åpen kanal blokker som holder åpen tilstand av mechanotransduction kanaler mens blokkerer deres trengning pore. Iontoforese av ladede kjemikalier tillater lokalisert og kvantifiserbare utslipp av kjemikalier i forskjellige konsentrasjoner i fravær av fluidstrøm-indusert mekanisk ødeleggelse, og er derfor ideelt egnet for studier av mechanosensitive organeller som hårbunten 22.
En hår bundle spontane bevegelser oppstår fra samspillet mellom tilpasning og ikke-lineær bunt stivhet 7,xref "> 8, 23, 24. Denne spontane bevegelse er en signatur av en hårbunt pågående prosess, som konverterer signalenergi til mekanisk arbeid for å overvinne viskøst drag. hårbunter har vist seg å oppvise ikke-lineære momentant stivhet i vestibular 2, hørbar 25, og lateral linjer systemer 26.
Vi direkte målte momentane stivhet fra en individuell hårbunten fra bullfrog s sacculus (figur 4). For å oppnå dette kombinert vi spissen av et glassfiberforsterket plast til hårbunten er kinociliary pære (figur 4A). Vi leverte kreftene til håret bunt ved å forskyve fiber base. Den kraft som utøves på hårbunten ved stimulans fiberen tilsvarer differansen mellom de forskyvninger av fiber sin base og spiss, multiplisert med fiberens stivhet 2, 27. Levere pulser tvers av en rekke styrker avslører en sammenheng mellom kraften som utøves på bunten og bunten er påfølgende fortrengning. Helningen av denne kraftforskyvnings forhold svarer til hårbunten største momentane stivhet (figur 4A).
Denne metoden tillot oss å måle en enkelt bunt største momentane stivhet som en funksjon av dens avbøyning (figur 4B). Den øyeblikkelige kraft-forskyvningskurve viser et ikke-lineært forhold, avslører en ulineær stivhet av bunten over et område på omtrent 20 nm rundt sin hvilestilling. Utenfor dette området, oppfører håret bunt som en Hookean materiale, er dens stivhet lineær for stor-magnitude nedbøyninger.
Disse resultatene demonstrerer atrangere allsidighet av Bullfrog sacculus i studiet av hår-cellefysiologi. Ved hjelp av disse og andre preparater, kan man utforske mechanotransduction ved flere trinn i overføringen av informasjon fra bunten mot hjernen.
Figur 1: Disseksjon av Bullfrog Inner Ear. (A) Vise Bullfrog øvre gane fra sin ventral side tillater identifikasjon av øretrompeten (sirkel). Lateral refleksjon av huden som dekker den høyre side av den øvre gane viser plasseringen av det indre øret (stiplet boks). (B) Fjerning av brusk på ventral side av frosken tinningbenet åpner otic kapsel (stiplet linje). (C) viser at det er en høyere forstørrelse av otic kapsel, i hvilken sacculus, Lagena, CN VIII, og sacc ular nerve lett kan identifiseres. (D) En visning av otic kapsel etter fjerning av indre øret organer avslører plasseringen av de halvsirkelformede kanaler. (E) Etter fjerning av det isolerte indre øret, den sacculus, Lagena, og VIII th hjernenerven (CN VIII) kan lett bli identifisert. (F) Den isolerte sacculus besitter en kort stump av saccular nerve og en otolithic membran som ligger på toppen av sin sensorisk epitel. Etiketter svare til (i) sacculus, (ii) Lagena, (iii) CN VIII, (iv) saccular nerve, og (v) otolithic membran. Axis etiketter P og A tilsvarer henholdsvis bakre og fremre retninger. Skala stolper representerer 1 cm (A, B), 1 mm (C, D, E) og 400 um (F).
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
s "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned en vektorversjon av dette tallet.
Figur 2: Displacement-responskurve for et eneste hår Cell. (A) Tuppen av et glass stimulus fiber ble koblet til den kinociliary pære av en hårbunt og fiber base ble deretter forflyttes på tvers av ni diskrete trinn. Bunten posisjon ble sporet på en dual-fotodiode system, og dens reseptor potensiale ble samtidig målt ved anvendelse av en mikroelektrode hvis utgang er ført gjennom en forsterker i bridge-modus. Elektroden tips motstand var 95 Megohm og bunten hvilemembranpotensialet var -47 mV. (B) Et plott av bunten s reseptoren potensial som en funksjon av dens forskyvning avslører en ikke-lineær sammenheng mellom bunten respons og densposisjon. Hvert punkt svarer til middelpotensialet og mener forskyvning over en 2,5 ms tidsvinduet, som begynner 2,5 ms etter starten av mekanisk stimulering. Hver farge representerer et sett av tidsserier som tilsvarer den samme forskyvning puls.
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Klikk her for å laste ned en vektorversjon av dette tallet.
Figur 3: Effekt av Gentamicin på Spontan Hair Bundle Oscillation. Den spontane bevegelse av en hårbunt i et to-kammer preparatet ble registrert ved anvendelse av en dobbelt fotodiode system. I fravær av iontoforetisk frigjøring av gentamycin (0-Na), håretbunt viser symmetriske svingninger. Etter hvert som størrelsen av strømmen føres gjennom et iontoforetisk pipette fylt med 500 mM gentamicinsulfat vokser (10 nA, 20 nA), blir frekvensen av hår-bunt oppdage faller på en doseavhengig måte, og bunten blir forskjøvet mot dens høye kant lenger perioder.
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Klikk her for å laste ned en vektorversjon av dette tallet.
Figur 4. Beregne en Hair Bundle er Momentant Stivhet. (A) En stimulus fiber (rød) av stivhet K F er koplet to kinociliary pære (brun) fra et hår bundle (gul). Fortrenge bunnen av fiberen en kjent avstand X F bevirker at bunten til å bevege seg en distanse X-B. Forskjellen mellom de forskyvninger av fiber og bunten er proporsjonal med den kraft som utøves på bunten av stimulus fiber, F F. Repetisjon av denne på tvers av en rekke krefter gir en momentan kraft-forskyvnings forhold (til høyre), helningen av hvilke svarer til hårbunten er momentan stivhet. (B) En individuell bunt ble underkastet tvinge pulser med økende størrelse og dens forskyvning i løpet av de første 50 ms etter pulsen utbruddet ble målt (blå punkter). Her hårbunten viser en ikke-lineær momentant stivhet over et område på omtrent 20 nm i området rundt sin hvilestilling. Den røde kurven svarer til en tilpasning til forhold F = k * X - 60 * z * (1 / (1 + exp (- z * (X - X 0) / (k B * T))) + F 0, hvor F er den kraft som påføres bunten, X er bunten s forskyvning, k = 790 ± 51 μN ∙ m -1 er bunten konstant stivhet når alle kanalene er enten stengt eller åpen, z = 0,43 ± 0,04 pN er kraften av en enkelt gating våren, X 0 = 2 ± 1,9 nm er bunten posisjon hvor 50% av sine kanaler er åpne, er Boltzmann s k B konstant, T er temperaturen, og F 0 = 11,7 ± 1,3 pN er en offset kraft. Passformen besitter en koeffisienten på 0,98. Stimulans fiber hadde en stivhet på 107 μN ∙ m -1.
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned en vektorversjon av dette tallet.
| oppløst stoff | Formel vekt (g / mol) | Legg til en L | |
| kunstig perilymph | kunstig endolymph | ||
| NaCl | 58.4 | 6,54 g | 0,117 g |
| KCl | 0,149 | 0,149 g | 8,62 g |
| CaCl 2 ⦁ 2H 2 O | 147 | 2 ml av 1 M CaCl2 lager | 250 ul av 1 M CaCl2 lager |
| HEPES | 238,3 | 1,19 g | 1,19 g |
| D - (+) - glukose | 180,2 | 0,541 g | 0. 541 g |
Tabell 1. Løsninger for Dissection og eksperimentell forberedelse. Vist i denne tabellen er de oppskrifter for kunstig perilymph og kunstige endolymph løsninger som brukes i disseksjon og i ett- eller to-kammer forberedelser. Oppløsningene bør bringes til pH 7,2 til 7,4 med omkring 2 ml av NaOH (perilymph) eller 2 ml KOH (endolymph). Det osmotiske styrke bør lese ca 230 mmol · kg -1 på grunn av ufullstendig ionisk dissosiasjon.
Discussion
Innenfor Bullfrog er sacculus ligge flere tusen lett tilgjengelige sensoriske hårceller. Her viser vi utvinning og forberedelse av sacculus for en- og to-kammer opptak. Disse to preparater tillate både mikromekaniske og elektrofysiologiske studier av hårceller og tilhørende bunter. På grunn av at vev kan overleve i flere timer med hyppig utskifting av oksygenert saltvann, kan eksperimenter fortsette i lang varighet. Hårcellene i disse preparatene vanligvis være levedyktig i microelectrode opptak i opptil 6 timer etter disseksjon, mens hårbunter oscillere spontant i opptil 24 timer etter ekstraksjon.
Vellykket utvinning og montering av sacculus hengsler på surmounting flere felles utfordringer. Først bør direkte kontakt med den apikale overflate av saccular makula unngås hele fremstillingsprosedyren. Den saccular nerve gir en praktisk håndtak for sikker manipuning av sacculus. Når frigjort fra resten av den indre øret organer, bør sacculus overføres ved hjelp av en stor boring pipette mens resten neddykket i væske for å unngå mekanisk skade på sin sensorisk epitel. Fjerning av otoconia fra macula overflaten må være fullført uten mekanisk skade på hårcellene. Fordi otoconia ligge rett oppå makula, kan hårcellene bli skadet av utilsiktet kontakt mellom disseksjon verktøy og otolithic membranen mens du fjerner otoconia. For å unngå skader, anbefaler vi at den geléaktige massen av otoconia bli holdt på et sted langt fra makula og fjernes som en enkelt masse. Dette unngår fragmentering av otoconial massen til en rekke grupper, som hver kan være individuelt utvinnes. Hvis små klynger av otoconia forblir de kan fjernes med en forsiktig fluidtrykk som leveres av en Pasteur pipette. En siste utfordring innebærer dannelsen av en tett forsegling mellom sacculus og aluminium montering torg itokammer-preparat. Anvendelse av en firkant med en perforering liten nok til å tillate overlapping på omtrent 100 um mellom sacculus og de omkringliggende aluminiums tillater fullstendig forsegling av vevet. Limet bør bringes i kontakt med omtrent 100 um av saccular vevet rundt makula sin omkrets for å danne en tett forsegling.
Konsentrasjonen av fri Ca 2+ er en viktig faktor i studiet av hårceller. Ca 2 + regulerer både hurtig og langsom tilpasning, og dermed bestemme kinetikken til mechanotransduction anordningen og egenskapene til hårbunten aktive-prosess fenomener, inkludert spontan bevegelse bunt 8, 23. Endolymfatiske kalsium in vivo er tilstede på 250 mikrometer, derfor de fysiologisk relevant kinetikk er vurdert til denne konsentrasjonen (Maunsell JHR, R. Jacobs, og AJ Hudspeth. UnpublisHed observasjoner 16). Men microelectrode opptak fra hårcellene krever en ekstern kalsiumkonsentrasjonen overstiger 2 mm for riktig tetting av cellemembranen rundt microelectrode. Det er derfor viktig å benytte en høy kalsiumsaltoppløsning for disse eksperimentene. Endelig kan man ønsker å studere effektene av ekstern kalsium ved mechanotransduction hjelp av en rekke kalsiumkonsentrasjoner. I disse tilfellene er det viktig å huske at kalsium konsentrasjoner under 1 mikrometer vanligvis føre til tip-link brudd og irreversibelt tap av transduksjon 28.
De to eksperimentelle forberedelsene beskrevet her gi rom for en rekke biofysiske målinger på hårcellene. Imidlertid kan flere målinger tas med små modifikasjoner til disse preparatene. I foldet saccular forberedelse, er hår bunter visualisert sidelengs. Imaging hår-bundle bevegelse fra dette utsiktspunktet avslører sammenhengende motion av både korte og høye stereocilia 29. Her saccular makula først skilt fra sin underliggende vev og deretter brettet langs aksen definert av saccular nerve slik at hår bunter ansikt utad og er visualisert lateralt på bretten. En annen endring, hår-celle dissosiasjon, gjør studiet av både hår cellens bunt og dens soma. Hårcellene er mekanisk dissosiert på en glassplate for bildebehandling og elektrofysiologisk registrering 30. Endelig kan hårceller ekstruderes fra epitelet ved å følge en lignende dissosiasjon protokoll, men uten mekanisk dissosiasjon trinnet. Denne behandlingen resulterer i hårcellene som gradvis Extrude ut av epitel, som gir basolateral tilgang for elektrofysiologiske opptak mens mekaniske skader minimeres. Disse preparatene og deres mange modifikasjoner demonstrere allsidigheten frosken sacculus som modellsystem for biofysiskestudie av sensoriske hårceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
