Summary
Den amerikanska Bullfrog s (Ranacatesbeiana) säcken tillåter direkt undersökning av hår-cellfysiologi. Här dissekering och beredning av Bullfrog är säcken för biofysiska studier beskrivs. Vi visar representativa experiment från dessa hårceller, inklusive beräkning av en bunt på kraftförskjutnings förhållande och mätning av dess otvungen rörelse.
Abstract
Studiet av hörsel och balans vilar på insikter dras från biofysiska studier av modellsystem. En sådan modell, säcken av den amerikanska Bullfrog, har blivit en stöttepelare för hörsel- och vestibulära forskning. Studier av detta organ har avslöjat hur sensoriska celler hår kan aktivt detektera signaler från omgivningen. På grund av dessa studier, har vi nu bättre förstå den mekaniska grind och lokalisering av ett hår cellens överföringskanaler, kalcium roll i mekanisk anpassning, och identiteten av hår cellströmmar. Denna mycket tillgängliga organ fortsätter att ge insikt i hur hårcellerna. Här beskriver vi framställningen av Bullfrog är säcken för biofysiska studier på dess hårcellerna. Vi inkluderar hela dissektion förfarande och ger särskilda protokoll för framställning av säcken i specifika sammanhang. Vi inkluderar dessutom representativa resultat med detta preparat, inklusive beräkning avett hår bunt momentana kraftförskjutnings förhållande och mätning av en bunt spontana svängning.
Introduction
De acousticolateralis organ däggdjur har en komplex arkitektur och ligger inom en anatomisk nisch som kan vara svåra att komma åt. Till exempel innefattar däggdjurs snäckan en spiral labyrint och är inbäddad i den tjocka tinningbenet. Isolering av koklea orsakar ofta mekanisk skada på sinnesceller som ligger inom det och har därför visat sig vara en svår uppgift 1. Neuroforskare har alltså vänt för att modellera system som är mera lätt extraheras från kärna i örat.
En av dessa modellsystem, i säcken av den amerikanska oxgroda (Ranacatesbeiana), har i årtionden gett generaliserbar insikt funktionen hos hörsel och balansorgan. Den säcken är en blandad funktion orgel med sensoriska roller i både lågfrekvent hörsel och seismiska sensation. De sinnesceller i säcken är dess hårceller, specialiserade omvandlare som omvandlar mekanisk energitill elektriska signaler inom våra hörsel och vestibulära organ. Utskjutande från den apikala ytan på varje hårceller är en mechanosensitive hår bunt som innefattar en graderad tofs av förstorad mikrovilli kallas stereocilier. Spetsarna på intilliggande sinneshår är sammankopplade genom tråd tip-link proteiner som mekaniskt gate jonkanaler som svar på mekanisk stimuli 2, 3. Även hörbara och vestibulära organ svarar på olika typer av stimuli, de delar en gemensam mekanism upptäckt. Denna gemensamhet ligger till grund för de många insikter i hår-cells mechanotransduction genom studier av Bullfrog säcken. Till exempel, har håret cellens aktiv process studerats i stor utsträckning i detta organ 4, 5, 6, 7, och håret bunt utnyttjar en energikrävande process för att producera mekaniskarbete. Inte bara har det visat sig att hårceller generera aktivt arbete 6, men tydliga mekanismer som ligger bakom den aktiva processen och ett hår cellens tuning egenskaper har avtäckt genom studier av Bullfrog acousticolateralis organ. Dessa innefattar aktiva hår-bunt motilitet 8 och hårceller elektrisk resonans 9, 10, 11 i säcken och selektivitet frekvens vid håret cellens band synaps 12 i amfibie papillen.
Bullfrog är säcken tilltalar sensoriska neuroforskare för många skäl. Till skillnad från däggdjur snäckan, ligger detta organ inom den lättillgänglig öron kapsel. För det andra, kan hårcellerna i detta organ förblir friska under flera timmar under lämpliga förhållanden 13, 14. Detta tillåter experimentatjon på dessa celler över långa tidsperioder i förhållande till deras däggdjurs motsvarigheter. För det tredje, bär organ lilla krökningen, medger enkel hantering. För det fjärde innefattar varje organ tusen eller flera hårceller 15, som ger både en hög genomströmning och en hög sannolikhet för att lokalisera en lämplig uppsättning hårceller för ett givet experiment. Slutligen oxgroda s säcken lätt visualiseras på grund av den tunnhet i detta organ och stora storleken på dess hårceller.
Dessa egenskaper ger stor mångsidighet för studier av sensoriska celler i Bullfrog är säcken. Beroende på frågan till hands, kan en av flera experimentella preparat erhållas från säcken. Den enklaste av dessa är den en-kammar beredning. Här säcken är fixerad i en kammare fylld med artificiell perilymfa, en natrium-rik och hög kalcium saltlösning. Denna beredning möjliggör studier av hår cellströmmar och grundläggande hår bunt mekanik. En andra konfiguration, den två-kammar beredning kan användas för att studera spontana hårknippet rörelser. Här den apikala sidan av hårceller utsätts för en kalium rik och kalcium fattiga saltlösning kallas artificiell endolymfan, medan den basolaterala sidan badar i artificiell perilymfa. Dessa två fack härma arrangemanget in vivo av saltlösningar och ger en miljö som tillåter hårknippena att oscillera spontant.
Vi beskriver i detta dokument beredningen av Bullfrog är säcken för biofysiska studier av dess sensoriska hårceller. Vi tillhandahåller först en detaljerad skildring av isolering av detta organ från grodans innerörat. Vi beskriver sedan både en- och två-kammar experimentella preparat och inkluderar representativa resultat för varje konfiguration.
Protocol
Etik uttalande: Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Rockefeller University.
1. Pre-experimentella Prespanparation
- lösningar
- Förbered eugenol lösning (2,5 g · L -1 · kg -1 groda). Förbered saltlösningar (tabell 1).
OBS: För en kammare förberedelser, förbereda artificiell perilymfa; för ett tvåkammarsystem förberedelser, förbereda både artificiell perilymfa och artificiell endolymfan.
- Förbered eugenol lösning (2,5 g · L -1 · kg -1 groda). Förbered saltlösningar (tabell 1).
2. Experimentella Verktyg
- Framställning av glas stimulering fiber
- Begränsa en borosilikatglas kapillär med en elektrod avdragare i en enradig pull med hög värme och hög hastighet. Ladda drog kapillär i en magnetdriven avdragare.
- Bringa kapillären spets mot ett filament med en glaspärlasmält på den tills kapillär kontakt med glaspärla.
- Slå på glödtråden för att smälta spetsen av kapillären in i glaspärla. När en tunn bro av glasformer mellan kapillär och pärlan, stänga av glödtråden och ungefär samtidigt aktivera magnet avdragare.
OBS: Detta kommer att dra glaskapillär i rät vinkel mot dess längdaxel och skapa en solid fiber. - Se till att fibern diameter är inte mer än 0,5 till 1 ^ m och att dess längd inte överstiger 100-300 | im. Om fiberns längd överstiger denna dimension, trimma det med iris sax. Använd sax som redan tråkig att undvika skador på dissektion verktyg.
- För att öka optisk kontrast, spotta belägga fibern. Använd en sputter beläggaren med en guld-palladium källa. Vertikalt ladda varje fiber i en sputter beläggaren med sin avsmalnande ände mot källan. Ta fiberns spets till ett avstånd av 1 - 2 cm från guldpalladiumkälla.
- Stängspotta bestrykare kammare för att bilda en tätning och slå på den. spola flera gånger ut luften med argon. Efter spolning luften, minska trycket inuti kammaren till 10 Pa (70 mTorr).
- Spotta kappa i 10 s pulser med 10 s förseningar över en kurs av 120 s.
OBS: Fiber spets kommer att mörkna under hela detta protokoll om sputterbeläggning var en framgång.
- Framställning av skarpa microelectrodes
- Dra ett glas kapillär med en inre filament med hjälp av en linje med hög värme pull. Elektroder bör ha en resistans på 100-300 Mohm när den är fylld med 3 M KCl. Fyll varje elektrod med 3 M KCl.
- Böj varje elektrod spets med microforge för att göra det vinkelrätt mot hårceller apikala yta när den är monterad i förstärkaren huvudsteg 16.
- Framställning av jontofores pipetter
- Dra ett glas kapillär med en inretråden till en 50 MQ spets. Fyll med koncentrerad lösta (t.ex. 500 mM gentamicinsulfat).
- Framställning av aluminium monterings kvadrat
- Skär en 1 cm x 1 cm i fyrkant av aluminiumfolie. Perforerar folien i mitten med spetsen på en nackstick stav eller annat vasst föremål. Forma perforeringen, så att den är cirkulär och ungefär 1 mm i diameter.
- Framställning av vakuum fett fylld spruta.
- Avlägsna kolven från en 5 ml spruta. Fyll sprutan från baksidan med vakuum fett. Ersätta kolven.
- Framställning av polytetrafluoreten limapplikator
- Göra en 2 mm lång axiell skuren i slutet av en trä applikator pinne. Slitsen bör vara i centrum av applikatorn när den betraktas end-on.
- Med vass sax eller ett rakblad, skär ett 2 mm x 4 mm rektangel av polytetrafluoreten från ett ark av ett mm tjocklek. Använda ett rakblad för att förtunna en av de 2 mm långa kanterna av polytetrafluoreten rektangel. Med början i mitten av rektangeln, minska tjockleken av rektangeln genom skärning utåt för att bilda en avfasning vid spetsen av rektangeln.
- Sätt polytetrafluoretylen rektangel i trä applikatorn slitsen så att den fasade kanten är vänd bort från pinnen. Applicera 5 min epoxi basen av polytetrafluoretylen rektangeln för att säkra det på plats. Tillåt limapplikatorn härda under 1 timme vid rumstemperatur.
- Framställning av nedre halvan av två kammare fäste
- Maskin eller 3D skriva ut den nedre halvan av den två-kammar mount (Supplemental fil 2). Identifiera diametern försänkta cirkel 20 mm på den undre ytan av kammaren.
- Applicera ett tunt skikt av epoxi till sido mest 3 mm av det försänkta cirkeln. Applicera en 18 mm cirkulär täckglas på epoxi. Låt epoxin härda för enh.
3. Extraktion av innerörat organ
- Söva en amerikansk oxgroda genom att placera det i en liten hink som innehåller eugenol bedövningsmedel lösning under 10 minuter. Justera volymen på lösningen så att grodans humero-skulderblad gemensamma ligger strax ovanför vätskeluftgränssnittet.
- Euthanize bedövades oxgroda genom att dubbelnackstick.
- Ta tag i sövda groda med ett finger ovanpå nosen och en annan under käken och rotera groda huvud framåt.
- Snabbt störta nackstick stången i skalle genom foramen magnum, som finns vid mittlinjen mellan grod occipital processer.
- Långsamt dra tillbaka och rotera stången tills dess spets avviker från foramen magnum. Tvinga stången kaudalt genom vertebral foramina att förstöra ryggmärgen.
- Kontrollera att grodan har blivit ordentligt dubbelt pithed med att konstatera att dess nedre extremiteterna förlängs.
- Ta tag i grodan med en tumme ovanpå näsan och första finger tag i vomerine tänder för förbättrad stabilitet. Halshugga grodan genom att bryta käkleden bilateralt och därefter skära vinkelrätt mot rostrocaudal axeln. För att säkerställa att innerörat organ inom skallen intakt, se till att snittet är kaudalt både tympana.
- Med användning av en stereodissection mikroskop, exekvera en mittlinje skär genom palatal vävnad från vomerine tänder för att den mest posteriora utsträckningen av vävnad (Figur 1A).
- Sever och tydlig med horisontella nedskärningar av skalpell någon muskel som ligger under palatal vävnad för att avslöja den bakre brosk. Efter avlägsnande av muskeln, observera klubba formen på den temporala broskbildande gränsen för den otiska kapseln.
- Sever Columella vid dess kontaktpunkt med öron kapselns brosk.
- Upprepade gånger raka tunna skikt av detta brosk genom att shallow horisontella snitt genom det. Undvik djupa snitt för att förhindra skador på innerörat organ. Detta öppnar öron kapseln inom klubba struktur tids brosk (Figur 1B). Inom öron kapsel är grodinnerörat organ (Figur 1C).
- Trimma den bakre och sidokanter öron kapsel, noga med att inte skada innerörat organ. Under dissektion ofta flöde saltlösning över innerörat organ för att säkerställa att de förblir nedsänkt och hydrerad.
- Lokalisera de två cirkulära öppningar i tinningbenet på den mediala anslutning av brosk med mittlinjen. Skär nedåt genom de mediala öppning att spräcka tinningbenet.
- Gör en andra nedåt snitt genom öron kapseln vid dess postero-laterala kant. Ta bort bit brosk mellan detta och den tidigare snittet för att ge tillgång till innerörat organ.
- Bända loss brosk mellan snitten från steg 3,8 aND 3,9 och skär den bort från öron kapseln. Denna åtgärd avskär den närmaste halvcirkelformad kanal, som sedan kan användas som handtag för ytterligare manipulationer.
- Noga med att inte röra vid säcken, kapa VIII: e kranialnerven.
- Håll ampull av den närmaste halvcirkelformade kanalen. Rotera försiktigt innerörat för att exponera de återstående två båggångarna. Vid exponering varje kanal, bryta den.
- Håll nerv eller en halvcirkelformad kanal ampulla, extrahera innerörat från huvudet och placera den i en skål fylld med kyld syre artificiell perilymfa. Avlägsnande av innerörat medger visualisering av passagerna inom temporalbenet genom vilken båggångarna gång passerat (figur 1D).
OBS: Upprepa dessa steg för att extrahera den andra örat.
4. En kammare Beredning
- Isolering av säcken
- Leta upp säcken genom att identifiera dess stora dugge massa otoconia och saccular nerv som ligger ovanpå det (figur 1E). Se till att inte fysiskt traumatize säcken under de följande stegen för att bibehålla integriteten hos saccular hårceller.
- Trimma båggångarna att göra innerörat mer lättmanövrerad.
- Avlägsna perilymphatic cisternen ligger över neurala sidan av säcken. Göra mjuka skär runt omkretsen av cisternen. Nästa bryta de små pelare av vävnad som brygga cisternen membran till det neurala sidan av säcken.
- Avlägsna Lagena och dess tillhörande nerv.
- Håll saccular nerv, lyfter försiktigt säcken och skär genom det tunna membranet i otoconial sac. Som otoconia spill ur säcken, befria säcken genom att skära runt dess omkrets.
OBS: Efter att isolera säcken, kan de återstående innerörat organ sparas om så önskas. Avlägsnande av säcken underlättar identifiering av andra strukturer, såsomamfibie och basilar papiller. - Använd sax eller pincett för att försiktigt torka bort någon otoconia kvar på säcken. Se till att inte röra vid säcken under denna process.
- Trimma eventuellt kvarvarande otoconial-sac membran från säcken "kant. Detta membran tenderar att hålla sig till plast- och glasytor och borttagning minimerar utmaningar i hanteringen av vävnaden.
- Försiktigt flöde saltlösning över säcken med en pasteurpipett för att avlägsna eventuella kvarvarande otoconia (figur 1F).
OBS: Upprepa denna procedur för den andra säcken, som är en spegelbild av den första.
- Matsmältning och monterings
- Använda den bakre änden av en pasteurpipett med sin spets bruten, överföra den isolerade sacculi till en petriskål med 3 ml 67 mg ∙ L -1 proteas XXIV i artificiell perilymfa.
OBS: Detta proteas behandling smälter länkarna tjudra varje kinociliary lampa till otolithicmembran, vilket möjliggör avlägsnande av membranet utan att skada de sensoriska hörsel buntar. - Inkubera vävnaden i 30 min vid 22 ° C (eller 35 min vid 21 ° C). Överför varje diger säcken till en open-faced experimentell kammare och säkra vävnaden med magnetiska stift.
- Den saccular makula ligger direkt under den otolithic membranet och är den del av den säcken som innehåller hårceller. Identifiera den och försiktigt bort sin liggande otolithic membran med en fin ögonfransar, noga med att inte röra saccular makula.
- Använda den bakre änden av en pasteurpipett med sin spets bruten, överföra den isolerade sacculi till en petriskål med 3 ml 67 mg ∙ L -1 proteas XXIV i artificiell perilymfa.
5. Två kammare Beredning
- Isolering av säcken
- Isolera säcken från innerörat organ som i punkt 4.1.
- Montering och matsmältning
- Fyll monteringsblocket (Supplemental fil 3) med artificiell perilymfa och placera den perforerade aluminiumfolie på en öppning, med hjälp av två fläckar av vakuumfett för att hålla den på plats och bilda en svag försegling.
- Transfer en säcken till folien och centrera den på toppen av hålet med gula fläcken nedåt och nerven stubben uppåt.
- Ta bort saltlösning kring säcken med en bit tvinnad vävnad. Veken den saltlösning för att torka ytan av kvadraten aluminium omger säcken.
- Använd polytetrafluoretylen applikatorn att tillämpa cyanoakrylatlim för att bilda en tätning längs gränsen mellan kanten på säcken och aluminium torget. Säkerställa att hela omkretsen av säcken är täckt med lim.
OBS: Fortsätter alltför långsamt låter cyanoakrylatlim att krypa över neurala sidan av säcken och slutligen täcka det. Det är därför nödvändigt att slutföra denna uppgift snabbt. - Placera en droppe saltlösning ovanpå den monterade vävnad för att härda limmet. En tunn film av lim kan bildas på toppen av droppen av saltlösning; ta bort det med pincett.
- Försiktigt bort than folie från monteringsblocket. Vänd den monterade vävnaden över så att macular sidan av säcken är vänd uppåt och flyter det på en konstgjord perilymfa fyllda petriskål.
- Tillsätt en droppe av proteas XXIV lösningen på toppen av makula och inkubera under 30 minuter vid 22 ° C (eller 35 min vid 21 ° C). Fyll den nedre kanalen i två-kammarapparat (Supplemental fil 2) med perilymfa och plats vakuum fett runt den centrala kammaren.
- Placera folien monterade säcken på den undre kammaren med sin nerv vänd mot kammarens yta. Lägga fett runt omkretsen av folien.
- Placera den övre kammaren (Supplemental fil 1) av preparatet på folien, var noga med att bilda en fullständig tätning med vakuum fett. Fyll den övre kammaren med bubblade artificiell endolymfan och försiktigt bort otolithic membran med en ögonfrans.
Representative Results
Den sensoriska epitelet i oxgroda s säcken kan användas i olika konfigurationer för att sondera fysiologi hårceller. Eftersom vävnaden är relativt platt, kan den monteras i både en- och två-kammar preparat. konfiguration en kammare ger en enkel installation för elektrofysiologiska och mikromekaniska inspelningar av hårceller. De två kammare förberedelse simulerar istället både endolymphatic och perilymphatic fack på respektive de apikala och basala sidor av hårceller. Dessa avdelningar tillsammans ger en fysiologiskt relevant miljö för studiet av mechanotransduction av hårceller.
Känsligheten och överföringsegenskaperna hos hårcellerna bakom sin elektriska svar på mekanisk stimulering. Att undersöka dessa funktioner, vi samtidigt spelats in från en enskild hårceller ställning dess bunt ochcellens receptorpotential (Fig 2). Vi fäst först en flexibel glasfiber till kinociliary lampan av en hår bunt att tillämpa kraftpulser. Vi mätte därefter hårknippet deplacement användning av ett dubbelfotodiod-system 2 (Figur 2A). Vi förvärvade samtidigt håret cellens potential genom att spetsa cellen med en vass mikroelektrod. Vi erhöll en förskjutning-responskurva genom att plotta toppspänningen som förvärvas vid varje mekanisk stimulering mot hårknippet s motsvarande förflyttning (figur 2B). Håret cellens elektriska svaret mättar för både styrd och negativa förskjutning extrema. Reduktionen av membranpotential med negativa förskjutningssteg indikerar närvaron av en vilande inåt mechanotransduction ström. Detta vilande ström moduleras genom inverkan av Ca 2+ på både snabb och långsam anpassning 17, 18, 19, 20, 21.
Ett hår cellens beteende beror inte bara på dess elektriska egenskaper, men också på de mikromekanik för dess sensoriska hår bunt. De två-kammarkonfiguration härmar separation av endolymfan och perilymfa in vivo, vilket ger idealiska förhållanden för att studera ett hår bunt mekanik. Under dessa förhållanden och med otolithic membranet avlägsnas, kan hårknippena svänga spontant sex. Här använde vi två kammare förberedelser för att utvärdera mikromekanik enskilda buntar. Vi spelade in spontana svängningar i ett hår bunt genom gjutning dess skugga på en dubbel-fotodiod förskjutning monitor (Figur 3). För att bedöma rollen av aminoglykosidantibiotika gentamicin på mechanotransduction, vi jontoforetiskt rele ased gentamicin direkt på håret bunt (figur 3). Koncentrationen av frisatt gentamicin ökar proportionellt med strömmen passerade genom mikropipetten. Gentamicin hämmar ett hår bunt s svängningar och inducerar en statisk förskjutning av bunten mot dess höga sida. Dessa effekter återspegla rollen av gentamicin som en öppen-kanalblockerare som upprätthåller det öppna tillståndet för mechanotransduction kanaler och blockerar deras permeation por. Jontofores av laddade kemikalier tillåter lokaliserad och kvantifierbar utsläpp av kemikalier vid olika koncentrationer i frånvaro av fluidumflöde-inducerad mekanisk sönderdelning och är således idealiskt lämpad för studier av mechanosensitive organeller såsom håret knippet 22.
Ett hår bunt spontana rörelser härrör från samspelet mellan anpassning och icke-linjära bunt styvhet 7,xref "> 8, 23, 24. Denna spontana rörelse är en signatur av en hår bunt aktiva process som omvandlar signalenergi till mekaniskt arbete för att övervinna visköst motstånd. hårknippena har visat sig uppvisa icke-linjära momentana stelhet i vestibulära 2, hörsel 25, och lateral-line-system 26.
Vi mätte direkt den momentana styvheten hos en enskild hår bunt från Bullfrog är säcken (Figur 4). För att uppnå detta, i kombination vi spetsen av en flexibel glasfiber till håret bunt s kinociliary bulb (Figur 4A). Vi levererade krafter på håret bunt genom att förskjuta fibern bas. Den kraft som utövas på håret bundle av stimulus fibern motsvarar skillnaden mellan de förskjutningar av fiberns base och dricks, multiplicerat med fiberns styvhet 2, 27. Leverera pulser på en rad styrkor avslöjar en relation mellan den kraft som utövas på bunten och bunten är efterföljande förskjutning. Lutningen av denna kraftförskjutnings förhållande motsvarar hårknippet momentana styvhet (figur 4A).
Denna metod tillät oss att mäta en enskild bunt momentana styvhet som en funktion av dess böjning (Figur 4B). momentan kraftförskjutningskurvan visar en icke-linjär relation, avslöjar en icke-linjär styvhet av knippet över ett intervall av ca 20 nm runt sitt viloläge. Utanför detta område uppträder håret bunt som en Hookean material, är dess styvhet linjär för stora magnitud avböjningar.
Dessa resultat demonstgradera mångsidigheten hos Bullfrog säcken i studien av hår-cellfysiologi. Med hjälp av dessa och andra preparat, kan man utforska mechanotransduction i flera steg i överföringen av information från bunten mot hjärnan.
Figur 1: Dissekering av Bullfrog: s innerörat. (A) Visning av Bullfrog övre gommen från dess ventrala sidan förhindrar identifiering av örontrumpeten (cirkel). Lateral reflektion av huden som täcker den högra sidan av den övre gommen avslöjar var innerörat (streckad ruta). (B) avlägsnande av brosket på den ventrala sidan av grodans tinningbenet öppnar öron kapseln (streckad linje). (C) Visas är en högre förstoring bilden av den otiska kapseln, i vilken säcken, Lagena, CN VIII och SACC ular nerv kan lätt identifieras. (D) En vy av öron kapsel efter avlägsnande av innerörat organ avslöjar var de båggångarna. (E) Efter avlägsnande av den isolerade innerörat, den säcken, Lagena, och VIII: e kranialnerven (CN VIII) kan lätt identifieras. (F) Den isolerade säcken har en kort stump av saccular nerv och en otolithic membran som ligger ovanpå dess sensoriska epitel. Etiketter motsvarar den (i) säcken, (ii) Lagena, (iii) CN VIII, (iv) saccular nerv, och (v) otolithic membran. Axis etiketter P och A motsvarar respektive de bakre och främre riktningar. Skalstrecken representerar 1 cm (A, B), 1 mm (C, D, E) och 400 | im (F).
Klicka här för att se en större version av denna siffra.
s "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner en vektorversion av denna siffra.
Figur 2: Deplacement-responskurva för ett enda hårstrå Cell. (A) Spetsen av en glas stimulus fibern kopplades till kinociliary glödlampa av ett hår bunt och fiberns bas därefter förskjutas tvärs nio diskreta steg. Bunten position spårades på en dubbel-fotodiod systemet och dess receptor potential samtidigt mäts med hjälp av en mikro vars utgång fick passera genom en förstärkare i bryggkoppling. Elektrodens spets motstånd var 95 Mohm och bunten vilar membranpotential var -47 mV. (B) Ett diagram över knippet s receptor potential som en funktion av dess förskjutning avslöjar en icke-linjär relation mellan knippet svar och dessplacera. Varje punkt motsvarar medelvärdet potential och innebär förskjutning över en 2,5 ms tidsfönster, med början 2,5 ms efter debuten av mekanisk stimulering. Varje färg representerar en uppsättning av tidsserie som motsvarar samma förskjutning puls.
Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Klicka här för att ladda ner en vektorversion av denna siffra.
Figur 3: Effekt av Gentamicin på Spontan Hair Bundle Oscillation. Den spontana rörelse av en hår bunt i ett tvåkammarsystem preparatet registrerades med hjälp av en dubbel fotodiod system. I frånvaro av jontoforetisk frisättning av gentamicin (0 nA), håretknippet visar symmetriska svängningar. Eftersom storleken på strömmen passera genom en jontoforetisk pipett fylld med 500 mM gentamicinsulfat växer (10 nA, 20 nA), frekvensen av hår-bunt utflykter faller i en dosberoende sätt och bunten är förskjuten mot dess höga kant längre tidsperioder.
Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Klicka här för att ladda ner en vektorversion av denna siffra.
Figur 4. Beräkna Hair Bundle momentana styvhet. (A) En stimulans fiber (röd) av styvhet K F är kopplad to kinociliary glödlampa (brun) av en enskild hårknippet (gul). Förskjuta basen av fibern ett känt avstånd X F orsakar bunten att röra sig ett avstånd X B. Skillnaden mellan de förskjutningar av fibern och knippet är proportionell mot den kraft som utövas på knippet av stimulus fiber, F F. Upprepa detta i en rad krafter ger en momentan kraftförskjutnings förhållande (till höger), vars lutning motsvarar den hårknippet momentana styvhet. (B) En enskild bunt underkastades tvinga pulser av ökande storlek och dess förskjutning inom de första 50 ms efter pulsen insättande mättes (blå punkter). Här håret knippet uppvisar en icke-linjär momentana styvhet över ett område av cirka 20 nm i närheten av sitt viloläge. Den röda kurvan motsvarar en passning till förhållandet F = k * X - 60 * z * (1 / (1 + exp (- z * (X - X 0) / (k B * T))) + F 0, där F är kraften som anbringas på knippet, X är knippet deplacement, k = 790 ± 51 μN · m -1 är den bunt konstant stelhet när alla kanaler är antingen stängda eller öppna, z = 0,43 ± 0,04 pN är kraften av en enda grind fjäder, X 0 = 2 ± 1,9 nm är bunten position vid vilken 50% av sina kanaler är öppna, är k B Boltzmanns konstant, T är temperaturen, och F 0 = 11,7 ± 1,3 pN är en förskjuten kraft. Passformen har en koefficient för bestämning av 0,98. Stimulans fibern hade en styvhet på 107 μN · m -1.
Klicka här för att se en större version av denna siffra.
es / ftp_upload / 55.380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner en vektorversion av denna siffra.
| löst ämne | Formeln Vikt (g / mol) | Lägg till ett L | |
| artificiell perilymfa | artificiell endolymfan | ||
| NaCl | 58,4 | 6,54 g | 0,117 g |
| KCl | 0,149 | 0,149 g | 8,62 g |
| CaCl2 ⦁ 2H 2 O | 147 | 2 ml av en M CaCl 2 lager | 250 mikroliter av en M CaCl 2 lager |
| HEPES | 238,3 | 1,19 g | 1,19 g |
| D - (+) - glukos | 180,2 | 0,541 g | 0. 541 g |
Tabell 1. Lösningar för Dissection och experimentell beredning. Denna tabell visar är recepten för artificiell perilymfa och artificiella endolymfan lösningar som används i dissekering och i en- eller två-kammar preparat. Lösningarna bör föras till pH 7,2-7,4 med cirka 2 ml NaOH (perilymfa) eller 2 ml KOH (endolymfan). Det osmotiska styrka bör läsa ungefär 230 mmol · kg -1 på grund av ofullständig jonisk dissociation.
Discussion
Inom Bullfrog är säcken ligger flera tusen lättillgängliga sensoriska hårceller. Här visar vi utvinning och beredning av säcken för en- och två-kammar inspelningar. Dessa två preparat tillåter både mikromekaniska och elektrofysiologiska studier av hårceller och tillhörande buntar. Eftersom vävnaden kan överleva i flera timmar med frekvent utbyte av syresatt saltlösning, kan experiment fortsätta för långa löptider. Hårcellerna i dessa förberedelser är fortfarande typiskt lönsamt för mikro inspelning för upp till 6 timmar efter dissektion, medan hårknippena svänga spontant upp till 24 timmar efter extraktion.
Framgångsrik utvinning och montering av säcken hänger på vinna flera gemensamma utmaningar. För det första bör direkt kontakt med den apikala ytan av den saccular makula undvikas under hela förfarandet beredning. Den saccular nerv ger ett bekvämt handtag för säker manipuning av säcken. När befrias från resten av innerörat organ bör säcken överföras med hjälp av en stor öppning pipett samtidigt som den är nedsänkt i vätska för att undvika mekaniska skador på dess sensoriska epitel. Avlägsnandet av otoconia från macular yta måste fyllas utan mekanisk skada hårcellerna. Eftersom otoconia ligga direkt ovanpå macula, kan hårcellerna skadas av oavsiktlig kontakt mellan dissektion verktyg och otolithic membranet när du tar bort otoconia. För att undvika skador, rekommenderar vi att gelatinös massa av otoconia hållas på en plats långt från gula fläcken och avlägsnas som en enda massa. Detta undviker fragmentering av den otoconial massan i flera kluster, vilka var och en skulle vara individuellt extraherade. Om små kluster av otoconia förblir de kan tas bort med mild vätsketryck som levereras av en Pasteur-pipett. En slutlig utmaning innefattar bildningen av en tät tätning mellan säcken och aluminium montering fyrkant iberedning två kammare. Användning av en fyrkant med en perforering tillräckligt liten för att tillåta överlappning av omkring 100 | im mellan säcken och de omgivande aluminium medger fullständig tätning av vävnaden. Limmet bör bringas i kontakt med ca 100 | j, m av saccular vävnad runt gula fläcken omkrets för att bilda en tät försegling.
Koncentrationen av fri Ca 2+ är en viktig faktor i studien av hårceller. Ca 2 + reglerar både snabb och långsam anpassning, sålunda bestämmer kinetiken hos mechanotransduction apparaten och egenskaperna hos håret bunt aktiva-process fenomen, inbegripet spontan bunt rörelse 8, 23. Endolymphatic kalcium in vivo är närvarande vid 250 ^ M, därför mest fysiologiskt relevant kinetik bedöms vid denna koncentration (Maunsell JHR, R. Jacobs och AJ Hudspeth. UnpublisHed observationer 16). Men mikroelektrod inspelningar från hårcellerna kräver en extern kalciumkoncentration för korrekt tätning av cellmembranet kring mikro högst 2 mm. Det är därför absolut nödvändigt att använda en hög-kalcium saltlösning för dessa experiment. Slutligen kan man önska att studera effekterna av externt kalcium vid mechanotransduction med hjälp av olika kalciumkoncentrationer. I dessa fall är det viktigt att komma ihåg att kalciumkoncentrationer under 1 uM typiskt leda till spets-link bristning och oåterkallelig förlust av överföring 28.
De två experimentella beredningar som beskrivs här möjliggöra ett intervall av biofysikaliska mätningar på hårcellerna. Emellertid kan ytterligare mätningar göras med smärre ändringar av dessa preparat. I den vikta saccular beredningen är hårknippena visualiseras i sidled. Imaging hår-bunt rörelse från denna utsiktspunkt avslöjar sammanhängande MOTjon av både kort och lång stereocilier 29. Här saccular makula skiljs först från dess underliggande vävnad och därefter viks längs axeln som definieras av saccular nerven så att hårknippena ansikte utåt och visualiseras i sidled vid vecket. En andra modifiering, hår-cell dissociation, möjliggör studier av både hår cellens bunt och soma. Hårcellerna dissocierades mekaniskt på ett objektglas för avbildning och elektrofysiologiska inspelning 30. Slutligen kan hårcellerna extruderas från epitel genom att följa ett liknande dissociation protokoll men utan mekanisk dissociation steg. Denna behandling resulterar i hårceller som gradvis extrudera ut av epitelet, vilket ger basolateral åtkomst för elektrofysiologiska inspelningar samtidigt minimera mekaniska skador. Dessa preparat och deras många modifikationer demonstrerar mångsidigheten hos grodan säcken som ett modellsystem för den biofysiskastudie av sensoriska hörselceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Common to both preparations | |||
| Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
| Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
| Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
| Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
| Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
| 35 mm Petri dish (x2 - 3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
| Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
| 120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
| Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
| Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
| Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
| Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For one-chamber preparation | |||
| Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
| Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
| Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For two-chamber preparation | |||
| Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
| Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
| Mounting block | Supplementary file 3 | ||
| Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
| Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
| Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
| Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
| Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
| 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline components | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
| CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Parts lists for home-made equipment | |||
| Solenoid puller | |||
| Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
| Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
| Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
| Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
| Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
| Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Magnetic pins | |||
| Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Open-top magnetic chamber | |||
| Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
| 1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
References
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).
- Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker. Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).
- Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).
- Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear. Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).
- Martin, P., Hudspeth, A. J. Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).
- Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).
- Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus. Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).
- Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. The Journal of physiology. , (1988).
- Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. Imaging electrical resonance in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).
- Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).
- Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule. Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).
- Hudspeth, A. J. Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus. Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).
- Hudspeth, A. J. Integrating the active process of hair cells with cochlear function. Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Response latency of vertebrate hair cells. Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).
- Cheung, E. L. M., Corey, D. P. Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel. Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).
- Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).
- Assad, J. A., Corey, D. P. An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells. Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells. The Journal of physiology. , 405-434 (1989).
- Howard, J., Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).
- Purves, R. D. The release of drugs from iontophoretic pipettes. Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).
- Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell. Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).
- Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).
- Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification. Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).
- van Netten, S. M., Khanna, S. M. Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).
- Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).
- Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells. The Journal of physiology. , 369-398 (1991).
- Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels. Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia. Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).
