यहाँ, हम vivo में रक्त वाहिका गठन कल्पना और 3 डी पाड़ों में वास्तविक समय में multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । आनुवंशिक रूप से संशोधित पाड़ों में Angiogenesis एक murine calvarial क्रिटिकल बोन दोष मॉडल में अध्ययन किया गया था । अधिक नई रक्त वाहिकाओं नियंत्रण में से उपचार के समूह में पाया गया ।
गंभीर रूप से आकार के अस्थि दोषों के पुनर्निर्माण एक गंभीर नैदानिक समस्या है क्योंकि ऊतक के भीतर गरीब angiogenesis की मरंमत के दौरान इंजीनियर पाड़, जो पर्याप्त रक्त की आपूर्ति की कमी को जंम देता है और नए ऊतकों के परिगलन का कारण बनता है । रैपिड vascularization नए ऊतक अस्तित्व और मौजूदा मेजबान ऊतक के साथ एकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है । पाड़ों में vasculature के de नोवो पीढ़ी हड्डी पुनर्जनन अधिक कुशल बनाने में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, की मरंमत ऊतक एक पाड़ में विकसित करने की अनुमति । इस समस्या से निपटने के लिए, एक भौतिक पाड़ के आनुवंशिक संशोधन angiogenesis और आस्टियोजेनेसिस में तेजी लाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, visualizing और वास्तविक समय में और तीन आयामी (3 डी) पाड़ या नए अस्थि ऊतक में vivo रक्त वाहिका गठन में ट्रैकिंग अभी भी हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक बाधा है । Multiphoton माइक्रोस्कोपी (MPM) एक उपंयास जैव इमेजिंग रूपरेखा है कि एक उच्च संकल्प और ंयूनतम इनवेसिव तरीके से जैविक संरचनाओं से volumetric डेटा प्राप्त कर सकते हैं । इस अध्ययन का उद्देश्य calvarial क्रिटिकल बोन दोष की मरंमत के लिए एक आनुवंशिक रूप से संशोधित 3 डी-PLGA/nHAp पाड़ में vivo में multiphoton माइक्रोस्कोपी के साथ angiogenesis कल्पना थी । PLGA/nHAp पाड़ों एक विकास कारक के निरंतर वितरण के लिए कार्यात्मक थे pdgf-बी जीन ले lentiviral वैक्टर (LV-pdgfb) क्रम में angiogenesis की सुविधा के लिए और हड्डी पुनर्जनन बढ़ाने के लिए । एक पाड़ प्रत्यारोपित calvarial क्रिटिकल बोन दोष माउस मॉडल में, रक्त वाहिका क्षेत्रों (BVAs) PHp पाड़ों में काफी पीएच पाड़ों की तुलना में अधिक थे । इसके अतिरिक्त, pdgf-बी और angiogenesis से संबंधित जीन, vWF और VEGFR2की अभिव्यक्ति, तदनुसार वृद्धि हुई । MicroCT विश्लेषण संकेत दिया है कि नए PHp समूह में हड्डी गठन नाटकीय रूप से अंय समूहों की तुलना में सुधार हुआ । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली बार है multiphoton माइक्रोस्कोपी में प्रयोग किया जाता था अस्थि ऊतक-इंजीनियरिंग में angiogenesis की जांच करने के लिए एक 3d बायो-सड़ पाड़ vivo में और वास्तविक समय में.
हड्डी एक उच्च संवहनी ऊतक है कि एक व्यक्ति के जीवनकाल के दौरान फिर से बनाना जारी है1। आघात, संघ, ट्यूमर लकीरें, या craniofacial विकृतियों से उत्पंन बड़ी हड्डी दोष के तेजी से और प्रभावी अस्थि पुनर्जनन एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है । अस्थि दोष की मरंमत के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक चिकित्सीय दृष्टिकोण शामिल है भ्रष्टाचार और allograft आरोपण, लेकिन उनके उपयोग में कई समस्याओं और सीमित उपलब्धता, महत्वपूर्ण दाता साइट रुग्णता, संक्रमण के एक उच्च जोखिम के रूप में सीमाएं, शामिल है, और मेजबान प्रतिरक्षा अस्वीकृति2,3। हालांकि, कृत्रिम अस्थि भ्रष्टाचार इन सीमाओं को कम करने के लिए एक कुशल विकल्प प्रदान करते हैं । वे biodegradable सामग्री से बनाया जा सकता है, आसान कर रहे है एक उपयुक्त ताकना आकार के साथ गढ़े हो, और आनुवंशिक रूप से4,5संशोधित किया जा सकता है ।
वर्तमान में, विभिंन ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ों ऊतक के विकास में नियोजित किया गया है इंजीनियर हड्डी6,7। हड्डी की मरंमत और पुनर्जनन अधिक प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए, इंजीनियर विकास कारकों के साथ संयुक्त सामग्री उभरा है और अच्छे परिणाम प्राप्त8,9। दुर्भाग्य से, कम आधा जीवन, आसान करने के लिए खो गतिविधि, और चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए विकास कारकों की supraphysiological खुराक उनके नैदानिक आवेदन10सीमा. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, विकास कारकों के बजाय वृद्धि कारक जीन के वितरण के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शन किया गया है osseous दोषों और रोगों11,12के उपचार के लिए प्रतिपूर्ति के लिए प्रतिक्रिया को बनाए रखने । वायरल वैक्टर ऊतक पुनर्जनन उनके उच्च एक्सप्रेस दक्षता13के कारण के लिए वितरण उपकरण का वादा कर रहे हैं ।
वृद्धि कारकों के अलावा, प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF-BB) इस अध्ययन में चुना गया था क्योंकि यह न केवल mesenchymal और osteogenic कोशिकाओं के लिए एक mitogen और chemoattractant है, लेकिन यह भी angiogenesis के लिए एक उत्तेजक14,15 . पिछले पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि PDGF-BB सुरक्षित रूप से और प्रभावी ढंग से periodontal osseous दोषों16,17में हड्डी की मरंमत को बढ़ावा देने सकता है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PDGF-BB vivo18,19 मेंendothelial सेल माइग्रेशन और जखीरे को प्रेरित करके angiogenesis को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, PDGF-BB भी mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को रेंडर कर सकते हैं (MSCs) endothelial कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम20, और यह आगे MSCs में neovascularization की संभावित भूमिका पर प्रकाश डाला गया. इसलिए, PDGF-BB के साथ पाड़ों में vasculature के de नोवो गठन उत्प्रेरण हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग में पाड़ में बड़े ऊतक की मरंमत के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
अस्थि दोष हीलिंग एक गतिशील ऊतक morphogenetic प्रक्रिया है कि समंवित आस्टियोजेनेसिस और angiogenesis की मरंमत के पदों पर21की आवश्यकता है । प्रत्यारोपित ऊतक में Neoangiogenesis-इंजीनियर पाड़ एक आवश्यक पूर्व पोषक तत्वों और विकास और अस्तित्व के लिए ऑक्सीजन और चयापचय अपशिष्ट को हटाने के लिए के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति के लिए अपेक्षित है । आमतौर पर इस्तेमाल किया इमेजिंग तरीकों, सहित एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (microCT), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), और फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी, के बजाय लागू कर रहे हैं ऊतकीय परीक्षा angiogenesis सूचना प्राप्त गर्न२२,२३। हालांकि, इन तरीकों visualizing और अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में 3 डी पाड़ में neovasculature को मापने में विभिंन बाधाओं का सामना । Multiphoton माइक्रोस्कोपी (MPM) एक तुलनात्मक उपंयास जैव इमेजिंग तकनीक है कि एक साथ के विशिष्ट लाभ है कोशिकाओं visualizing, extracellular मैट्रिक्स, और vivo में संवहनी नेटवर्क के आसपास । यह गहरी ऊतक प्रवेश के लिए एक अंतर्निहित तीन आयामी इमेजिंग क्षमता के पास और कम धूप का कारण बनता है । इसलिए, पिछले दशक में, MPM जैव चिकित्सा अध्ययन में अधिक ध्यान दिया है24, तंत्रिका विज्ञान, इम्यूनोलॉजी में सहित, और स्टेम सेल गतिशीलता । हालांकि, यह बमुश्किल आर्थोपेडिक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है ।
पशु देखभाल गुआंग्डोंग प्रांत के प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के साथ अनुपालन में था । सभी प्रक्रियाओं पशु अनुसंधान, शेन्ज़ेन उंनत प्रौद्योगिकी, चीनी अकादमी विज्ञान के सं?…
हड्डी एक अद्वितीय क्षमता के साथ एक उच्च संवहनी ऊतक है लगातार चंगा करने के लिए और एक व्यक्ति के जीवनकाल भर में remodel1। आस्टियोजेनेसिस और दोष मरम्मत के लिए vascularization का स्तर महत्वपूर्ण है । कम vascularization ऊतक…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के शेन्ज़ेन मोर कार्यक्रम, चीन (सं. ११०८११००३५८६३३१), शेन्ज़ेन बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (सं. JCYJ20150401150223631, सं. JCYJ20150401145529020, और सं. JCYJ20160331190714896), गुआंग्डोंग सार्वजनिक अनुसंधान और क्षमता निर्माण विशेष कार्यक्रम (सं. 2015A020212030), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. ८१५०१८९३), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2013CB945503), और सियाट नवाचार कार्यक्रम के लिए उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं (Y5G010) ।
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
Paraffin | Leica | RM2235 | |
Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
microCT | Bruker | 1176 | |
commercial software | Bruker |