여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.
비판적으로 크기의 뼈 결함의 재건 복구, 충분 한 혈액 공급의 부족 하 고 새로운 조직의 괴 사를 일으키는 동안 가난한 신생 조직 엔지니어링 건설 기계 내에서 인해 심각한 임상 문제 남아 있다. 신속한 vascularization 새로운 조직의 생존 및 기존 호스트 조직 통합에 대 한 중요 한 전제 조건입니다. 맥 관 구조 건설 기계에서의 드 노 보 세대 뼈 재생 좀 더 효율적인, 수 있도록 복구를 발판으로 성장 하는 조직에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 문제를 해결 하려면 소재 비 계의 유전 수정 골 신생을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 시각화 및 추적 vivo에서 실시간으로 3 차원 (3D) 건설 기계 또는 새로운 뼈 조직에 혈관 형성은 여전히 뼈 조직 공학에 대 한 장애물. Multiphoton 현미경 (MPM) 고해상도 및 최소한-침략 적 방식으로 생물학 구조에서 체적 데이터를 취득할 수 있는 새로운 바이오 이미징 양식 적임 이다. 이 연구의 목적은 multiphoton 현미경에 vivo에서 calvarial 중요 한 뼈 결함 수리에 대 한 유전자 변형된 3D-PLGA/nHAp 비 계에 신생을 시각화 했다. PLGA/nHAp 건설 기계 했다 공업화 신생을 촉진 하 고 뼈 재생을 향상 하려면 lentiviral 벡터 (LV-pdgfb)를 들고 성장 인자 pdgf b 유전자의 지속적인된 납품에 대 한. 비 계 이식 calvarial 중요 한 뼈에서 마우스 모델을 결함, PHp 건설 기계에서 혈관 영역 (BVAs) PH 건설 기계에서 보다 훨씬 더 높은 했다. 또한, pdgf b 와 신생 관련 유전자, vWF 및 VEGFR2의 식을 대응 하 게 증가 했다. MicroCT 분석 새로운 뼈 형성을 극적으로 향상 PHp 그룹에서 다른 그룹에 비해 표시. 우리의 지식, 이것은 multiphoton 현미경 조사는 3 차원 생물 분해성 scaffold에서 vivo에서 및 실시간으로 신생 뼈 조직 공학에 사용 되었다 처음으로.
뼈는 개별1의 수명 기간 동안 개장 하 고 매우 vascularized 조직 이다. 큰 뼈 결함 없앤 외상, 종양 절제, 또는 craniofacial 기형 발생의 신속 하 고 효과적인 뼈 재생 복잡 한 생리 적 과정 이다. 뼈 결함 수리를 위해 사용 하는 전통적인 치료 접근 포함 autograft와 이식 이식, 하지만 그들의 사용을 포함 여러 문제 및 제한 사항, 제한 된 가용성, 중요 한 기증자 사이트 병 적 상태, 감염의 위험이 높은 고 면역 거부2,3호스트. 그러나, 인공 뼈 이식 이러한 제한을 완화 하는 효율적인 대안을 제공 합니다. 그들은 생 분해성 소재로 만들어질 수 있다, 적당 한 기 공 크기, 조작 하기 쉬운 하 고 유전자 변형된4,5일 수 있다.
현재, 다양 한 조직 엔지니어링 건설 기계 조직 공학 뼈6,7의 개발에 고용 되었다 있다. 뼈 수리 및 재생을 보다 효과적으로 유도 하기 위해 설계 된 바이오 성장 인자와 함께 등장 있고 달성 좋은 결과8,9. 불행 하 게도, 짧은 반감기, 잃게 쉬운 활동 및 치료 효능에 대 한 성장 인자의 supraphysiological 복용량 그들의 임상 응용 프로그램10을 제한합니다. 이러한 문제를 해결 하려면 대신 성장 인자 성장 인자 유전자의 뼈가 있는 결함과 질병11,12의 치료에 대 한 bioactivity를 유지 하는 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 바이러스 성 벡터는 유망한 납품 효율성13를 표현 하는 그들의 높은 인해 조직 재생에 대 한 도구.
성장 요인 중 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF-BB)에서 선정 되었다이 연구는 물질과 엽 고 osteogenic 셀, chemoattractant 뿐만 아니라 신생14,15 에 대 한 자극 제 이기 때문에 . 이전 전 임상 및 임상 연구는 PDGF BB 홍보할 수 있는 안전 하 고 효과적으로 잇 몸 뼈가 있는 결함16,17뼈 수리 했다. 최근 연구 PDGF BB 동기 부여 내 피 세포 이동과 확산 vivo에서18,19신생을 자극 한다는 것을 밝혔다. 또한, PDGF BB 렌더링할 수 있습니다 또한 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 내 피 세포20, 그리고이 더 하이라이트에 neovascularization에서 MSCs의 잠재적인 역할을 차별화 할 수 있습니다. 따라서, 맥 관 구조 건설 기계 PDGF BB와에 드 노 보 형성 유도 뼈 조직 공학에서 공중 발판으로 성장 하는 조직의 수리를 위해 중요 한 단계입니다.
뼈 결함 치유 조정된 골 및 신생 수리 위치21에서 요구 하는 동적 조직 전체적 프로세스입니다. 이식된 조직 설계 건설 기계에 Neoangiogenesis 영양분 및 산소 성장 및 생존 및 변화 낭비를 제거 하기 위한 세포 공급에 대 한 필수적인 전제입니다. 일반적으로 사용 하는 이미징 방법, 엑스레이 포함 하 여 마이크로-계산 단층 (microCT), 자기 공명 영상 (MRI), 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대신 적용 됩니다. 신생 정보22,23를 조직학 검사. 그러나, 이러한 방법을 시각화 및 뼈 조직 공학에서 3D 건설 기계에 neovasculature 측정에 다양 한 장애물의 얼굴. Multiphoton 현미경 (MPM)는 동시에 세포, 세포 외 기질, 시각화 및 주변 혈관 네트워크의 뚜렷한 장점이 비교적 새로운 바이오 이미징 기술 vivo에서. 그것은 깊은 조직 침투에 대 한 고유의 3 차원 이미징 능력을 소유 하 고 낮은 photodamage 발생. 따라서, 지난 10 년간, MPM 생물 의학 연구24, 신경 과학, 면역학, 줄기 세포 역학 등에서 많은 관심을 얻고 있다. 그러나, 그것은 거의 정형 외과 연구에 사용 됩니다.
뼈는 지속적으로 치유 하 고 개별1의 일생 내내 개장 독특한 용량 매우 vascularized 조직 이다. Vascularization의 레벨은 골 및 결함 수리를 위해 중요 하다. 낮은 vascularization 조직 공학 뼈의 넓은 임상 응용 프로그램을 제한합니다. 건설 biomimetics의 이론에 따르면 매우 vascularized 조직 공학 뼈 큰 세그먼트 뼈 결함을 복구 하기 위한 도구가 되고있다. 장비의 다양 한 종류는 비교적 작은 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 심천 공작 프로그램, 중국 (No. 110811003586331), 심천 기본 연구 프로그램 (제에 의해 지원 되었다 JCYJ20150401150223631, 호 JCYJ20150401145529020, 및 번호 JCYJ20160331190714896), 광 동 공공 연구 및 용량 건물 특별 프로그램 (No. 2015A020212030), 중국 (No. 81501893)의 국가 자연과학 기초, 중국 (2013CB945503)의 국가 주요 기본 연구 프로그램 그리고 민 혁신 프로그램 우수 젊은 연구자 (Y5G010).
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
Paraffin | Leica | RM2235 | |
Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
microCT | Bruker | 1176 | |
commercial software | Bruker |