Abstract
הערכה של פעילות אנטיביוטית עם פיתוח תרופות חדשות מכוונת נגד חיידקים אנאירוביים קשה ותובענית מבחינה טכנית. כדי לקבל תובנה אפשרי MOA, שינויים מורפולוגיים הקשורים לחשיפה אנטיביוטיקה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). שילוב הדמיה SEM עם עקומות להרוג מסורתיים עשוי לשפר את התובנה שלנו לתוך הפעולה סמים לקדם את תהליך הפיתוח של התרופה. כדי לבדוק את הנחת היסוד, להרוג עקומות ומחקרים SEM בוצעו באמצעות תרופות עם ידוע אך שונה MOA (vancomycin ו metronidazole). ג תאים difficile (R20291) גדלו עם או ללא נוכחות של אנטיביוטיקה עד 48 שעות. במהלך 48 שעות המרווח, תאים נאספו בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע יעילות אנטיביוטיקה עבור הדמיה על SEM. בהתאם לדו"חות קודמים, vancomycin ו- metronidazole היו בעלי פעילות חיידקית משמעותית לאחר 24 שעות של טיפול, כפי שנמדד על ידי היחידה להרכיב מושבות (CFU)טינג. באמצעות הדמיה SEM קבענו כי metronidazole היו השפעות משמעותיות על אורך התא (> ירידה של 50% באורך התא עבור כל אנטיביוטיקה, P <0.05) לעומת בקרים ו ונקומיצין. בעוד התגובה הפנוטיפית לטיפול תרופתי לא תועדה בעבר באופן זה, הם עולים בקנה אחד עם MOA של התרופה המדגימה את הרבגוניות והאמינות של ההדמיה והמדידות ואת היישום של טכניקה זו עבור תרכובות ניסיוניות אחרות.
Introduction
Clostridium difficile הוא חיידק החיידק החיידקי , הגורם לגרימת כ -500,000 זיהומים בשנה בארה"ב ונחשב לאיום פתולוגי דחוף לאיום על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), רמת הסיכון הגבוהה ביותר. 1 בעשור האחרון חלה התפתחות משמעותית של תרופות במיקרוביאלים עם פעילות נגד C. difficile . 2 , 3 במבחנה הלימודים הם מרכיב הכרחי של תהליך הפיתוח של התרופה. 4 באופן מסורתי, רגישות במבחנה והזמן להרוג מחקרים משמשים כדי לאמת בעתיד חיה ואחרים במחקר vivo .
בעוד ששיטות אלה משמשות תפקיד חשוב בהערכת פעולת הריגה, הן אינן קולטות את התגובה הפנוטיפית של התאים לטיפול תרופתי. על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם standarD הריגת מחקרים קינטיים, אפיון יסודי יותר של ההשפעות הישירות של אנטיביוטיקה אפשרי. 5 , 6 , 7 כאן, אנו מציגים שיטה שבה SEM משמש כאמצעי פרופיל פרופיל היעילות של טיפול אנטיביוטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד C. difficile ממקורות סביבתיים או קליניים שונים
- בידוד סביבתי: שימוש במדד כותנה טרום מעוקרים (רטוב קלות עם 0.85% NaCl), ספוג את פני השטח של כל תחום עניין (קומה, דלת, ידית, מדף וכו ' ). 8 הקפד ללבוש כפפות סטריליות במקום ספוגית צינור מעוקר לאחר השלמת.
- מבודד קליני (שרפרף): צלחת 10 עד 100 מ"ג של דגימות צואה קלינית על cefoxitin-cycloserine-fructose אגר (CCFA) באמצעות לולאה חיסון ו דגירה בתנאים אנאירוביים מחמירים עבור 48 - 72 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. 7 , 9 , 10
- להעשיר את דגימות ספוגית הסביבה במוח הלב עירוי (BHI) מרק עם 0.05% taurocholate נתרן מקום בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוסבמשך 5 ימים. צנטריפוגה 1 מ"ל של התרבות ב XG 10,000 ו resuspend גלולה μL 100 של אתנול.
- פלייט התאים resuspended (50 μL) על cycloserinecefoxitin אגר fructose (CCFA) צלחות דגירה בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 - 48 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים.
- מבחן חשודים מושבות C. difficile באמצעות מגיב לטקס לטקס או PCR.
2. Culturing C. difficile והרג תהליכים קינטיים
- לגדול מטוהרים סביבתיים או קליניים C. זנים difficile על צלחות אגר דם בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- קח מושבה בודדת אחת עם לולאה חיסון, להעביר אותו 5 בינוני מ"ל BHI בצינור 15 מ"ל, ולגדול במשך 24 שעות בתא אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס.
- לדלל את תרבויות מראש 1: 100 עד כ 10 6 מושבה להרכיב יחידהS (CFU) / מ"ל ב BHIS טריים מופחת מראש (BHI בתוספת 5 גרם / L תמצית שמרים 1% L- ציסטאין) בתוספת 0.1% נתרן taurocholate ואת הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה (T0).
- איסוף מדגם 1 מ"ל עם פיפטה בכל נקודת זמן (T0, T6, T24, T48) ו צלחת / להפיץ aliquot קטן (100 μL בדילול סדרתי) על צלחת אגר דם. בואו התאים לגדול על צלחת אגר דם במשך 48 שעות בתא אנאירובית ב 37 ° C ולספור את מספר המתקבל של מושבות לקבוע CFU.
הכנת דוגמאות עבור סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים
- איסוף 1 מ"ל של תאים מנקודת זמן בכל צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 10 דקות. מחק את supernatant תאים לשטוף PBS.
- צנטריפוגה דגימות ב XG 10,000 במשך 10 דקות שוב להשליך supernatant. מחדש לדלל תאים 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה דגימות שוב 10 דקות ב 10,000 xg וזורקים supernatant. לשטוף תאים פעמיים עם מים מזוקקים ו redillute ב 100 μL של מים מזוקקים. התאם את עוצמת הקול בהתאם עכירות של הפתרון.
הערה: ביצוע דילולים סדרתי מרובים הוא רעיון טוב. - תווית coverslips ולהוסיף 40 μL של המדגם על זה. לדגור במשך 15 דקות במנוע הזרימה להתאדות הנוזל ולאפשר לתאים לדבוק coverslip. אם הנוזל עדיין קיים, השתמשו במפוח כדי להסיר את הנוזל.
- מקום coverslips שכותרתו עם תאים בשולחן מכונת המקרטעת ואת הקלטת למטה. זהב טהור מאובטח במכונה המקרטעת. הפעל את המכונה והתחל לדהור בלחץ נמוך (50 mTorr). תאים מעיל עבור 30 s ב 80 mA, אשר מתרגמת 20 ננומטר של ציפוי זהב.
- העברת תאים מצופים אל מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
4. הדמיה ג תאים difficile על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק
- הפעל את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כראוי על ידי יחסי ציבורEssing את לחצן הפתיחה על תוכנת המחשב.
- באמצעות קלטת פחמן, מאובטח coverslips מצופה על במת מתכת. לאחר SEM הוא פרקו, הדלת צריכה לפתוח בקלות. נעל את הבמה המתכת לתוך תא SEM ידי דופק אותו.
- לחץ על לחצן PUMP בתוכנת המחשב. SEM יהיה שמיש כאשר המערכת קוראת "אישור OK".
- לחץ על גלאי SE תחת הכרטיסייה גלאים. הפעל את הקורה על ידי לחיצה על הלחצן המציג את המתח. התחל הדמיה במתח נמוך (5 קילו וולט) לפני המתח הגובר (עד 15 קילו וולט). תמונה תופיע לאחר שהקורה מופעלת.
- באמצעות פונקציית המעקב, למצוא שטח על coverslips מצופה לתמונה. זום לתוך האזור ולמצוא מבנים בצורת מוט; אלה הם clustridium difficile .
- התקרב והתמקד בתמונה כדי לכייל את המערכת. זה צריך להיעשות במרחקים עבודה מרובות: 15, 9 ו - 5 מ"מ. תמונה במרחק עבודה של 5 מ"מ.
- הפעל את ULtra מצב הדמיה ברזולוציה גבוהה ולהתחיל להתמקד לייעל אסטיגמציה.
- התחל להתמקד בהגדלה גבוהה. השתמש להתמקד גס עדין עבור זה. התאם אסטיגמציה גם כדי לקבל תמונה ברורה יותר.
- התאם אסטיגמציה בהגדלה גבוהה. כדי לעשות זאת, להתאים את אסטיגמטיזם מחליף (הם נראים דומים קנס / להתמקד מחוספס להתמקד) ולבדוק את התמונה לבהירות דיגיטלית על ידי התקרבות על תוכנת המחשב.
- Se את פונקציית סריקה איטית לאסוף תמונה באיכות גבוהה. שמור את התמונה שנאספה כקובץ TIFF, שישמש לניתוח. ודא את שורת הנתונים נבחרה אם המדידות ייעשה במהלך הניתוח.
- איסוף תמונות בזוויות שונות (עד 52 ° על ידי הפיכת באופן ידני את הזווית ישירות על SEM. תמונות זווית נוטים לחשוף מידע עומק יותר.
- שינוי מתח קרן בהתאם לתאים כי הם הדמיה. שמור את זה בעיקר בין 5-15 kV לכל הניסויים. לאחר ההדמיה הושלמה, להפוך את קרן ולהעלות את המרחק עובד 20 מ"מ. החדר יכול אז להיות vented ואת הבמה ניתן להסיר. להעתיק את כל התמונות על הכונן לניתוח נוסף.
5. עיבוד תמונה וניתוח
- הורד והתקן את התוכנה הזמינה באופן חופשי, FIJI (http://fiji.sc), אל המחשב.
- פתח את קובץ התמונה ב- FIJI.
- בעזרת פונקציית הקו, עקוב בדיוק אחר סרגל הסולם.
- לחץ על הכרטיסייה ניתוח בתוכנית FIJI ולבסוף לבחור את הפונקציה בחר סולם. יופיע חלון שיידרש את הגדרת המרחק הידוע בהתבסס על סרגל הסולם. לשנות את יחידת אורך גם כן ולחץ על אישור.
- עכשיו כי התוכנית מכויל למרחק, להשתמש בפונקציה הקו למדוד אורך התא. כדי להשיג את אורך, להשתמש בפונקציה הקו כדי לעקוב אחר התא בשלמותו. בחר שוב בכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן לחץ על מדידה. אורך צריך Appהאוזן ביחידות שצוין קודם לכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile הוא חיידק להרכיב נבג ולכן חשוב לקבוע את ההבדלים מורפולוגיה בין תאים צמחיים ו נבג לפני ניתוח פונקציונלי. איור 1 מציג תמונות מייצגות של תאים צמחיים שנתפסו במהלך השלב המעריכי של עקומת הצמיחה ותאי נבג. כפי שמתואר, תאים צמחיים הם מבנים ארוכים, חלקה, בצורת מוט, ואילו נבגים הם מבנים קטנים, סגלגל בעל החיצוני מחוספס. מבחינה תפקודית, תאים צמחיים לגדול ולהתחלק במהירות אחראים על ארסיות של זיהומים C. difficile ידי הפרשת רעלים, בעוד נבגים הם רדומים בדרך כלל עם מעט פעילות. לפיכך, אנטיביוטיקה פעילה בעיקר נגד תאים צמחיים, בעוד נבגים הם בדרך כלל עמיד בפני טיפול בסמים, בשל מספר שכבות להגן על הליבה עם DNA, וחוסר פעילות פיזיולוגית. בשל עובדות אלה, הרובשל הניתוח המורפולוגי מתמקד בתאי הצומח. 11 , 12
עקומת הריגה אנטיביוטית היא המתודולוגיה הסטנדרטית להפגין יעילות אנטיביוטית נגד חיידקים גוברת. ריכוזים המשמשים עם C. difficile זן R20291 היו מבוססים על ערכי MIC, 1 מיקרוגרם / מ"ל עבור vancomycin ו 0.51 מיקרוגרם / מ"ל עבור metronidazole. 10 כפי שמוצג בתרשים 2 , תאי הבקרה גדלים ומגיעים למישור, בעוד שהתאים המטופלים יורדים ביחידות להרכבת המושבה הכוללת (CFU) עד לגבול של גילוי (LOD) הממחיש אפקט של חיידק. כפי שהוכח, vancomycin ( איור 2 א ) ו metronidazole ( איור 2 ב ) הם יעילים על הריגת C. difficile בריכוז supraMIC (4xMIC). ניתן להבחין כי עקומות הרג אנטיביוטי נראה דומה, אך לתרופות יש מנגנונים שונים של acTion (vancomycin מונע סינתזה קיר התא בעת metronidazole משפיע על שכפול דנ"א). לכן, אנו מציעים כי עקומות הרג אנטיביוטי לא יכול להיות מספיק כוח מפלה לספק הבדלים מפורטים בין אנטיביוטיקה אלה. השתמשנו במיקרוסקופ כדי לספק יותר אפליה.
בגלל הגודל המיקרוסקופי שלה, C. difficile לא ניתן תמונה ללא הגדלה גבוהה. זה סיפק הזדמנות לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), שיטת הדמיה שיכולה לקבל רזולוציה בקנה מידה ננומטר, כדי להעריך את ההשפעות המפורטות של טיפול אנטיביוטי ישירות על התאים. כדי להדגים את התועלת של גישה זו, תאים היו צילמו לפני ואחרי טיפול תרופתי כדי לקבוע כיצד השתנתה המורפולוגיה ( איור 3 א ). כפי שהוכח, חלק מקירות התאים נפגעו, כמו במקרה של ואנקומיצין, וחלק מהתאים היו קטנים יותר,כפי שהיה המקרה של metronidazole. כדי לבדוק אם גודל התא הושפע, ניתחנו אורך התא באמצעות FIJI התוכנית. גודל תא צמחי יכול להשתנות חלק במקרה שליטה, אבל רובם הם בערך 6 מיקרומטר אורך ( איור 3 ב ). כאשר בוחנים תאים רבים מן הבקרה והגדרות מטופלים, ניתן להבחין במהירות כי אורך התא מושפע מועדף metronidazole אבל לא מושפע טיפול vancomycin ( איור 3 ג ).
איור 1: הבחנה בין סוגי תאים על ידי סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים. המוצגים הם תמונות נציג של תאים Clostridium difficile difficile ו נבג. תאים צמחיים הם מבנים מוטות כי הם ארוכים דגל. לעומת זאת, תאי הנבגים קטנים ויש להם מעיל גס ומחוספס. נבגים הם בצבע פסאודו אדום עבור התמונה purpoSes בלבד. סרגלי סולם מוצגים בתמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אנטיביוטי זמן להרוג קורבס. עקומות הריגה SupraMIC בוצעו עבור ארבעה אנטיביוטיקה שונים: vancomycin (A) , metronidazole (B) . אנטיביוטיקה אלו היו פעולות הרג משמעותי נגד C. difficile זן R20291 והתקרב לגבול של זיהוי (LOD) לספירת יחידות המושבה להרכיב (CFU). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: בחינת ההשפעות הפרמקולוגיות של טיפול אנטיביוטי. תמונות של תאים מטופלים ולא מטופלים נלקחו בנקודות זמן מרובות במהלך הריגת מחקרים קינטיים (A) . המוצג הוא דוגמא מייצגת של תא גדילי בקרה שנמדד לאורך (B) . תאים מטופלים ולא מטופלים נמדדו והשוו (C) . הניסויים בוצעו לפחות לשכפל ו> 17 תאים נמדדו לכל קבוצה. * P <0.05 בהשוואה לקבוצות טיפול ווונקומיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת תפוקה גבוהה לבידוד C. difficile ובדיקת רגישות אנטיביוטית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כאמצעי לאפיון יסודי יותר של הפעולה הפרמקולוגית של האנטיביוטיקה. באמצעות הפרוטוקולים המפורטים כאן, הוכחנו כי הדמיה התגובה הפנוטיפית של התא לטיפול אנטיביוטי יכול לחשוף תובנה הפעולה הפרמקולוגית של התרופה. בסך הכל, החלק הדמיה של פרוטוקול זה לוקח בערך 2 שעות משך לאחר איסוף התאים, אבל יכול להיות הרבה יותר מפלה מאשר הרג טיפוסי מחקרים קינטיים לבד. בעוד הלמידה להשתמש SEM יכול להיות תובעני מבחינה טכנית, הכנת דגימות היא פשוטה יחסית ומהירה. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים המפורטים כאן יספקו גישה אובייקטיבית להערכת הפעולה הפרמקולוגית של טיפול אנטיביוטי.
בהתחשב הדמיון בין tהוא עקומות הרג אנטיביוטי ( איור 2 ), ביקשנו לקבוע אם יש הבדלים בין התגובה של התא לטיפול תרופתי. באמצעות SEM, קבענו כי metronidazole היו השפעות על אורך התא בריכוז supraMIC של התרופה. בעוד שפנוטיפים אלה לא דווחו בעבר, הם עולים בקנה אחד עם מנגנוני הפעולה של האנטיביוטיקה ומציעים השפעה על חילוף החומרים והתאים של תאים. לעומת זאת, לונקומיצין היו השפעות משמעותיות על דופן התא, אשר גם עקבית עם מנגנון הפעולה שלה. 13 אמנם יש קווי דמיון בין קינטיקה להרוג בין אנטיביוטיקה אלה, זה נראה מן התמונות SEM כי ישנם הבדלים פנוטיפיים משמעותיים. יצירת ספריית פנוטיפ אנטיביוטי יאפשר אפיון יסודי יותר של תרופות שעשויות שלא להיות מנגנון ברור של פעולה מזוהה, כמו במקרה של ridinilazole.
becausשיטה זו היא מאתגרת מבחינה טכנית, שינויים ייתכן שיהיה צורך על מנת לענות על השאלה המדעית כולל התא הכנה עקבית ושינויים ב sputtering של ציפוי זהב. ציפוי רב מדי עלול לטשטש את כל ההשפעות החיצוניות של התאים, אבל לא ציפוי מספיק יכול לגרום לחייב את קרן ו לסלף את התמונות. כדי למנוע זאת, להכין דוגמאות עם כמויות שונות של ציפוי זהב כדי לייעל את הזמן המקרטעת. לבסוף, מתודולוגיה עקבית בין המחקרים תאפשר השוואות בין-ניסיוניות.
מגבלה של שימוש ב- SEM היא כי הוא מוגבל לתצפיות מורפולוגיה התא התא; לפיכך, יש צורך במחקרים פונקציונליים כדי לאשר כל תגובה חשודה. בגלל זה, אנו מאמינים כי פרוטוקול הדמיה זה יכול לשמש כאמצעי לבימוי מחקרים תפקודיים. למרות הגבלה זו, תיוג immunogold יכול להיעשות באמצעות SEM לאשר כל השינויים החשודים בסחר בחלבון או צבירה;עם זאת, עדיין לא ערכנו ניסויים אלה.
בשל צינור פעיל של אנטיביוטיקה חדשה לטיפול C. difficile, הערכה יסודית יותר של פעילות סמים הוא הכרחי. כפי שמוצג כאן, SEM מציעה ייחודי, תפוקה גבוהה, הזדמנות אמינה לאפיין פעילות תרופתי. על ידי הדמיה של השפעות אנטיביוטיות שונות בין זנים שונים של C. difficile , נוכל להבין מדוע אנטיביוטיקה מסוימים יעילים יותר מאחרים כנגד זנים פתוגניים ספציפיים כמו המתח ב- 027 / NAP1 / BI. 14 יתר על כן, ניתוח SEM עשוי להיות מועיל להפלות השפעות אנטיביוטיות בין ribotypes או זנים יכול לשמש כדי לחקור מינים חיידקים אחרים הוכחת תחולת רחבה שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
