Abstract
혐기성 박테리아에 대한 신약 개발로 항생제 작용을 평가하는 것은 어렵고 기술적으로 까다 롭습니다. 가능한 MOA에 대한 통찰력을 얻으려면 항생제 노출과 관련된 형태 학적 변화를 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 전통적인 살인 곡선과 SEM 이미징을 통합하면 약물 작용에 대한 우리의 통찰력을 향상시키고 약물 개발 프로세스를 향상시킬 수 있습니다. 이 전제를 테스트하기 위해 알려진 MOA (vancomycin 및 metronidazole)를 가진 약물을 사용하여 곡선을 죽이고 SEM 연구를 수행했습니다. C. difficile 세포 (R20291)는 항생제의 존재 또는 부재하에 48 시간까지 성장시켰다. 48 시간 간격으로 항생제 유효성을 결정하고 SEM에서 영상을 얻기 위해 여러 시점에서 세포를 수집했습니다. 이전 보고서와 일치하여, vancomycin과 metronidazole은 식민지 형성 단위 (colony-forming unit, CFU)에서 측정 한 24 시간 처리 후에도 상당한 살균 활성을 보였다.팅. SEM 이미징을 사용하여 metronidazole은 대조군과 vancomycin에 비해 세포 길이에 유의 한 영향을 주었다 (각 항생제의 세포 길이가 50 % 이상 감소, P <0.05). 약물 치료에 대한 표현형 반응은 이전에 이러한 방식으로 문서화되지 않았지만, 약물의 MOA와 일관성이 있으며, 이미징 및 측정의 다양성과 신뢰성 및 다른 실험 화합물에 대한이 기술의 적용을 입증합니다.
Introduction
Clostridium difficile 은 그람 양성, 포자 형성 세균으로 매년 미국에서 약 50 만 건의 감염을 일으키며 질병 위험 예방 센터 (CDC)에서 위협 수준의 긴급 병원체로 간주됩니다. 1 지난 10 년 동안 C. difficile 에 대한 항균제 개발에 상당한 약물 개발이 있었습니다 . 2 , 3 시험 관내 연구는 약물 개발 과정의 필수 구성 요소입니다. 전통적으로 in vitro 감수성 및 시간 사멸 연구는 미래의 동물 및 기타 생체 내 연구를 검증하는 데 사용됩니다.
이 방법은 살상 행동을 평가하는 데 중요한 역할을하지만, 약리학 적 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 포착하지는 않습니다. 표준 전자 현미경 (SEM)을 통합하여동역학 연구를 중단하면 항생제 직접 효과에 대한보다 철저한 특성 분석이 가능하다. 5 , 6 , 7 여기서 우리는 SEM을 항생제 치료의 효능을 설명하는 수단으로 사용하는 방법을 제시한다.
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Protocol
1. 다른 환경 적 또는 임상 적 출처로부터 C. difficile의 분리
- 환경 분리 물 : 사전 멸균 된 면화 게이지 (0.85 % NaCl로 가볍게 적신)를 사용하여 관심 영역 (바닥, 문, 손잡이, 선반 등 )의 표면을 닦습니다. 8 멸균 된 장갑을 착용하고 완료된 후 멸균 된 튜브에 면봉을 놓습니다.
- 임상 분리 물 (대변) : 접종 루프를 사용하여 cefoxitin-cycloserine-fructose 한천 (CCFA)에 임상 대변 샘플 10 ~ 100 mg을 넣고 48 ~ 72 시간 동안 엄격한 혐기 조건 하에서 배양합니다. 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 cryovials에 C. difficile 스톡의 격리 된 식민지를 저장하십시오. 7 , 9 , 10
- 0.05 % sodium taurocholate가 포함 된 BHI (brain heart infusion) 배지에서 환경 면봉 샘플을 풍부하게 만들고 37 ° C의 혐기성 챔버에 두십시오5 일 동안. 10,000 XG에서 문화 1 ML 원심 분리기와 에탄올 100 μL에 펠렛을 resuspend.
- cycloserinecefoxitin fructose 한천 (CCFA) 플레이트 위에 resuspended 세포 (50 μL)를 플레이트하고 40에서 48 시간 37 ° C에서 혐기성 챔버에서 알을 품다. 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 cryovials에 C. difficile 스톡의 격리 된 식민지를 저장하십시오.
- 라텍스 응집제 또는 PCR을 사용하여 의심되는 C. difficile 콜로니를 시험합니다.
2. C. difficile의 배양 과 Kinetic Procedures의 사멸
- 37 ℃에서 48 시간 동안 혐기성 챔버에서 혈액 한천 평판에서 정제 된 환경 또는 임상 C. difficile 균주를 재배한다.
- 접종 루프로 격리 식민지 하나를 취해 15 mL 튜브에 5 mL BHI 배지로 옮기고 37 ℃에서 혐기성 챔버에서 24 시간 동안 성장시킵니다.
- 전 배양 물 1 : 100을 약 10 6 콜로니 형성 단위0.1 % 나트륨 타우로 콜레이트 및 항생제 (T0)의 적절한 농도로 보충 된 신선한 미리 감소 된 BHIS (BHI 플러스 5g / L 효모 추출물 및 1 % L- 시스테인)에서의 s (CFU) / mL.
- 각 시점 (T0, T6, T24, T48)에서 피펫으로 1 ML 샘플을 수집하고 접시 / 혈액 한천 접시에 작은 나누어 (100 μL 시리얼 희석으로) 확산. 37 ° C에서 혐기성 챔버에서 48 시간 동안 혈액 한천 플레이트에서 세포가 자라도록하고 결과 CFU 수를 계산합니다.
3. 전자 현미경 검사 용 샘플 준비
- microcentrifuge 튜브와 10 분 10,000 XG에서 원심 분리기의 각 시점에서 세포 1 ML을 수집합니다. 상등액을 버리고 PBS로 세포를 씻는다.
- 다시 10 분 동안 10,000 xg에서 샘플을 원심 분리하고 상등액을 버린다. 4 % paraformaldehyde 1 ML에 세포를 다시 희석하고 실온에서 1 시간 품어.
- 1시 10 분 동안 다시 원심 시료0,000 xg로 상등액을 버린다. 증류수로 세포를 두 번 씻고 증류수 100 μL로 다시 희석합니다. 솔루션의 탁도에 따라 볼륨을 조정합니다.
참고 : 여러 번 연속 희석을하는 것이 좋습니다. - coverslips 레이블을 추가하고 그것에 샘플의 40 μL을 추가합니다. 흐름 후드에서 15 분 동안 품어 액체를 증발시키고 세포가 coverslip에 고착하도록합니다. 액체가 여전히 남아 있으면 송풍기를 사용하여 액체를 제거하십시오.
- 탁상용 스퍼터링 기계 및 테이프에 셀을 넣은 커버 슬립을 배치하십시오. 스퍼터링 기계에 순금을 확보하십시오. 기계를 켜고 저압 (50 mTorr)에서 스퍼터링을 시작하십시오. 80 nm에서 30 초 동안 코팅 세포를 코팅하면 20 nm의 금 코팅이됩니다.
- 주사 전자 현미경으로 코팅 된 세포를 옮깁니다.
4. 주사 전자 현미경에서 영상 C. difficile 세포
- 주사 전자 현미경 (주사 전자 현미경)을 적절히 환기 시키십시오.컴퓨터 소프트웨어의 배출 버튼을 누르십시오.
- 카본 테이프를 사용하여 코팅 된 커버 슬립을 금속 스테이지에 고정시킵니다. SEM이 배출되면 문을 쉽게 열어야합니다. 금속 스테이지를 나사로 죄어 SEM 챔버에 잠급니다.
- 컴퓨터 소프트웨어에서 PUMP 버튼을 클릭하십시오. 시스템이 "Vac OK"라고 표시되면 SEM을 사용할 수 있습니다.
- Detector 탭에서 SE 탐지기를 클릭하십시오. 전압을 표시하는 버튼을 클릭하여 보를 켭니다. 전압을 높이기 전에 낮은 전압 (5 kV)에서 이미징을 시작하십시오 (최대 15 kV). 빔이 켜지면 이미지가 나타납니다.
- 추적 기능을 사용하여 코팅 된 커버 슬립에서 이미지를 볼 수있는 영역을 찾습니다. 지역을 확대하고 막대 모양의 구조를 찾습니다. 이들은 클로스 트리 디움 디피 실 입니다.
- 이미지를 확대하고 초점을 맞춰 시스템을 보정하십시오. 이 작업 거리는 15, 9 및 5 mm의 여러 작업 거리에서 수행해야합니다. 5mm의 작동 거리에서 이미지.
- 너를 켜라.ltra 고해상도 이미징 모드로 초점을 맞추고 난시를 최적화합니다.
- 높은 배율에서 초점을 맞추기 시작하십시오. 이를 위해 거친 초점과 미세한 초점을 사용하십시오. 더 명확한 이미지를 얻으려면 난시도 조정하십시오.
- 높은 배율로 난시를 조정하십시오. 이렇게하려면 비점 수식 토글 (미세한 / 거친 포커스 토글과 유사하게 보임)을 조정하고 컴퓨터 소프트웨어를 디지털 확대하여 명확하게 이미지를 확인하십시오.
- 고화질 이미지를 수집하는 느린 스캔 기능. 수집 된 이미지를 .TIFF 파일로 저장하면 분석에 사용됩니다. 분석 중에 측정이 이루어지면 데이터 막대가 선택되었는지 확인하십시오.
- SEM에서 직접 각도를 수동으로 돌리면 서로 다른 각도 (최대 52 °)에서 이미지를 수집 할 수 있습니다. 각 이미지는 깊이 정보를 더 많이 나타내는 경향이 있습니다.
- 이미징되는 셀에 따라 빔 전압을 변경하십시오. 이것을 모든 실험에서 5 - 15 kV로 유지하십시오. 이미징이 완료되면 빔을 끄고 작동 거리를 20 mm로 올립니다. 그런 다음 챔버를 배출하고 스테이지를 제거 할 수 있습니다. 추가 분석을 위해 모든 이미지를 드라이브에 복사하십시오.
5. 이미지 처리 및 분석
- 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어 인 FIJI (http://fiji.sc)를 다운로드하여 컴퓨터에 설치하십시오.
- FIJI에서 이미지 파일을 엽니 다.
- 선 기능을 사용하여 스케일 바를 정확하게 추적하십시오.
- FIJI 프로그램에서 Analyze 탭을 클릭하고 Select Scale 기능을 선택하십시오. 눈금 막대를 기준으로 알려진 거리를 설정해야하는 창이 나타납니다. 길이 단위도 변경하고 확인을 클릭하십시오.
- 이제 프로그램이 거리에 대해 보정되었으므로 라인 함수를 사용하여 셀 길이를 측정합니다. 길이를 얻으려면 line 함수를 사용하여 셀 전체를 추적하십시오. 분석 탭을 다시 선택한 다음 측정을 클릭하십시오. 길이는 app이어야합니다.귀는 이전에 표시된 단위로.
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Representative Results
Clostridium difficile 은 포자 형성 세균이며 기능 분석 전에 식물과 포자 세포 사이의 형태 학적 차이를 결정하는 것이 필수적입니다. 그림 1 은 성장 곡선과 포자 세포의 지수 단계에서 캡처 한 식물 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 묘사 된 바와 같이 식물 세포는 길고 매끄 럽고 막대 모양의 구조이며 포자는 거칠고 외형이 작은 타원형 구조입니다. 기능적으로 식물 세포는 빠르게 자라며 분열하며 독소를 분비함으로써 C.difficile 감염의 병독성을 일으키는 반면, 포자는 일반적으로 거의 활동하지 않으면 서 휴면 상태입니다. 따라서 항생제는 식물 세포에 대해 주로 활성 인 반면, 포자는 DNA로 코어를 보호하는 여러 층과 생리 활성이 없기 때문에 약물 치료에 일반적으로 저항합니다. 이 사실로 인해,형태 학적 분석은 식물 세포에 초점을 맞추고있다. 11 , 12
항생제 살인 곡선은 성장하는 박테리아에 대한 항생제 효능을 입증하는 표준 방법입니다. C. difficile 균주 R20291에 사용 된 농도는 MIC 값을 기준으로하였고, vancomycin은 1 μg / mL, metronidazole은 0.51 μg / mL를 기준으로 하였다. 도 2 에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포는 성장하여 고원에 도달하는 반면, 처리 된 세포는 전체 콜로니 형성 단위 (CFU)에서 검출 한계 (LOD)까지 감소하여 살균 효과를 나타낸다. 입증 된 바와 같이 vancomycin ( 그림 2A )과 metronidazole ( 그림 2B )은 supraMIC 농도 (4xMIC)에서 C. difficile 을 죽이는 데 효과적입니다. 사람은 항생제 죽이는 곡선이 유사하게 보일지도 모른다. 그러나 마약은 ac(반코마이신 (vancomycin)은 세포벽 합성을 방해하는 반면 metronidazole은 DNA 복제에 영향을 미친다). 그러므로 우리는 항생제 살인 곡선이이 항생제들 사이에 상세한 차이를 제공 할 정도로 차별적 인 힘을 가질 수 없다고 제안한다. 우리는 더 많은 차별을 제공하기 위해 현미경을 사용했습니다.
그것의 현미경 크기 때문에, C. difficile 는 고배율 없이는 이미지 화가 불가능합니다. 이것은 나노 미터 규모의 해상도를 얻을 수있는 이미징 방법 인 주사 전자 현미경 (scanning electron microscopy, SEM)을 사용하여 항생제 치료가 세포에 직접 미치는 자세한 효과를 평가할 수있는 기회를 제공했습니다. 이 접근법의 유용성을 입증하기 위해 약물 치료 전후에 세포를 이미지화하여 형태학이 어떻게 변했는지 확인했습니다 ( 그림 3A ). 입증 된 바와 같이, 일부 세포의 벽은 반코마이신의 경우와 같이 영향을 받았고 일부 세포는 크기가 작았으며,메트로니다졸의 경우와 마찬가지로 셀 크기가 영향을 받는지 테스트하기 위해 FIJI 프로그램을 사용하여 셀 길이를 분석했습니다. 식물 세포 크기는 대조군에서 약간 다를 수 있지만, 대부분 길이가 대략 6 μm이다 ( 그림 3B ). 통제 및 치료 환경에서 많은 세포를 고려할 때 세포 길이가 메트로니다졸에서 우선적으로 영향을 받지만 반코마이신 치료 ( 그림 3C )에는 영향을받지 않음을 신속하게 알 수 있습니다.
그림 1 : 주사 전자 현미경으로 세포 유형을 구별. Clostridium difficile 식물 및 포자 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다 . 식물 세포는 길고 평평한 막대 구조입니다. 반대로, 포자 세포는 작고 거칠고 울퉁불퉁 한 외피를 가지고 있습니다. 포자는 이미지 purpo를 위해 pseudo-colored red입니다.단지 ses. 이미지에 스케일 막대가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 항생제 타임 킬 곡선. SupraMIC 사멸 곡선은 4 개의 다른 항생제, 즉 vancomycin (A) , metronidazole (B)에 대해 수행 되었다. 이 항생제는 C. difficile 균주 R20291에 대해 현저한 살상 작용을 나타내었고 콜로니 형성 단위 (CFU) 계산을위한 검출 한계 (LOD)에 근접했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 항생제 치료의 약리학 적 효과 검토 처리 된 세포와 처리되지 않은 세포의 이미지는 킬링 동역학 연구 (A)를 통해 여러 시점에서 촬영되었습니다. 길이 (B) 에 대해 측정 된 대조군 식물 세포의 대표적인 예가 제시되어있다. 처리 및 비 처리 세포를 측정하고 비교 하였다 (C) . 실험은 적어도 중복하여 실시되었으며 그룹당 17 개 이상의 세포가 측정되었습니다. * 대조군과 vancomycin 치료군에 비해 P <0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 연구의 목표는 C. difficile을 분리 하고 항생제의 약리 작용을보다 철저히 특성화하기위한 수단으로 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 항생제 감수성을 검사하는 높은 처리량 방법을 만드는 것이 었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 우리는 항생제 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 이미지화하면 약물의 약리 작용에 대한 통찰력을 확인할 수 있음을 입증했습니다. 전체적으로,이 프로토콜의 이미징 부분은 세포를 수집 한 후 약 2 시간이 걸리지 만 일반적인 킬링 반응 연구보다 훨씬 더 차별적 일 수 있습니다. SEM을 사용하는 것을 기술적으로 요구할 수 있지만 샘플을 준비하는 것은 비교적 간단하고 빠릅니다. 우리는 여기에 설명 된 이러한 프로토콜이 항생제 치료의 약리 작용을 평가하는 객관적인 접근 방법을 제공 할 것이라고 믿는다.
t 간의 유사성 고려그는 항생제 죽이는 곡선 ( 그림 2 ), 우리가 약리 치료에 대한 세포의 반응 사이에 차이가 있는지 여부를 결정하려고했습니다. SEM을 사용하여, 우리는 메트로니다졸이 약물의 supraMIC 농도에서 세포 길이에 영향을 미친다는 것을 결정했다. 이러한 표현형은 이전에보고 된 적이 없지만 항생제의 작용 메커니즘과 일치하며 세포 대사 및 성장에 미치는 영향을 제안합니다. 대조적으로, 반코마이신은 세포벽에 상당한 영향을 미치며, 이는 또한 작용 기작과 일치한다. 이 항생제들 사이의 사멸 동역학에는 유사점이 있지만 SEM 이미지를 보면 명백한 표현형 차이가 있음이 분명합니다. 항생제 표현형 라이브러리를 만드는 것은 ridinilazole의 경우와 같이 확인 된 작용 메커니즘이 명확하지 않은 약물의보다 철저한 특성 분석을 가능하게합니다.
베타우스이 방법은 기술적으로 어렵습니다. 일관된 세포 준비 및 금 코팅 스퍼터링의 변경을 포함하여 과학적 문제를 해결하기 위해 수정이 필요할 수 있습니다. 너무 많은 코팅은 셀 외부의 모든 효과를 흐리게 할 수 있지만 코팅이 충분하지 않으면 빔을 충전하고 이미지를 왜곡시킬 수 있습니다. 이를 방지하려면 스퍼터링 시간을 최적화하기 위해 다양한 양의 금 코팅으로 샘플을 준비하십시오. 마지막으로, 연구 간 일관된 방법론은 실험 간 비교를 가능하게합니다.
SEM을 사용하는 한계는 세포 형태 변화를 관찰하는 것으로 제한된다는 것입니다. 따라서 의심되는 반응을 확인하기 위해 기능적 연구가 필요합니다. 이 때문에 우리는이 영상 프로토콜이 기능적 연구를 지시하는 수단으로 사용될 수 있다고 믿습니다. 이 제한에도 불구하고, 면역 골드 라벨링은 SEM을 사용하여 단백질 밀매 또는 응집의 의심되는 변화를 확인할 수 있습니다.그러나 우리는 아직이 실험을 수행하지 않았습니다.
C. difficile 치료를위한 새로운 항생제의 활성 파이프 라인으로 인해 약물 활동에 대한보다 철저한 평가가 필요합니다. 여기에 제시된 바와 같이 SEM은 약리학 적 작용을 특성화하기위한 독특하고 높은 처리량의 안정적인 기회를 제공합니다. 여러 가지 다른 항생제 효과를 C. difficile 의 다른 균주간에 이미징함으로써 우리는 027 / NAP1 / BI 전염병과 같은 특정 병원성 균주에 대해 다른 항생제보다 다른 항생제가 왜 더 효과적인지 이해할 수있을 것입니다. 또한 SEM 분석은 ribotypes 또는 균주간에 항생제 효과를 구별하는 데 도움이 될 수 있으며 광범위한 적용 가능성을 보여주는 다른 세균 종을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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