Abstract
Anaerobik bakterilere yönelik yeni ilaç geliştirme ile antibiyotik eyleminin değerlendirilmesi zor ve teknik olarak zorunludur. Olası MOA'yı anlamak için antibiyotik maruziyeti ile ilişkili morfolojik değişiklikler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak görüntülenebilir. SEM görüntülemeyi geleneksel öldürme eğrileri ile bütünleştirmek ilaç eylemi konusundaki görüşümüzü geliştirebilir ve ilaç geliştirme sürecini ilerletebilir. Bu önceliği test etmek için, eğrileri öldürün ve SEM çalışmaları, bilinen fakat farklı MOA'lı (vankomisin ve metronidazol) ilaçlarla gerçekleştirildi. C. difficile hücreleri (R20291) 48 saate kadar antibiyotik varlığında veya yokluğunda yetiştirildi. 48 saatlik aralık boyunca, antibiyotik etkinliğini belirlemek ve SEM'de görüntüleme yapmak için hücreler çoklu zaman noktalarında toplandı. Önceki raporlarla uyumlu olarak, vankomisin ve metronidazolün, koloni oluşturan birim (CFU) konseyleri ile ölçülen 24 saatlik tedaviyi takiben önemli miktarda bakterisid aktivitesi vardıting. SEM görüntüleme yöntemini kullanarak, metronidazolün, kontroller ve vankomisin ile karşılaştırıldığında hücre uzunluğu (her bir antibiyotik için hücre uzunluğunda>% 50 azalma; P <0.05) üzerine önemli etkileri olduğunu saptadık. İlaç tedavisine fenotipik tepki daha önce bu şekilde belgelenmemesine karşın, ilacın MOA'sıyla tutarlıdır ve görüntüleme ve ölçümlerin çok yönlülüğü ve güvenilirliği ile bu tekniğin diğer deneysel bileşikler için uygulanmasını göstermektedir.
Introduction
Clostridium difficile , gram pozitif, spor oluşturan bir bakteridir ve ABD'de yılda yaklaşık 500.000 enfeksiyona neden olur ve en yüksek risk seviyesi olan Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından bir tehdit seviyesi acil patojen olarak değerlendirilir. Son on yılda, C. difficile'ye karşı aktivite gösteren antimikrobiyallerde önemli ilaç geliştirme görüldü . 2 , 3 İn vitro çalışmalar ilaç geliştirme sürecinin gerekli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, in vitro duyarlılık ve zaman öldürme çalışmaları gelecek hayvan ve diğer in vivo çalışmaların geçerliliğini doğrulamak için kullanılır.
Bu yöntemler öldürme eylemini değerlendirmek için önemli bir rol oynamakla birlikte, hücrelerin farmakolojik tedaviye fenotipik tepki vermezler. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) standart ile birleştirilerekKinetik çalışmaları öldürdüğünde, antibiyotik direkt etkilerinin daha ayrıntılı bir şekilde tanımlanması mümkündür. 5 , 6 , 7 Burada, SEM'in antibiyotik tedavisinin etkililiğini gösteren bir araç olarak kullanıldığı bir yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Farklı çevre veya klinik kaynaklardan C. difficile'nin izolasyonu
- Çevresel izolatlar: Önceden sterilize edilmiş bir pamuk göstergesi (hafifçe 0,85% NaCl ile ıslatılmış) kullanarak herhangi bir alanın yüzeyini (zemin, kapı, kol, raf vb. ) Sürünüz. 8 Steril eldiven giydiğinizden ve svabın tamamlandıktan sonra sterilize edilmiş bir tüpe konulduğundan emin olun.
- Klinik izolatlar (dışkı): Bir aşılama döngüsünü kullanarak 10 ila 100 mg klinik dışkı örnekleri plakositit sikloserin-fruktoz agar (CCFA) üzerine plakaya alın ve 48 - 72 saat katı anaerobik koşullar altında inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C'de cryovials'de saklayın. 7 , 9 , 10
- Beyinde kalp infüzyonu (BHI) sosundaki çevresel swab örneklerini% 0.05 sodyum taurokolat ile zenginleştirin ve 37 ° C'de anaerobik bir bölmeye yerleştirin5 gün boyunca. 10,000 xg'de kültürün 1 mL'sini santrifüjleyin ve pelleti 100 uL etanol içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- Yeniden süspanse hücreleri (50 mcL) sikloserinecefoxitin fruktoz agar (CCFA) plakaları üzerine plak ve 40 - 48 saat boyunca 37 ° C bir anaerobik odada inkübe edin. C. difficile stokunun izole edilmiş kolonilerini daha ileri analizler için -80 ° C'de cryovials'de saklayın.
- Şüpheli C. difficile kolonilerini lateks aglutinasyon reaktifi veya PCR kullanarak test edin.
2. C. difficile Kültürü ve Kinetik Prosedürleri Öldürme
- Saflaştırılmış çevresel veya klinik C. difficile suşlarını kan agar plakalarında, anaerobik bölmede 37 ° C'de 48 saat büyütün.
- Bir izole edilmiş koloni bir inokülasyon döngüsü ile alın, 15 mL'lik bir tüp içinde 5 mL BHI ortamına aktarın ve 37 ° C'de anaerobik bölmede 24 saat büyür.
- Kültür öncesi 1: 100'ü yaklaşık 10 6 koloni oluşturan birime inceltin% 0.1 sodyum taurokolat ve uygun antibiyotik konsantrasyonu (T0) ile takviye edilmiş taze ön indirgenmiş BHIS (BHI artı 5 g / L maya ekstraktı ve% 1 L-sistein) içinde s (CFU) / mL.
- Her zaman noktasında (T0, T6, T24, T48) bir pipetle 1 mL numune toplayın ve bir kan agar plakasına küçük bir alikuot (seri seyreltmelerde 100 uL) yayın. Hücreler, 37 ° C'de anaerobik bir odada 48 saat süreyle kan agar plakasında büyümelerine ve sonuç olarak CFU'yu belirlemek için kolonilerin sayısının saymasına izin verin.
3. Taramalı Elektron Mikroskopisi için Numunelerin Hazırlanması
- Mikrosantrifüj tüpleri her zaman noktasından 1 ml hücre toplayın ve 10 dakika için 10,000 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri PBS'de yıkayın.
- Örnekleri 10.000 xg'de tekrar 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 1 mL% 4 paraformaldehid içinde hücreleri tekrar seyreltin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Numuneleri 1'de 10 dakika santrifüjleyin0,000 xg ve süpernatantı atın. Hücreleri damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve 100 uL damıtılmış su içinde yeniden doyurun. Solüsyonun bulanıklığına bağlı olarak hacmi ayarlayın.
NOT: Birden fazla seri seyreltme yapmak iyi bir fikirdir. - Lamelleri etiketleyin ve üzerinde 40 μL örnek ekleyin. Sıvı buharlaştırmak ve hücrelerin lamel bağlı kalmasına izin vermek için bir akış davlumbaz 15 dakika inkübe edin. Sıvı hala mevcutsa, sıvıyı çıkarmak için bir üfleyici kullanın.
- Etiketli lamelleri hücrelerle birlikte masa üstü püskürtme makinesine yerleştirin ve bandı bantlayın. Püskürtme makinesinde saf altını koruyun. Makineyi açın ve düşük basınçta (50 mTorr) püskürtme işlemine başlayın. 80 mA'de 30 saniye boyunca kaplayın, bu da 20 nm altın kaplamaya dönüşür.
- Kaplanmış hücreleri taramalı elektron mikroskopuna aktarın.
4. Taramalı Elektron Mikroskopta C. difficile Hücrelerini Görüntüleme
- Tarama elektron mikroskobunu (SEM) pr tarafından uygun şekilde havalandırınBilgisayar yazılımındaki havalandırma düğmesine basarak.
- Karbon bant kullanarak, kaplı lamelleri metal sahne üzerine sabitleyin. SEM havalandıktan sonra, kapı kolayca açılmalıdır. Metal etabı SEM odasına vidalayarak kilitleyin.
- Bilgisayar yazılımındaki PUMP düğmesini tıklayın. Sistem "Vac OK" yazısını okuduğunda SEM kullanılabilir.
- Dedektörler sekmesinin altındaki SE dedektörünü tıklayın. Voltajı gösteren düğmeyi tıklayarak kirişi açın. Gerilimi arttırmadan önce görüntülemeyi daha düşük bir voltajda (5 kV) başlatın (15 kV'a kadar). Işın açıldıktan sonra bir görüntü belirir.
- İzleme işlevini kullanarak, görüntü için kaplamalı lamelleri üzerinde bir alan bulun. Bölgeyi büyütüp çubuk şeklinde yapılar bulmak; Bunlar clostridium difficile .
- Sistemi kalibre etmek için görüntüyü yakınlaştırın ve odaklanın. Bu, çoklu çalışma mesafelerinde yapılmalıdır: 15, 9 ve 5 mm. Çalışma mesafesi 5 mm olan görüntü.
- Seni açLtra yüksek çözünürlüklü görüntüleme modu ile odaklanır ve astigmatizmayı yoğunlaştırmaya ve optimize etmeye başlar.
- Yüksek büyütme noktasına odaklanmaya başlayın. Bunun için kaba ve ince odak geçişlerini kullanın. Astigmatizmayı daha net bir görüntü elde etmek için de ayarlayın.
- Astigmatizmayı yüksek büyütmede ayarlayın. Bunu yapmak için, astigmatizm geçişlerini ayarlayın (ince / kaba odak geçişlerine benzer) ve bilgisayar yazılımını dijital olarak yakınlaştırarak netlik için görüntüyü kontrol edin.
- Yüksek kaliteli bir görüntü toplamak için yavaş tarama işlevini seçin. Toplanan görüntüyü, analiz için kullanılacak .TIFF dosyası olarak kaydedin. Analizler sırasında ölçümler yapılacaksa, veri çubuğunun seçili olduğundan emin olun.
- Farklı açılardaki (52 ° 'ye kadar) görüntüleri direkt olarak SEM üzerinde döndürerek elde edin Açılı görüntüler daha fazla derinlik bilgisi ortaya çıkarmak eğilimindedir.
- Görüntüleme yapılan hücrelere bağlı olarak ışın voltajını değiştirin. Bunu tüm deneyler için çoğunlukla 5 - 15 kV arasında tutun. Görüntüleme tamamlandıktan sonra ışını kapatın ve çalışma mesafesini 20 mm'ye yükseltin. Daha sonra hazne havalandırılabilir ve sahne çıkarılabilir. Daha fazla analiz için tüm görüntüleri bir sürücüye kopyalayın.
5. Görüntü İşleme ve Analiz
- Ücretsiz olarak bulunan FIJI (http://fiji.sc) yazılımını bilgisayara indirin ve yükleyin.
- Resim dosyasını FIJI'da açın.
- Çizgi işlevini kullanarak, ölçek çubuğunu tam olarak izleyebilirsiniz.
- FIJI programındaki Analiz sekmesini tıklayın ve nihayet Ölçeği Seç işlevini seçin. Ölçek çubuğuna dayalı bilinen mesafenin ayarlanmasını gerektiren bir pencere belirecektir. Uzunluğu birimi de değiştirin ve Tamam'ı tıklayın.
- Artık program mesafe için kalibre edildi, hücre uzunluğunu ölçmek için hat fonksiyonunu kullanın. Uzunluğu elde etmek için hücrenin tamamını izlemek için line fonksiyonunu kullanın. Çözümle sekmesini tekrar seçin ve ardından Ölçüm'e tıklayın. Uzunluk uygulaması olmalıdırDaha önce belirtilen birimlerdeki kulak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile , spor oluşturan bir bakteridir ve bu nedenle herhangi bir fonksiyonel analizden önce vejetatif ve spor hücreleri arasındaki morfoloji farklılıklarını belirlemek esastır. Şekil 1 , büyüme eğrisinin üstel fazında ve spor hücrelerinde yakalanan vejetatif hücrelerin temsili görüntülerini göstermektedir. Resimde görüldüğü gibi vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılarken, sporlar kaba bir dış görünümü olan küçük oval yapılardır. İşlevsel olarak vejetatif hücreler hızla büyür ve bölünürler ve C. difficile enfeksiyonlarının toksinleri salgılarken virulanslarından sorumludurlar, oysa sporlar normalde az aktivite ile uyku halindedir. Dolayısıyla, antibiyotikler çoğunlukla vejetatif hücrelere karşı aktifken sporlar çekirdeği DNA ile koruyan birkaç katmana ve fizyolojik aktivite eksikliğine bağlı olarak genellikle ilaç tedavisine dirençlidir. Bu gerçekler yüzünden çoğunlukMorfolojik analiz bitkisel hücreler üzerinde yoğunlaşmıştır. 11 , 12
Bir antibiyotik öldürme eğrisi, büyüyen bakterilere karşı antibiyotik etkinliğini gösteren standart metodolojidir. C. difficile suşu R20291 ile kullanılan konsantrasyonlar, vankomisin için 1 μg / mL ve metronidazol için 0.51 μg / mL MIC değerlerine dayanıyordu. Şekil 2'de gösterildiği gibi, kontrol hücreleri büyür ve bir platoya erişirken, muamele edilen hücreler toplam koloni oluşum biriminde (CFU), bakterisidal etki gösteren saptama limitine (LOD) düşer. Gösterildiği üzere, vankomisin ( Şekil 2A ) ve metronidazol ( Şekil 2B ), C. difficile'yi supraMIC konsantrasyonlarında (4xMIC) öldürmede etkilidir. Biri, antibiyotik öldürme eğrilerinin benzer görünmesini, ancak ilaçların farklı acemik mekanizmalara sahip olduğunu fark edebilir(Vankomisin hücre duvar sentezini önlerken metronidazol DNA replikasyonunu etkiler). Bu nedenle, antibiyotik öldürme eğrilerinin, bu antibiyotikler arasında ayrıntılı farklar sağlamak için yeterince ayrımcı bir güce sahip olmayabileceğini önermekteyiz. Daha fazla ayrım yapmak için mikroskopi kullandık.
Mikroskobik boyutu nedeniyle, C. difficile , yüksek büyütme olmadan görüntü yapmak mümkün değildir. Bu, antibiyotik tedavisinin doğrudan hücreler üzerindeki detaylı etkilerini değerlendirmek için nanometre ölçeğinde çözünürlük elde edebilen bir görüntüleme yöntemi olan taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanımı için bir fırsat sağladı. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, morfolojinin nasıl değiştiğini belirlemek için ilaç tedavisinden önce ve sonra hücreler görüntülendi ( Şekil 3A ). Gösterildiği gibi, vankomisinin durumunda olduğu gibi bazı hücrelerin duvarları etkilenmiştir ve bazı hücrelerin boyutu daha küçüktür,Metronidazol için olduğu gibi. Hücrenin boyutunun etkilenip etkilenmediğini test etmek için FIJI programı kullanılarak hücre uzunluğunu analiz ettik. Vejetatif hücre büyüklüğü kontrol vakalarında çeşitlilik gösterebilir ancak çoğu kabaca 6 μm uzunluğundadır ( Şekil 3B ). Kontrol ve tedavi edilen birçok hücreyi düşünürken, hücre uzunluğunun metronidazole'de tercihan etkilenirken vankomisin tedavisinden etkilenmediği de hızla fark edilebilir ( Şekil 3C ).
Şekil 1: Taramalı Elektron Mikroskopisi ile Hücre Türleri Arasında Farklılaşma. Gösterilen Clostridium difficile vegetatif ve spor hücrelerinin temsili görüntüleridir. Vejetatif hücreler, uzun ve bayraklı çubuk yapılardır. Aksine, spor hücreleri küçüktür ve kaba ve inişli bir ceket içerirler. Sporlar, görüntü purpo için psödo-kırmızı renklidirSadece sesler. Ölçek çubukları görüntülerde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Antibiyotik Zaman Kill Eğrileri. SupraMIC öldürme eğrileri dört farklı antibiyotik için gerçekleştirildi: vankomisin (A) , metronidazol (B) . Bu antibiyotiklerin C. difficile suşu R20291'e karşı önemli derecede öldürme etkisi vardır ve koloni oluşturma ünitelerini (CFU) saymak için saptama limitine (LOD) yaklaşmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Antibiyotik Tedavisinin Farmakolojik Etkilerinin İncelenmesi. İşlem görmüş ve işlem görmeyen hücrelerin imgeleri öldürme kinetik çalışmaları boyunca çoklu zaman noktalarında alındı (A) . Gösterilen uzunluk (B) için ölçülen kontrol vejetatif hücrenin temsili bir örneğidir. Tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş hücreler ölçüldü ve karşılaştırıldı (C) . Deneyler en azından iki kez tekrarlandı ve grup başına> 17 hücre ölçüldü. Kontrol ve vankomisin tedavi gruplarına kıyasla * P <0.05. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, C. difficile'yi izole etmek için yüksek verimli bir yöntem oluşturmak ve antibiyotik farmakolojik etkisinin daha kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi için bir araç olarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak antibiyotik duyarlılığını test etmektir. Burada özetlenen protokolleri kullanarak, hücrenin antibiyotik tedavisine fenotipik tepki görüntülemenin ilacın farmakolojik etkisine dair bilgiler sağlayabileceğini gösterdik. Toplamda, bu protokolün görüntüleme kısmı, hücreleri topladıktan sonra yaklaşık 2 saat sürer, ancak tek başına tipik öldürme kinetik çalışmalarından çok daha ayrımcı olabilir. Bir SEM kullanmayı öğrenmek teknik olarak zor olabilirken, numunelerin hazırlanması nispeten basit ve hızlıdır. Burada özetlenen bu protokollerin antibiyotik tedavisinin farmakolojik etkisini değerlendirmede objektif bir yaklaşım sağlayacağına inanıyoruz.
T arasındaki benzerlikleri göz önünde bulundurarakO antibiyotik öldürme eğrileri ( Şekil 2 ), hücrenin farmakolojik tedaviye yanıtı arasında farklar olup olmadığını belirlemeye çalıştık. SEM'i kullanarak, metronidazolün uyuşturucunun supraMIC konsantrasyonlarında hücre uzunluğu üzerinde etkili olduğunu saptadık. Bu fenotipler daha önce bildirilmediği halde, antibiyotiklerin etki mekanizmaları ile tutarlıdır ve hücre metabolizması ve büyümesi üzerinde bir etki olduğunu düşündürmektedir. Buna karşılık, vankomisin hücre duvarı üzerinde de etki mekanizması ile tutarlı olan önemli etkilere sahiptir. Bu antibiyotikler arasındaki öldürme kinetiği arasında benzerlikler olsa da, SEM görüntülerinden önemli fenotipik farklılıklar olduğu açıktır. Bir antibiyotik fenotipi kütüphanesi oluşturmak, ridinilazol durumunda olduğu gibi belirgin bir etki mekanizması bulunmayan ilaçların daha kapsamlı bir şekilde tanımlanmasına izin verecektir.
becausE bu yöntem teknik açıdan zorlayıcıdır, tutarlı hücre hazırlığı ve altın kaplamanın püskürtülmesindeki değişiklikler de dahil olmak üzere bilimsel sorunun ele alınması için değişiklikler yapılması gerekebilir. Çok fazla kaplama, hücrelerin dış yüzeyindeki herhangi bir etkiyi bulanıklaştırabilir, ancak yeterli miktarda kaplama kirişin şarj edilmesine ve görüntülerin bozulmasına neden olabilir. Bunu önlemek için, püskürtme süresini optimize etmek için farklı miktarlarda altın kaplama örnekleri hazırlayın. Son olarak, çalışmalar arasındaki tutarlı metodoloji, deneyler arası karşılaştırmaların yapılmasına izin verecektir.
SEM'i kullanmanın bir sınırlaması, hücre morfolojisi değişikliklerini gözlemlemekle sınırlı olmasıdır; Bu nedenle, şüphelenilen bir cevabı doğrulamak için fonksiyonel çalışmalar gereklidir. Bu nedenle, bu görüntüleme protokolünün fonksiyonel çalışmaları yönlendirmek için bir araç olarak kullanılabileceğine inanıyoruz. Bu sınırlamaya rağmen, imünogold etiketlemesi, protein kaçakçılığında veya agregasyonda şüphelenilen değişiklikleri doğrulamak için SEM kullanılarak yapılabilir;Bununla birlikte, henüz bu deneyleri henüz gerçekleştirmedik.
C. difficile tedavisi için yeni antibiyotiklerin aktif olarak devreye sokulması nedeniyle, ilaç hareketinin daha kapsamlı bir değerlendirmesi gerekiyor. Burada sunulan şekilde, SEM, farmakolojik hareketi karakterize etmek için benzersiz, yüksek verimli ve güvenilir bir fırsat sunar. C. difficile'nin farklı suşları arasında birçok farklı antibiyotik etkisini görüntüleyerek , neden bazı antibiyotiklerin 027 / NAP1 / BI epidemik suşu gibi spesifik patojen suşlara karşı daha etkili olduklarını anlayabiliyor olacağız. Ayrıca, SEM analizi, ribotipler ya da suşlar arasındaki antibiyotik etkilerini ayırt etmede yardımcı olabilir ve geniş uygulanabilirliğini gösteren diğer bakteri türlerini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
