Abstract
Beoordeling van antibiotische werking met nieuwe geneesmiddelontwikkeling gericht op anaërobe bacteriën is moeilijk en technisch veeleisend. Om inzicht te krijgen in mogelijke MOA, kunnen morfologische veranderingen in verband met de blootstelling aan antibiotica worden gedetecteerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het integreren van SEM imaging met traditionele kill curves kan ons inzicht in drugsactie verbeteren en het drugontwikkelingsproces bevorderen. Om dit uitgangspunt te testen werden dodenkrommen en SEM-studies uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen met bekende maar verschillende MOA (vancomycine en metronidazool). C. difficiele cellen (R20291) werden tot 48 uur met of zonder aanwezigheid van antibiotica gegroeid. Gedurende het 48 uur interval werden cellen verzameld op meerdere tijdspunten om de doeltreffendheid van antibiotica te bepalen en voor beeldvorming op de SEM. In overeenstemming met eerdere verslagen had vancomycine en metronidazole significante bactericide activiteit na 24 uur behandeling zoals gemeten door kolonievormende eenheid (CFU) landenting. Met behulp van SEM beeldvorming bleken we dat metronidazol significante effecten op cellengte had (> 50% reductie in cellengte voor elk antibioticum, P <0,05) in vergelijking met controles en vancomycine. Hoewel de fenotypische respons op medicijnbehandeling niet eerder op deze wijze is gedocumenteerd, zijn ze consistent met de MOA van het geneesmiddel, die de veelzijdigheid en betrouwbaarheid van de beeldvorming en metingen en de toepassing van deze techniek voor andere experimentele verbindingen aantoont.
Introduction
Clostridium difficile is een gram positieve , spore-vormende bacterie, die jaarlijks ongeveer 500.000 infecties veroorzaakt in de VS en wordt beschouwd als een dringend ziekteverwekkend patiënt door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), het hoogste risico. 1 Het afgelopen decennium heeft aanzienlijke drugontwikkeling in antimicrobiële stoffen met activiteit tegen C. difficile gezien . 2 , 3 In vitro studies zijn een noodzakelijk onderdeel van het geneesmiddelontwikkelingsproces. 4 Traditioneel worden in vitro gevoeligheids- en tijddodenstudies gebruikt om toekomstige dieren en andere in vivo studies te valideren.
Hoewel deze methoden een belangrijke rol spelen bij het evalueren van doden, nemen ze de fenotypische reactie van de cellen niet op de farmacologische behandeling vast. Door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op te nemen met standarD doden van kinetische studies, is een meer grondige karakterisering van de antibiotische directe effecten mogelijk. 5 , 6 , 7 Hier presenteren wij een methode waarbij SEM gebruikt wordt als middel om de werkzaamheid van antibioticabehandeling te profileren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van C. difficile uit verschillende milieu- of klinische bronnen
- Milieuisolaten: Gebruik een voorgesteriliseerd katoenmeter (licht bevochtigd met 0,85% NaCl), snijd het oppervlak van een bezienswaardigheid (vloer, deur, handvat, plank, enz. ). 8 Zorg ervoor dat u steriele handschoenen draagt en de doek in een gesteriliseerde buis plaatst nadat u klaar bent.
- Klinische isolaten (ontlasting): Plaat 10 tot 100 mg klinische ontlastingmonsters op cefoxitine-cycloserine-fructose-agar (CCFA) met een inentingslus en incuberen onder strikte anaërobe omstandigheden gedurende 48 - 72 uur. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses. 7 , 9 , 10
- Verrijk de zuivelmonsters in de hersenhart infusie (BHI) bouillon met 0,05% natriumtaurocholaat en plaats in een anaërobe kamer bij 37 ° CVoor 5 dagen. Centrifugeer 1 ml van de kweek bij 10.000 xg en resusteer de pellet in 100 μl ethanol.
- Platte de geresuspendeerde cellen (50 μl) op cycloserinecefoxitine fructose agar (CCFA) platen en incubeer gedurende 40-48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C. Bewaar geïsoleerde kolonies van C. difficile voorraad in cryovials bij -80 ° C voor verdere analyses.
- Test verdachte C. difficile kolonies met behulp van het latexagglutineringsreagens of PCR.
2. Culturing C. difficile en Killing Kinetische Procedures
- Groei gezuiverde milieu- of klinische C. difficile stammen op bloedagarplaten in een anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 48 uur.
- Neem één geïsoleerde kolonie met een inoculatielus, zet het over in 5 ml BHI-medium in een 15 ml buis en groei gedurende 24 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C.
- Verdun de pre-culturen 1: 100 tot ongeveer 10 6 kolonievormende eenheidS (CFU) / ml in vers voorverdiend BHIS (BHI plus 5 g / l gist extract en 1% L-cysteïne) aangevuld met 0,1% natriumtaurocholaat en de juiste concentratie antibiotica (T0).
- Verzamel een 1 ml monster met een pipet op elk tijdstip (T0, T6, T24, T48) en plaat / verspreid een kleine aliquot (100 μL in seriële verdunningen) op een bloedagarplaat. Laat de cellen op 48 uur in een anaërobe kamer bij 37 ° C groeien en tel het resulterende aantal kolonies om CFU te bepalen.
3. Het voorbereiden van monsters voor het scannen van elektronenmicroscopie
- Verzamel 1 ml cellen van elk tijdstip in microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en wascellen in PBS.
- Centrifugeer de monsters opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 minuten en wrijf de supernatant af. Re-verdunde cellen in 1 ml 4% paraformaldehyde en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de monsters opnieuw gedurende 10 minuten bij 10,000 xg en weggooien supernatant. Was cellen tweemaal met gedestilleerd water en roer in 100 μl gedestilleerd water. Pas volume aan, afhankelijk van de troebelheid van de oplossing.
OPMERKING: Het maken van meerdere seriële verdunningen is een goed idee. - Etiket deksels en voeg 40 μL van het monster erop. Incubeer gedurende 15 minuten in een debiet om de vloeistof te verdampen en laat de cellen aan de deklaag kleven. Als er nog vloeistof aanwezig is, gebruik een ventilator om de vloeistof te verwijderen.
- Plaats gelabelde dekglazen met cellen in een bureau spuitmachine en tape omlaag. Zet puur goud in de sputtermachine. Zet de machine aan en begin met sputteren bij lage druk (50 mTorr). Coatcellen gedurende 30 s bij 80 mA, die vertaalt naar 20 nm goudcoating.
- Overdracht gecoate cellen naar de aftast elektronenmicroscoop.
4. Imaging C. difficile cellen op een scanning elektronenmicroscoop
- Haal de aftastelektronmicroscoop (SEM) goed uit door prDe ventilatieknop op de computersoftware.
- Bevestig de bekledde deklagen op de metalen trap met behulp van koolstofband. Zodra de SEM is afgevoerd, dient de deur gemakkelijk te openen. Sluit de metalen trap in de SEM-kamer door erin te schroeven.
- Klik op de POMP knop op de computer software. De SEM zal bruikbaar zijn als het systeem "Vac OK" leest.
- Klik op de SE-detector onder het detectors tabblad. Zet de balk aan door op de knop die de spanning geeft, te klikken. Start afbeelden bij een lagere spanning (5 kV) alvorens de spanning te verhogen (tot 15 kV). Een afbeelding verschijnt nadat de balk is ingeschakeld.
- Met behulp van de tracking functie, zoek een gebied op de bekledde coverlips naar de afbeelding. Zoom in de regio en vind staafvormige structuren; Dit zijn clostridium difficile .
- Zoom in en focus op de afbeelding om het systeem te kalibreren. Dit dient op meerdere werkafstanden te gebeuren: 15, 9 en 5 mm. Beeld op een werkafstand van 5 mm.
- Schakel de u aanLtra hoge resolutie beeldvormingsmodus en begin astigmatisme te concentreren en optimaliseren.
- Begin met hoge vergroting te concentreren. Gebruik hiervoor de grove en fijne focus. Pas het astigmatisme ook aan om een duidelijker beeld te krijgen.
- Verstel astigmatisme bij hoge vergroting. Om dit te doen, pas de astigmatismewissels aan (ze lijken op de fijne / grove focuswisseling) en controleer het beeld voor de duidelijkheid door digitaal in te zoomen op de computersoftware.
- Zie de slow scan functie om een hoge kwaliteit afbeelding te verzamelen. Sla de verzamelde afbeelding op als een .TIFF-bestand, dat gebruikt wordt voor analyse. Zorg dat de gegevensbalk geselecteerd is als er tijdens de analyse metingen worden gemeten.
- Verzamel beelden op verschillende hoeken (tot 52 ° door de hoek direct op de SEM te draaien. Hoekige beelden geven de nadere informatie meer informatie weer.
- Verander de bundelspanning afhankelijk van de cellen die worden afgebeeld. Houd dit meestal tussen 5 - 15 kV voor alle experimenten. Nadat de beeldvorming is voltooid, zet u de balk uit en verhoog de werkafstand tot 20 mm. De kamer kan dan worden afgezet en het podium kan worden verwijderd. Kopieer alle beelden op een drive voor verdere analyse.
5. Beeldverwerking en analyse
- Download en installeer de vrij beschikbare software, FIJI (http://fiji.sc), naar de computer.
- Open het beeldbestand in FIJI.
- Gebruik de lijnfunctie om de schaalbalk nauwkeurig op te sporen.
- Klik op het tabblad Analyse in het FIJI-programma en kies uiteindelijk de Select Scale-functie. Er verschijnt een venster dat de instelling van de bekende afstand vereist op basis van de schaalbalk. Verander ook de lengte-eenheid en klik op OK.
- Nu het programma voor afstand is gekalibreerd, gebruik dan de lijnfunctie om de cellengte te meten. Om de lengte te verkrijgen, gebruik de lijnfunctie om de cel in zijn geheel te traceren. Selecteer het tabblad Analyse opnieuw en klik vervolgens op Maat. De lengte moet ca.Oor in de eerder genoemde eenheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile is een sporenvormende bacterie en daarom is het essentieel om de morfologische verschillen tussen vegetatieve en sporencellen voorafgaand aan elke functionele analyse te bepalen. Figuur 1 toont representatieve afbeeldingen van vegetatieve cellen die werden opgenomen tijdens de exponentiële fase van de groeicurve en de sporencellen. Zoals afgebeeld, zijn vegetatieve cellen lange, gladde, staafvormige structuren, terwijl sporen kleine, ovale structuren zijn die een ruwe buitenkant hebben. Functioneel groeien en verdelen vegetatieve cellen snel en zijn verantwoordelijk voor de virulentie van C. difficile infecties door toxinen te scheiden, terwijl sporen normaal gesproken slapend zijn met weinig activiteit. Bijgevolg zijn antibiotica meestal actief tegen vegetatieve cellen, terwijl sporen meestal bestand zijn tegen medicijnen, door verschillende lagen die de kern beschermen tegen DNA en gebrek aan fysiologische activiteit. Vanwege deze feiten, de meerderheidVan de morfologische analyse is gericht op de vegetatieve cellen. 11 , 12
Een antibiotische dodenkromme is de standaardmethode om antibiotica doeltreffend te tonen tegen groeiende bacteriën. Concentraties gebruikt bij C. difficile stam R20291 waren gebaseerd op de MIC waarden, 1 μg / ml voor vancomycine en 0,51 μg / ml voor metronidazol. 10 Zoals getoond in Figuur 2 groeien de controle cellen en bereiken een plateau, terwijl de behandelde cellen afnemen in totale kolonievormende eenheden (CFU) tot de detectiegrens (LOD) die bactericide effect demonstreert. Zoals aangetoond zijn vancomycine ( Figuur 2A ) en metronidazool ( Figuur 2B ) effectief bij het doden van C. difficile bij supraMIC concentraties (4xMIC). Men kan merken dat de antibiotische dodenkrommen lijken, maar de medicijnen hebben verschillende mechanismen van ac(Vancomycine voorkomt celwandsynthese terwijl metronidazol de DNA-replicatie beïnvloedt). Daarom stellen wij voor dat antibiotica-dodencurves niet genoeg van discriminerende kracht hebben om gedetailleerde verschillen tussen deze antibiotica te geven. We hebben microscopie gebruikt om meer discriminatie te bieden.
Vanwege de microscopische grootte is C. difficile niet mogelijk zonder beeld te vergroten. Dit heeft een kans gegeven voor het gebruik van scanningelektronmicroscopie (SEM), een beeldvormingsmethode die resolutie op nanometerschaal kan verkrijgen, om de gedetailleerde effecten van antibiotische behandeling direct op de cellen te beoordelen. Om het nut van deze aanpak te demonstreren, werden cellen voor en na de behandeling van geneesmiddelen afgebeeld om te bepalen hoe de morfologie veranderde ( Figuur 3A ). Zoals aangetoond, werden sommige wanden van de cellen beïnvloed, zoals in het geval van vancomycine, en sommige van de cellen waren kleiner in grootte,Zoals het geval was voor metronidazol. Om te testen of de celgrootte werd beïnvloed, analyseerden we de cellengte met behulp van het programma FIJI. Vegetatieve celgrootte kan wat in de besturingsdoos variëren, maar de meeste zijn ongeveer 6 μm in lengte ( Figuur 3B ). Bij het overwegen van veel cellen uit de controle en de behandelde instellingen kan men snel opmerken dat de cellengte bij voorkeur in metronidazol is beïnvloed, maar wordt niet beïnvloed door de behandeling met vancomycine ( Figuur 3C ).
Figuur 1: Differentiatie tussen celtypes door middel van scanning van elektronenmicroscopie. Getoond zijn representatieve afbeeldingen van Clostridium difficile vegetatieve en spore cellen. Plantaardige cellen zijn staafstructuren die lang en flagellated zijn. In tegenstelling hiermee zijn sporencellen klein en hebben ze een ruwe en hobbelige jas. Sporen zijn pseudo-gekleurd rood voor beeld purpoAlleen maar. Schaalstaven worden op de afbeeldingen getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Antibiotische Time-Kill Curves. SupraMIC kill curves werden gedragen voor vier verschillende antibiotica: vancomycine (A) , metronidazool (B) . Deze antibiotica hadden significante dodende werking tegen C. difficile stam R20291 en benaderde de detectiegrens (LOD) voor het tellen van kolonievormende eenheden (CFU). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Onderzoek naar de farmacologische effecten van antibiotische behandeling. Beelden van behandelde en niet-behandelde cellen werden op meerdere tijdstippen door de killingstudies van de killing genomen (A) . Getoond is een representatief voorbeeld van een controle vegetatieve cel die voor lengte (B) werd gemeten. Behandelde en niet-behandelde cellen werden gemeten en vergeleken (C) . Experimenten werden uitgevoerd in ten minste tweevoud en> 17 cellen werden gemeten per groep. * P <0,05 vergeleken met controle- en vancomycinebehandelingsgroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van de huidige studie was het creëren van een high-throughput methode voor het isoleren van C. difficile en het testen van antibiotica gevoeligheid met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) als middel om een meer grondige karakterisering van de farmacologische werking van het antibiotica. Met behulp van de hierin beschreven protocollen hebben we aangetoond dat beeldvorming van de fenotypische reactie van de cel op antibiotische behandeling inzicht kan geven in de farmacologische werking van het geneesmiddel. In totaal duurt het afbeeldingsgedeelte van dit protocol ongeveer 2 uur na het verzamelen van de cellen, maar kan veel discriminatie zijn dan alleen typische dodelijke kinetische studies. Tijdens het leren van het gebruik van een SEM kan technisch veeleisend zijn, het voorbereiden van monsters is relatief eenvoudig en snel. Wij geloven dat deze protocollen die hier zijn beschreven, een objectieve aanpak geven om de farmacologische werking van antibiotische behandeling te evalueren.
Gezien de overeenkomsten tussen tZijn antibiotische dodenkrommen ( Figuur 2 ), trachten we te bepalen of er verschillen waren tussen de reactie van de cel op farmacologische behandeling. Met behulp van SEM hebben we vastgesteld dat metronidazol effecten heeft op de cellengte bij supraMIC concentraties van het geneesmiddel. Hoewel deze fenotypes niet eerder zijn gemeld, zijn ze in overeenstemming met de antibiotica-mechanismen van acties en suggereren een effect op celmetabolisme en groei. Daarentegen had vancomycine significante effecten op de celwand, die ook in overeenstemming is met het werkingsmechanisme. 13 Terwijl er overeenkomsten bestaan tussen de dodenkinetiek tussen deze antibiotica, blijkt uit de SEM-beelden dat er significante fenotypische verschillen zijn. Het creëren van een antibiotische fenotype bibliotheek zal een grondiger karakterisering van drugs mogelijk maken die mogelijk geen duidelijk actiemechanisme hebben, zoals in het geval van ridinilazol.
BecausE deze methode is technisch uitdagend; wijzigingen moeten mogelijk gemaakt worden om de wetenschappelijke vraag aan te pakken, inclusief consistente celbereiding en veranderingen in sputteren van gouden coating. Teveel bekledingen kunnen eventuele effecten op de buitenkant van de cellen vervagen, maar onvoldoende coating kan resulteren in het opladen van de balk en vervormen de beelden. Om dit te voorkomen, bereiden u monsters met verschillende hoeveelheden gouden coating om de sputtertijd te optimaliseren. Tenslotte zal consistente methodologie tussen studies inter-experimentele vergelijkingen mogelijk maken.
Een beperking van het gebruik van SEM is dat het beperkt is tot het zien van celmorfologische veranderingen; Daarom zijn functionele studies nodig om eventuele vermoedelijke respons te bevestigen. Daarom geloven wij dat dit beeldvormingsprotocol gebruikt kan worden om functionele studies te leiden. Ondanks deze beperking kan immunogold etikettering worden uitgevoerd met behulp van SEM om eventuele vermoedelijke veranderingen in eiwithandel of aggregatie te bevestigen;We hebben deze experimenten echter nog niet uitgevoerd.
Vanwege de actieve pijplijn van nieuwe antibiotica voor C. difficile behandeling is een grondiger evaluatie van de drugshandeling noodzakelijk. Zoals hier gepresenteerd, biedt SEM een unieke, hoge doorvoer en betrouwbare kans om farmacologische werking te karakteriseren. Door het imago van veel verschillende antibiotische effecten onder verschillende stammen van C. difficile kunnen we begrijpen waarom sommige antibiotica efficiënter zijn dan andere tegen specifieke pathogene stammen zoals de 027 / NAP1 / BI epidemische stam. 14 Bovendien kan SEM-analyse nuttig zijn om antibiotische effecten tussen ribotypen of stammen te onderscheiden en kan worden gebruikt om andere bacteriële soorten te bestuderen die zijn brede toepasselijkheid aantonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
