Abstract
A avaliação da ação antibiótica com o desenvolvimento de novos fármacos voltados para as bactérias anaeróbias é difícil e tecnicamente exigente. Para se ter uma ideia do possível MOA, as alterações morfológicas associadas à exposição aos antibióticos podem ser visualizadas utilizando microscopia electrónica de varrimento (SEM). Integrar a imagem de SEM com as curvas tradicionais de morte pode melhorar nossa visão sobre a ação da droga e avançar no processo de desenvolvimento da droga. Para testar esta premissa, as curvas de morte e os estudos de SEM foram conduzidos utilizando fármacos com MOA conhecidos mas diferentes (vancomicina e metronidazol). As células de C. difficile (R20291) foram cultivadas com ou sem a presença de antibiótico até 48 h. Ao longo do intervalo de 48 h, as células foram recolhidas em múltiplos pontos de tempo para determinar a eficácia de antibióticos e para imagens no SEM. De acordo com os relatórios anteriores, a vancomicina eo metronidazol apresentaram uma actividade bactericida significativa após 24 h de tratamento, tal como medido pela unidade de formação de colónias (UFC)Ting Usando a imagem SEM, determinou-se que o metronidazol teve efeitos significativos sobre o comprimento celular (> 50% de redução no comprimento celular para cada antibiótico, P <0,05) em comparação com os controles e vancomicina. Embora a resposta fenotípica ao tratamento com fármaco não tenha sido previamente documentada desta forma, são consistentes com o MOA do fármaco demonstrando a versatilidade e fiabilidade da imagem e medições e a aplicação desta técnica para outros compostos experimentais.
Introduction
Clostridium difficile é uma bactéria gram-positiva, formadora de esporos, causando cerca de 500.000 infecções anualmente nos EUA e é considerada um patógeno urgente de ameaça pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), o maior nível de risco. A década passada tem visto um desenvolvimento considerável de fármacos em antimicrobianos com atividade contra C. difficile . 2 , 3 Os estudos in vitro são um componente necessário do processo de desenvolvimento do fármaco. 4 Tradicionalmente, estudos de susceptibilidade in vitro e morte são usados para validar futuros estudos animais e outros in vivo .
Embora estes métodos desempenhem um papel importante na avaliação da acção de morte, não capturam a resposta fenotípica das células ao tratamento farmacológico. Ao incorporar microscopia eletrônica de varredura (MEV) comD matando estudos cinéticos, uma caracterização mais completa dos efeitos diretos do antibiótico é possível. 5 , 6 , 7 Aqui, apresentamos um método em que o SEM é utilizado como um meio para perfilar a eficácia do tratamento antibiótico.
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Protocol
1. Isolamento de C. difficile a partir de diferentes fontes ambientais ou clínicas
- Isolados ambientais: Utilizando um indicador de algodão pré-esterilizado (ligeiramente molhado com NaCl a 0,85%), limpe a superfície de qualquer área de interesse (chão, porta, pega, prateleira, etc. ). 8 Certifique-se de usar luvas estéreis e coloque o cotonete em um tubo esterilizado após concluído.
- Isolados clínicos (fezes): Placa de 10 a 100 mg de amostras clínicas de fezes em cefoxitina-cicloserina-frutose ágar (CCFA), utilizando um ciclo de inoculação e incubar sob condições anaeróbicas rigorosas durante 48-72 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais. 7 , 9 , 10
- Enriqueça as amostras de esfregaços ambientais em infusão de coração cerebral (BHI) com 0,05% de taurocolato de sódio e coloque em câmara anaeróbica a 37 ° CDurante 5 dias. Centrifugar 1 mL da cultura a 10.000 xg e ressuspender o sedimento em 100 mL de etanol.
- Plantar as células ressuspensas (50 μL) em placas de cicloserinecefoxitina frutose agar (CCFA) e incubar numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Armazenar colônias isoladas de C. difficile estoque em cryovials a -80 ° C para análises adicionais.
- Teste as colônias suspeitas de C. difficile usando o reagente de aglutinação de látex ou PCR.
2. Culturing C. difficile e Killing Kinetic Procedures
- Cultivar estirpes ambientais ou clínicas de C. difficile em placas de agar de sangue numa câmara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h.
- Tomar uma colónia isolada com um ciclo de inoculação, transferi-la para 5 mL de meio BHI num tubo de 15 mL e crescer durante 24 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C.
- Diluir as pré-culturas 1: 100 a aproximadamente 10 6 unidades formadoras de colónias(CFU) / mL em BHIS pré-reduzido fresco (BHI mais 5 g / L de extracto de levedura e 1% de L-cisteína) suplementado com taurocolato de sódio a 0,1% e a concentração apropriada de antibiótico (T0).
- Recolher uma amostra de 1 mL com uma pipeta em cada ponto de tempo (T0, T6, T24, T48) e espalhar uma pequena alíquota (100 μL em diluições em série) numa placa de agar de sangue. Deixar as células crescerem sobre a placa de agar de sangue durante 48 h numa câmara anaeróbica a 37 ° C e contar o número resultante de colónias para determinar CFU.
3. Preparação de amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura
- Recolher 1 mL de células de cada ponto de tempo em tubos de microcentrífuga e centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e lavar as células em PBS.
- Centrifugar as amostras a 10 000 xg durante 10 min novamente e descartar o sobrenadante. Re-diluir as células em 1 mL de paraformaldeído a 4% e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
- Centrifugar novamente as amostras durante 10 min a 10,000 xg e descartar sobrenadante. Lavar as células duas vezes com água destilada e redilutar em 100 μL de água destilada. Ajuste o volume dependendo da turbidez da solução.
NOTA: Fazer várias diluições em série é uma boa idéia. - Rotule os lamínulas e adicione 40 μL da amostra nele. Incubar durante 15 min em uma capa de fluxo para evaporar o líquido e permitir que as células aderem à lamela. Se ainda houver líquido, use um ventilador para remover o líquido.
- Coloque lamínulas rotuladas com células em uma máquina de pulverização de mesa e fita para baixo. Secure ouro puro na máquina de pulverização. Ligue a máquina e comece a pulverização a baixa pressão (50 mTorr). Revestir as células durante 30 s a 80 mA, o que se traduz em 20 nm de revestimento de ouro.
- Transferência de células revestidas para o microscópio eletrônico de varredura.
4. Imagens de células C. difficile em um microscópio eletrônico de varredura
- Ventilar o microscópio eletrônico de varredura (SEM) corretamente por prEssing o botão de ventilação no software do computador.
- Usando fita de carbono, fixe os lamínulas revestidas para o estágio de metal. Uma vez que o SEM é ventilado, a porta deve abrir facilmente. Bloqueie o estágio de metal na câmara de SEM, aparafusando-o.
- Clique no botão PUMP no software do computador. O SEM será utilizável quando o sistema lê "Vac OK".
- Clique no detector SE na guia de detectores. Ligue o feixe clicando no botão que exibe a tensão. Iniciar imagens com uma tensão mais baixa (5 kV) antes de aumentar a tensão (até 15 kV). Uma imagem será exibida após o feixe estar ligado.
- Usando a função de rastreamento, encontre uma área nos lamínulas revestidos para a imagem. Zoom para a região e encontrar em forma de haste estruturas; Estes são clostridium difficile .
- Amplie e focalize a imagem para calibrar o sistema. Isto deve ser feito em várias distâncias de trabalho: 15, 9 e 5 mm. Imagem a uma distância de trabalho de 5 mm.
- Ligue o uLtra modo de imagem de alta resolução e começar a focar e otimizar o astigmatismo.
- Comece a focar em alta ampliação. Utilize os botões de foco fino e grosseiro para isso. Ajustar o astigmatismo também para obter uma imagem mais clara.
- Ajuste o astigmatismo com alta ampliação. Para fazer isso, ajuste as alternâncias de astigmatismo (elas se parecem com as alternâncias de foco fino / grosseiro) e verifique a imagem para obter clareza digitando zoom no software do computador.
- A função de leitura lenta para coletar uma imagem de alta qualidade. Salve a imagem coletada como um arquivo .TIFF, que será usado para análise. Certifique-se de que a barra de dados esteja selecionada se as medições forem feitas durante a análise.
- Colecione imagens em diferentes ângulos (até 52 °, girando manualmente o ângulo diretamente no SEM.) As imagens angulares tendem a revelar mais informações de profundidade.
- Altere a tensão do feixe dependendo das células que estão sendo visualizadas. Manter este principalmente entre 5 - 15 kV para todas as experiências. Após completar a imagem, desligue o feixe e aumente a distância de trabalho para 20 mm. A câmara pode então ser ventilada e a fase pode ser removida. Copie todas as imagens em uma unidade para uma análise mais aprofundada.
5. Processamento e Análise de Imagens
- Faça o download e instale o software disponível gratuitamente, FIJI (http://fiji.sc), no computador.
- Abra o arquivo de imagem em FIJI.
- Usando a função de linha, traçar com precisão a barra de escala.
- Clique na guia Analisar no programa FIJI e finalmente selecione a função Selecionar Escala. Aparecerá uma janela que exigirá a definição da distância conhecida com base na barra de escala. Altere também a unidade de comprimento e clique em OK.
- Agora que o programa é calibrado para a distância, use a função de linha para medir o comprimento da célula. Para obter o comprimento, use a função de linha para rastrear a célula na sua totalidade. Selecione a guia Analisar novamente e clique em Medir. O comprimento deve serNas unidades indicadas anteriormente.
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Representative Results
Clostridium difficile é uma bactéria formadora de esporos e, portanto, é essencial para determinar as diferenças morfológicas entre células vegetativas e esporos antes de qualquer análise funcional. A Figura 1 demonstra imagens representativas de células vegetativas que foram capturadas durante a fase exponencial da curva de crescimento e células de esporos. Conforme ilustrado, as células vegetativas são longas, lisas, em forma de haste estruturas enquanto esporos são pequenos, estruturas ovais que têm um exterior áspero. Funcionalmente, as células vegetativas crescem e dividem-se rapidamente e são responsáveis pela virulência das infecções por C. difficile, por secreção de toxinas, enquanto os esporos normalmente dormem com pouca actividade. Assim, os antibióticos são principalmente activos contra células vegetativas, enquanto os esporos são geralmente resistentes ao tratamento com fármacos, devido a várias camadas de protecção do núcleo com o ADN, e falta de actividade fisiológica. Devido a esses fatos, a maioriaDa análise morfológica está focada nas células vegetativas. 11 , 12
Uma curva de morte com antibióticos é a metodologia padrão para demonstrar a eficácia antibiótica contra bactérias em crescimento. As concentrações utilizadas com a estirpe R20291 de C. difficile foram baseadas nos valores de CIMs, 1 μg / mL para vancomicina e 0,51 μg / mL para metronidazol. Tal como ilustrado na Figura 2 , as células de controlo crescem e atingem um patamar, enquanto que as células tratadas diminuem em unidades formadoras de colónias totais (CFU) até ao limite de detecção (LOD) demonstrando efeito bactericida. Conforme demonstrado, vancomicina ( Figura 2A ) e metronidazole ( Figura 2B ) são eficazes na morte de C. difficile nas concentrações supraMIC (4xMIC). Pode-se notar que as curvas de morte de antibióticos parecem semelhantes, mas as drogas têm diferentes mecanismos de ac(A vancomicina impede a síntese da parede celular enquanto o metronidazol afeta a replicação do DNA). Portanto, propomos que as curvas de morte de antibióticos podem não ter suficiente poder discriminatório para fornecer diferenças detalhadas entre esses antibióticos. Usamos a microscopia para fornecer mais discriminação.
Devido ao seu tamanho microscópico, C. difficile não é possível a imagem sem grande ampliação. Isto proporcionou uma oportunidade para o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM), um método de imagem que pode obter resolução na escala nanométrica, para avaliar os efeitos detalhados do tratamento antibiótico diretamente sobre as células. Para demonstrar a utilidade desta abordagem, as células foram visualizadas antes e após o tratamento com fármaco para determinar como a morfologia mudou ( Figura 3A ). Como demonstrado, algumas das paredes das células foram afectadas, como no caso da vancomicina, e algumas das células eram de tamanho menor,Como foi o caso do metronidazol. Para testar se o tamanho celular foi afetado, analisamos o comprimento celular utilizando o programa FIJI. O tamanho da célula vegetativa pode variar alguns no caso de controlo, mas a maioria tem aproximadamente 6 um de comprimento ( Figura 3B ). Quando se consideram muitas células do controlo e das configurações tratadas, pode-se notar rapidamente que o comprimento da célula é preferencialmente afectado no metronidazol mas não é afectado pelo tratamento com vancomicina ( Figura 3C ).
Figura 1: Diferenciação entre Tipos de Células por Microscopia Eletrônica de Varredura. São mostradas imagens representativas de células vegetativas e de esporos de Clostridium difficile . As células vegetativas são estruturas de haste que são longas e flageladas. Em contraste, as células de esporos são pequenas e têm uma camada áspera e irregular. Os esporos são pseudo-coloridos vermelhos para a imagem purpoApenas. As barras de escala são mostradas nas imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas Antibiótico Tempo-Matar. As curvas de morte SupraMIC foram realizadas para quatro antibióticos diferentes: vancomicina (A) , metronidazol (B) . Estes antibióticos tinham acção de morte significativa contra a estirpe de C. difficile R20291 e aproximaram-se do limite de detecção (LOD) para contagem de unidades formadoras de colónias (CFU). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Examinando os Efeitos Farmacológicos do Tratamento Antibiótico. As imagens de células tratadas e não tratadas foram tomadas em múltiplos pontos de tempo ao longo dos estudos cinéticos de morte (A) . Mostrado é um exemplo representativo de uma célula vegetativa de controlo que foi medida para comprimento (B) . As células tratadas e não tratadas foram medidas e comparadas (C) . As experiências foram realizadas em pelo menos duplicado e foram medidas 17 células por grupo. * P <0,05 em comparação com os grupos de tratamento com vancomicina e controlo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo do presente estudo foi criar um método de alto rendimento para isolar C. difficile e testar a susceptibilidade aos antibióticos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) como meio para uma caracterização mais completa da ação farmacológica do antibiótico. Usando os protocolos aqui delineados, demonstrámos que imaginar a resposta fenotípica da célula ao tratamento com antibióticos pode revelar uma visão da acção farmacológica do fármaco. No total, a porção de imagem deste protocolo leva aproximadamente 2 h de duração após a coleta das células, mas pode ser muito mais discriminatória do que os estudos cinéticos típicos de morte sozinho. Enquanto aprender a usar um SEM pode ser tecnicamente exigente, a preparação de amostras é relativamente simples e rápido. Acreditamos que estes protocolos aqui delineados fornecerão uma abordagem objetiva para avaliar a ação farmacológica do tratamento com antibióticos.
Considerando as semelhanças entre t( Figura 2 ), procurou-se determinar se havia diferenças entre a resposta da célula ao tratamento farmacológico. Utilizando SEM, verificou-se que o metronidazol teve efeitos sobre o comprimento celular nas concentrações supraMIC do fármaco. Embora esses fenótipos não tenham sido relatados anteriormente, eles são consistentes com os mecanismos de ação dos antibióticos e sugerem um efeito no metabolismo e crescimento celular. Em contraste, a vancomicina teve efeitos significativos na parede celular, o que também é consistente com o seu mecanismo de acção. Embora existam semelhanças entre a cinética de morte entre estes antibióticos, é evidente a partir das imagens de SEM que existem diferenças fenotípicas significativas. A criação de uma biblioteca de fenótipos antibióticos permitirá uma caracterização mais completa de fármacos que podem não ter um mecanismo claro de acção identificado, como é o caso do ridinilazol.
BecausE este método é tecnicamente desafiador, podem ser necessárias modificações para abordar a questão científica, incluindo a preparação de células consistentes e as alterações na pulverização catódica do revestimento de ouro. Demasiado revestimento pode desfocar qualquer efeito para o exterior das células, mas não o suficiente revestimento pode resultar em carga do feixe e distorcer as imagens. Para evitar isso, prepare amostras com diferentes quantidades de revestimento de ouro para otimizar o tempo de pulverização. Por fim, uma metodologia consistente entre os estudos permitirá comparações inter-experimentais.
Uma limitação da utilização de SEM é que se restringe à observação de alterações de morfologia celular; Portanto, estudos funcionais são necessários para confirmar qualquer suspeita de resposta. Devido a isso, acreditamos que este protocolo de imagem pode ser usado como um meio de direcionar estudos funcionais. Apesar desta limitação, a marcação imunológica pode ser feita utilizando SEM para confirmar quaisquer alterações suspeitas no tráfico ou agregação de proteínas;Contudo, ainda não realizamos essas experiências.
Devido ao encanamento activo de novos antibióticos para o tratamento de C. difficile, é necessária uma avaliação mais completa da acção do fármaco. Conforme apresentado aqui, SEM oferece uma oportunidade única, de alto rendimento e confiável para caracterizar a ação farmacológica. Ao imaginar muitos efeitos antibióticos diferentes entre diferentes estirpes de C. difficile , seremos capazes de entender por que alguns antibióticos são mais eficazes do que outros contra estirpes patogênicas específicas como a cepa 027 / NAP1 / BI. 14 Além disso, a análise SEM pode ser útil para discriminar os efeitos de antibióticos entre ribotipos ou estirpes e pode ser usada para estudar outras espécies bacterianas demonstrando sua ampla aplicabilidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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