Abstract
La evaluación de la acción antibiótica con el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos hacia las bacterias anaerobias es difícil y técnicamente exigente. Para obtener información sobre el posible MOA, los cambios morfológicos asociados con la exposición a los antibióticos se pueden visualizar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La integración de la imagen de SEM con las curvas de muerte tradicionales puede mejorar nuestra comprensión de la acción de la droga y avanzar en el proceso de desarrollo de fármacos. Para probar esta premisa, las curvas de muerte y los estudios de SEM se llevaron a cabo utilizando fármacos con MOA conocido pero diferente (vancomicina y metronidazol). Las células de C. difficile (R20291) se cultivaron con o sin la presencia de antibiótico hasta 48 h. Durante todo el intervalo de 48 h, las células se recogieron en múltiples puntos de tiempo para determinar la eficacia de los antibióticos y de imágenes en el SEM. De acuerdo con los informes anteriores, vancomicina y metronidazol tuvo una actividad bactericida significativa después de 24 h de tratamiento, medida por la unidad formadora de colonias (UFC)Ting Usando la imagen de SEM se determinó que el metronidazol tuvo efectos significativos sobre la longitud celular (> 50% de reducción en la longitud de la célula para cada antibiótico, P <0,05) en comparación con los controles y la vancomicina. Aunque la respuesta fenotípica al tratamiento farmacológico no se ha documentado previamente de esta manera, son consistentes con el MOA del fármaco demostrando la versatilidad y fiabilidad de la formación de imágenes y las mediciones y la aplicación de esta técnica para otros compuestos experimentales.
Introduction
Clostridium difficile es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas, causando aproximadamente 500,000 infecciones anualmente en los Estados Unidos y considerada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) como el nivel más alto de riesgo. 1 En la última década se ha observado un considerable desarrollo de fármacos en antimicrobianos con actividad contra C. difficile . 2 , 3 Los estudios in vitro son un componente necesario del proceso de desarrollo del fármaco. Tradicionalmente, se usan estudios de susceptibilidad in vitro y matanza para validar futuros estudios en animales y otros in vivo .
Aunque estos métodos cumplen un papel importante para evaluar la acción de matar, no capturan la respuesta fenotípica de las células al tratamiento farmacológico. Mediante la incorporación de microscopía electrónica de barrido (SEM) conD matando los estudios cinéticos, una caracterización más completa de los efectos directos antibióticos es posible. 5 , 6 , 7 Aquí, se presenta un método en el que SEM se utiliza como un medio para perfilar la eficacia del tratamiento con antibióticos.
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Protocol
1. Aislar C. difficile de diferentes fuentes ambientales o clínicas
- Aislados medioambientales: Utilizando un calibre de algodón preesterilizado (ligeramente humedecido con NaCl al 0,85%), limpie con un hisopo la superficie de cualquier área de interés (piso, puerta, manija, estante, etc. ). 8 Asegúrese de usar guantes estériles y coloque el hisopo en un tubo esterilizado una vez completado.
- Aislamientos clínicos (heces): Placa de 10 a 100 mg de muestras clínicas de heces en agar de cefoxitina-cicloserina-fructosa (CCFA) utilizando un bucle de inoculación e incubar bajo condiciones anaeróbicas estrictas durante 48 - 72 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales. 7 , 9 , 10
- Enriquecer las muestras de hisopo ambiental en infusión de corazón cerebral (BHI) caldo con taurocolato de sodio al 0,05% y colocar en una cámara anaeróbica a 37 ° Cdurante 5 días. Centrifugar 1 ml del cultivo a 10.000 xg y resuspender el sedimento en 100 μl de etanol.
- Se colocan las células resuspendidas (50 μl) en placas de agar de fructosa de cicloserinecefoxitina (CCFA) e incuban en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 40-48 h. Almacenar colonias aisladas de C. difficile stock en cryovials a -80 ° C para análisis adicionales.
- Pruebe las colonias sospechosas de C. difficile utilizando el reactivo de aglutinación de látex o PCR.
2. Cultivo de C. difficile y Killing Cinética Procedimientos
- Cultivar cepas de C. difficile contaminadas con el medio ambiente o clínicas en placas de agar sangre en una cámara anaeróbica a 37 ° C durante 48 h.
- Tomar una colonia aislada con un bucle de inoculación, transferirla a 5 mL de medio BHI en un tubo de 15 mL, y crecer durante 24 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C.
- Diluir el precultivo de 1: 100 a aproximadamente 10 6 unidades de formación de colonias(CFU) / ml en BHIS pre-reducido fresco (BHI más 5 g / l de extracto de levadura y 1% de L-cisteína) suplementado con taurocolato de sodio al 0,1% y la concentración apropiada de antibiótico (T0).
- Recoger una muestra de 1 mL con una pipeta en cada punto de tiempo (T0, T6, T24, T48) y extender una pequeña alícuota (100 μl en diluciones en serie) sobre una placa de agar sangre. Deje que las células crezcan en la placa de agar sangre durante 48 h en una cámara anaeróbica a 37 ° C y cuente el número resultante de colonias para determinar CFU.
3. Preparación de muestras para la microscopía electrónica de barrido
- Recoger 1 mL de células de cada punto de tiempo en tubos de microcentrífuga y centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Desechar el sobrenadante y lavar las células en PBS.
- Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 minutos y descartar el sobrenadante. Reducir las células en 1 mL de paraformaldehído al 4% e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Centrifugar nuevamente las muestras durante 10 min a 10,000 xg y desechar el sobrenadante. Lavar las células dos veces con agua destilada y rediluir en 100 μl de agua destilada. Ajuste el volumen dependiendo de la turbidez de la solución.
NOTA: Hacer múltiples diluciones en serie es una buena idea. - Marque los cubreobjetos y añada 40 μl de la muestra. Incubar durante 15 minutos en una campana de flujo para evaporar el líquido y permitir que las células se adhieran a la cubreobjetos. Si todavía hay líquido, use un soplador para quitar el líquido.
- Coloque los cubreobjetos marcados con las células en una máquina de pulverización de escritorio y cinta hacia abajo. Asegure el oro puro en la máquina de pulverización. Encienda la máquina y comience a pulverizar a baja presión (50 mTorr). Recubrir las células durante 30 s a 80 mA, lo que se traduce en 20 nm de recubrimiento de oro.
- Transferencia de células revestidas al microscopio electrónico de barrido.
4. Imagen de células C. difficile en un microscopio electrónico de barrido
- Ventilar el microscopio electrónico de barrido (SEM) correctamente por prEl botón de ventilación en el software de la computadora.
- Usando cinta de carbón, asegure los cubreobjetos recubiertos sobre la platina metálica. Una vez que el SEM se ventila, la puerta debe abrirse fácilmente. Bloquee la etapa de metal en la cámara de SEM atornillándola.
- Haga clic en el botón BOMBA en el software del ordenador. El SEM será utilizable cuando el sistema lea "Vac OK".
- Haga clic en el detector de SE bajo la pestaña de detectores. Encienda la viga haciendo clic en el botón que muestra el voltaje. Comience la imagen a una tensión inferior (5 kV) antes de aumentar la tensión (hasta 15 kV). Una imagen aparecerá después de encender el haz.
- Usando la función de rastreo, encuentre un área en los cubreobjetos recubiertos a la imagen. Zoom en la región y encontrar en forma de barras estructuras; Estos son clostridium difficile .
- Acercar y enfocar la imagen para calibrar el sistema. Esto debe hacerse a múltiples distancias de trabajo: 15, 9 y 5 mm. Imagen a una distancia de trabajo de 5 mm.
- Encienda el uLtra modo de imagen de alta resolución y comenzar a enfocar y optimizar el astigmatismo.
- Comience a enfocar con una ampliación alta. Utilice los botones de enfoque grueso y fino para esto. Ajuste el astigmatismo también para obtener una imagen más clara.
- Ajustar el astigmatismo con gran aumento. Para ello, ajuste las teclas de astigmatismo (parecen similares a las de enfoque fino / grueso) y compruebe la claridad de la imagen haciendo zoom digitalmente en el software del ordenador.
- La función de escaneado lento para recoger una imagen de alta calidad. Guarde la imagen recogida como un archivo .TIFF, que se utilizará para el análisis. Asegúrese de que la barra de datos esté seleccionada si se realizarán mediciones durante el análisis.
- Recoja las imágenes en ángulos diferentes (hasta 52 ° girando manualmente el ángulo directamente sobre el SEM.) Las imágenes angulares tienden a revelar más información de profundidad.
- Cambie el voltaje del haz dependiendo de las celdas que se están formando imágenes. Mantenga esto principalmente entre 5 - 15 kV para todos los experimentos. Una vez completada la imagen, apague el haz y eleve la distancia de trabajo hasta 20 mm. La cámara puede ser ventilada y la etapa puede ser removida. Copie todas las imágenes en una unidad para un análisis posterior.
5. Procesamiento y análisis de imágenes
- Descargue e instale el software libremente disponible, FIJI (http://fiji.sc), en la computadora.
- Abra el archivo de imagen en FIJI.
- Utilizando la función de línea, trace con precisión la barra de escala.
- Haga clic en la pestaña Analizar en el programa FIJI y finalmente seleccione la función Seleccionar Escala. Aparecerá una ventana que requerirá el ajuste de la distancia conocida basada en la barra de escala. Cambie también la unidad de longitud y haga clic en Aceptar.
- Ahora que el programa está calibrado para la distancia, utilice la función de línea para medir la longitud de la celda. Para obtener la longitud, utilice la función de línea para rastrear la célula en su totalidad. Seleccione de nuevo la pestaña Analizar y, a continuación, haga clic en Medir. La longitud debe aplicarOído en las unidades indicadas anteriormente.
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Representative Results
Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas y por lo tanto es esencial para determinar las diferencias morfológicas entre las células vegetativas y esporas antes de cualquier análisis funcional. La Figura 1 muestra imágenes representativas de células vegetativas que fueron capturadas durante la fase exponencial de la curva de crecimiento y las células de esporas. Como se muestra, las células vegetativas son largas, lisas, estructuras en forma de varilla, mientras que las esporas son estructuras pequeñas y ovales que tienen un exterior áspero. Funcionalmente, las células vegetativas crecen y se dividen rápidamente y son responsables de la virulencia de las infecciones de C. difficile secretando toxinas, mientras que las esporas son normalmente latentes con poca actividad. Por lo tanto, los antibióticos son principalmente activos contra las células vegetativas, mientras que las esporas son generalmente resistentes al tratamiento farmacológico, debido a varias capas que protegen el núcleo con el ADN, y la falta de actividad fisiológica. Debido a estos hechos, la mayoríaDel análisis morfológico se centra en las células vegetativas. 11 , 12
Una curva antibiótica de muerte es la metodología estándar para demostrar la eficacia antibiótica contra las bacterias en crecimiento. Las concentraciones utilizadas con la cepa R20291 de C. difficile se basaron en los valores de CMI, 1 μg / mL para vancomicina y 0,51 μg / mL para metronidazol. 10 Como se muestra en la Figura 2 , las células de control crecen y alcanzan una meseta, mientras que las células tratadas disminuyen en unidades formadoras de colonias totales (CFU) hasta el límite de detección (LOD) que demuestran efecto bactericida. Como se demostró, vancomicina ( Figura 2A ) y metronidazol ( Figura 2B ) son eficaces para matar C. difficile a concentraciones supraMIC (4xMIC). Se puede notar que las curvas de muerte de antibióticos parecen similares, sin embargo los fármacos tienen diferentes mecanismos de ac(La vancomicina previene la síntesis de la pared celular mientras que el metronidazol afecta la replicación del ADN). Por lo tanto, proponemos que las curvas de muerte de antibióticos pueden no tener suficiente de un poder discriminatorio para proporcionar diferencias detalladas entre estos antibióticos. Utilizamos la microscopía para proporcionar más discriminación.
Debido a su tamaño microscópico, C. difficile no es posible de imagen sin gran aumento. Esto ha proporcionado una oportunidad para el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM), un método de imagen que puede obtener resolución a escala nanométrica, para evaluar los efectos detallados del tratamiento con antibióticos directamente sobre las células. Para demostrar la utilidad de este enfoque, las células fueron visualizadas antes y después del tratamiento con fármacos para determinar cómo cambió la morfología ( Figura 3A ). Como se demostró, algunas de las paredes de las células se vieron afectadas, como en el caso de la vancomicina, y algunas de las células eran de menor tamaño,Como fue el caso del metronidazol. Para comprobar si el tamaño de la célula estaba afectada, se analizó la longitud de las células utilizando el programa FIJI. Tamaño de la célula vegetativa puede variar algunos en el caso de control, pero la mayoría son de aproximadamente 6 μ m de longitud ( Figura 3B ]. Cuando se consideran muchas células de los parámetros de control y tratados, se puede observar rápidamente que la longitud de la célula se afecta preferentemente en metronidazol, pero no se ve afectada por el tratamiento con vancomicina ( Figura 3C ).
Figura 1: Diferenciación entre tipos de células mediante microscopía electrónica de barrido. Se muestran imágenes representativas de las células vegetativas y de esporas de Clostridium difficile . Las células vegetativas son estructuras de vástago que son largas y flageladas. Por el contrario, las células de esporas son pequeñas y tienen una capa rugosa y desigual. Las esporas son de color rojo pseudo para la imagen purpoSolamente. Las barras de escala se muestran en las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curvas Antibióticas de Tiempo y Matanza. SupraMIC curvas de matanza se llevaron a cuatro antibióticos diferentes: vancomicina (A) , metronidazol (B) . Estos antibióticos tuvieron una acción de muerte significativa contra la cepa de C. difficile R20291 y se aproximaron al límite de detección (LOD) para contar unidades formadoras de colonias (CFU). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Examen de los efectos farmacológicos del tratamiento antibiótico. Se tomaron imágenes de células tratadas y no tratadas en múltiples puntos de tiempo a lo largo de los estudios cinéticos de muerte (A) . Se muestra un ejemplo representativo de una célula vegetativa de control que se midió para la longitud (B) . Las células tratadas y no tratadas se midieron y compararon (C) . Se realizaron experimentos en al menos duplicado y se midieron 17 células por grupo. * P <0,05 en comparación con los grupos de tratamiento con vancomicina y control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo del presente estudio fue crear un método de alto rendimiento para aislar C. difficile y probar la susceptibilidad a los antibióticos mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como medio para una caracterización más completa de la acción farmacológica del antibiótico. Usando los protocolos esbozados aquí, hemos demostrado que la obtención de imágenes de la respuesta fenotípica de la célula al tratamiento con antibióticos puede revelar una visión de la acción farmacológica del fármaco. En total, la porción de imagen de este protocolo tarda aproximadamente 2 horas de duración después de recoger las células, pero puede ser mucho más discriminatorio que los típicos estudios de cinética de muerte solo. Mientras que aprender a utilizar un SEM puede ser técnicamente exigente, la preparación de muestras es relativamente simple y rápida. Creemos que estos protocolos esbozados aquí proporcionarán un enfoque objetivo para evaluar la acción farmacológica del tratamiento antibiótico.
Teniendo en cuenta las similitudes entre t( Figura 2 ), se buscó determinar si existían diferencias entre la respuesta de la célula al tratamiento farmacológico. Usando SEM, hemos determinado que el metronidazol tuvo efectos sobre la longitud celular a las concentraciones supraMIC del fármaco. Aunque estos fenotipos no han sido reportados previamente, son consistentes con los mecanismos de acción de los antibióticos y sugieren un efecto sobre el metabolismo celular y el crecimiento. En contraste, la vancomicina tuvo efectos significativos en la pared celular, lo que también es consistente con su mecanismo de acción. Aunque existen similitudes entre la cinética de muerte entre estos antibióticos, es evidente a partir de las imágenes de SEM que hay diferencias fenotípicas significativas. La creación de una biblioteca de fenotipos antibióticos permitirá una caracterización más completa de fármacos que pueden no tener un claro mecanismo de acción identificado, como es el caso del ridinilazol.
BecausSi este método es técnicamente difícil, es posible que haya que hacer modificaciones para abordar la cuestión científica, incluida la preparación de células consistentes y las alteraciones en la pulverización catódica del revestimiento de oro. Demasiado revestimiento puede desdibujar cualquier efecto en el exterior de las células, pero no el revestimiento suficiente puede dar lugar a la carga del haz y distorsionar las imágenes. Para evitar esto, prepare muestras con diferentes cantidades de recubrimiento de oro para optimizar el tiempo de pulverización. Por último, una metodología consistente entre los estudios permitirá realizar comparaciones interexperimentales.
Una limitación de la utilización de SEM es que se limita a observar los cambios de morfología celular; Por lo tanto, estudios funcionales son necesarios para confirmar cualquier respuesta sospechosa. Debido a esto, creemos que este protocolo de imagen puede ser utilizado como un medio para dirigir estudios funcionales. A pesar de esta limitación, el etiquetado inmunológico puede hacerse usando SEM para confirmar cualquier sospecha de cambios en el tráfico o agregación de proteínas;Sin embargo, todavía no hemos realizado estos experimentos.
Debido a la tubería activa de nuevos antibióticos para el tratamiento de C. difficile, una evaluación más completa de la acción del fármaco es necesaria. Como se presenta aquí, SEM ofrece una oportunidad única, de alto rendimiento y confiable para caracterizar la acción farmacológica. Mediante la obtención de imágenes de diferentes efectos antibióticos entre diferentes cepas de C. difficile , podremos entender por qué algunos antibióticos son más eficaces que otros contra cepas patógenas específicas como la cepa epidémica 027 / NAP1 / BI. 14 Además, el análisis SEM puede ser útil para discriminar los efectos de los antibióticos entre los ribotipos o cepas y podría utilizarse para estudiar otras especies bacterianas demostrando su amplia aplicabilidad.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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