Abstract
La valutazione dell'azione antibiotica con il nuovo sviluppo di farmaci verso batteri anaerobici è difficile e tecnicamente esigente. Per ottenere una visione di possibili MOA, i cambiamenti morfologici associati all'esposizione agli antibiotici possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). L'integrazione dell'immagine SEM con le curve di uccisione tradizionali può migliorare la nostra comprensione nell'azione dei farmaci e promuovere il processo di sviluppo del farmaco. Per testare questa premessa, le curve di uccisione e gli studi SEM sono stati condotti utilizzando farmaci con noti ma diversi MOA (vancomicina e metronidazolo). Le cellule C. difficile (R20291) sono state coltivate con o senza la presenza di antibiotico fino a 48 ore. Durante l'intervallo di 48 ore, le cellule sono state raccolte in più punti temporali per determinare l'efficacia antibiotica e per l'imaging sul SEM. In linea con le precedenti relazioni, la vankomicina e il metronidazolo avevano un'attività battericida significativa dopo 24 h di trattamento misurata con unità di colonia-formatore (CFU)ting. Utilizzando l'imaging SEM abbiamo determinato che metronidazolo avesse effetti significativi sulla lunghezza delle cellule (> 50% di riduzione della lunghezza cellulare per ogni antibiotico, P <0,05) rispetto ai controlli e alla vankomicina. Mentre la risposta fenotipica al trattamento farmacologico non è stata documentata in precedenza in questo modo, essi sono coerenti con la MOA del farmaco che dimostra la versatilità e l'affidabilità dell'immagine e delle misurazioni e l'applicazione di questa tecnica per altri composti sperimentali.
Introduction
Clostridium difficile è un batterio gram-positivo, che forma spore, causando circa 500.000 infezioni annuali negli Stati Uniti e viene considerato un livello di rischio pericoloso da parte dei centri per la prevenzione e la prevenzione delle malattie (CDC), il livello più elevato di rischio. La decade passata ha visto notevoli sviluppi di farmaci in antimicrobici con attività contro C. difficile . 2 , 3 Studi in vitro sono una componente necessaria del processo di sviluppo del farmaco. 4 Tradizionalmente, in vitro suscettibilità e studi sul tempo sono stati utilizzati per convalidare futuri studi sugli animali e altri in vivo .
Mentre questi metodi servono un ruolo importante per valutare l'azione di uccisione, non catturano la risposta fenotipica delle cellule al trattamento farmacologico. Incorporando la scansione microscopia elettronica (SEM) con standardGli studi cinetici di uccisione, è possibile una caratterizzazione più approfondita degli effetti diretti antibiotici. 5 , 6 , 7 Ecco qui un metodo in cui SEM viene utilizzato come un mezzo per profilare l'efficacia del trattamento antibiotico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolamento di C. difficile da diverse fonti ambientali o cliniche
- Isolati ambientali: Utilizzando un calibro di cotone pre-sterilizzato (leggermente bagnato con 0,85% NaCl), tamponare la superficie di qualsiasi area di interesse (pavimento, porta, maniglia, mensola, ecc. ). 8 Assicurati di indossare guanti sterili e posizionare il tampone in un tubo sterilizzato dopo il completamento.
- Isolati clinici (sgabello): Piastra da 10 a 100 mg di campioni clinici di sgabello su cefoxitin-cicloserina-fruttosio agar (CCFA) utilizzando un ciclo di inoculazione e incubare in condizioni anaerobiche rigorose per 48-72 h. Conservare le colonie isolate di C. difficile in crisiali a -80 ° C per ulteriori analisi. 7 , 9 , 10
- Arricchire i campioni di tampone ambientale nel brodo di infusione del cuore del cervello (BHI) con il taurocholato di sodio allo 0,05% e collocare in una camera anaerobica a 37 ° CPer 5 giorni. Centrifugare 1 ml della coltura a 10.000 xg e risospendere il pellet in 100 μL di etanolo.
- Piattare le cellule risospese (50 μL) sulle piastre di cicloserinecefossiin fruttosio agar (CCFA) e incubare in una camera anaerobica a 37 ° C per 40-48 h. Conservare le colonie isolate di C. difficile in crisiali a -80 ° C per ulteriori analisi.
- Testare sospette colonie C. difficile utilizzando il reagente di agglutinazione del lattice o PCR.
2. Coltura delle procedure cinetiche di C. difficile e di uccisione
- Crescere ceppi purificati ambientali o clinici di C. difficile sulle piastre di agarico in una camera anaerobica a 37 ° C per 48 ore.
- Prendere una colonia isolata con un anello di inoculazione, trasferirlo in 5 ml di media BHI in un tubo da 15 ml e crescere per 24 ore in una camera anaerobica a 37 ° C.
- Diluire le pre-colture da 1: 100 a circa 10 6 unità di formazione della coloniaS (CFU) / ml in BHIS fresco pre-ridotto (BHI plus estratto di lievito da 5 g / L e 1% di L-cisteina) integrato con taurocolato sodico 0,1% e la concentrazione appropriata di antibiotico (T0).
- Raccogliere un campione da 1 ml con una pipetta ad ogni punto temporale (T0, T6, T24, T48) e piastrellare / spargere una piccola aliquota (100 μL in diluizioni seriali) su una piastra di agar sangue. Lasciare che le cellule crescano sulla piastra agarica per 48 ore in una camera anaerobica a 37 ° C e contano il numero risultante di colonie per determinare CFU.
3. Preparazione di campioni per la scansione della microscopia elettronica
- Raccogliere 1 mL di cellule da ogni punto di tempo nei tubi di microcentrifuga e centrifugare a 10.000 xg per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare le cellule in PBS.
- Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 10 min e scartare il surnatante. Diluire le cellule in 1 ml di 4% di paraformaldeide e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Ripetere nuovamente campioni per 10 minuti a 10,000 xg e scartare il supernatante. Lavare le cellule due volte con acqua distillata e ridilizzare in 100 μL di acqua distillata. Regolare il volume in base alla torbidità della soluzione.
NOTA: fare una serie di diluizioni multiple è una buona idea. - Il coperchio dell'etichetta copre e aggiunge 40 μL del campione. Incubare per 15 minuti in un cappuccio di flusso per evaporare il liquido e permettere alle cellule di aderire alla copertura. Se il liquido è ancora presente, utilizzare un soffiatore per rimuovere il liquido.
- Posizionare le copertine contrassegnate con le celle in una macchina di sputtering della tavola e il nastro in giù. Salva l'oro puro nella macchina di sputtering. Accendere la macchina e avviare sputtering a bassa pressione (50 mTorr). Le cellule di coat per 30 s a 80 mA, che si traduce in 20 nm di rivestimento in oro.
- Trasferire le cellule rivestite al microscopio elettronico di scansione.
4. Imaging C. difficile Cells su un microscopio elettronico di scansione
- Sfiatare correttamente il microscopio elettronico di scansione (SEM) per prIl pulsante di sfioramento sul software del computer.
- Utilizzando nastro in carbonio, fissare le copertine rivestite sul piano metallico. Una volta che il SEM viene sfiato, la porta dovrebbe aprire facilmente. Bloccare la fase metallica nella camera SEM avvitandola.
- Fare clic sul pulsante PUMP sul software del computer. Il SEM sarà utile quando il sistema legge "Vac OK".
- Fare clic sul rivelatore SE sotto la linguetta dei rilevatori. Accendere il fascio facendo clic sul pulsante che visualizza la tensione. Avviare l'imaging ad una tensione inferiore (5 kV) prima di aumentare la tensione (fino a 15 kV). Una volta che il fascio è acceso, apparirà un'immagine.
- Utilizzando la funzione di tracciamento, individuare un'area sulle copertine rivestite per l'immagine. Ingrandire la regione e trovare strutture a forma di bacchetta; Questi sono clostridium difficile .
- Ingrandire e focalizzare l'immagine per calibrare il sistema. Questo deve essere fatto a più distanze di lavoro: 15, 9 e 5 mm. Immagine a una distanza di lavoro di 5 mm.
- Accendere l'uLtra ad alta risoluzione e comincia a focalizzare e ottimizzare l'astigmatismo.
- Iniziare a concentrarsi ad alta ingrandimento. Utilizzare il fuoco grossolano e fine per questo. Regolare anche l'astigmatismo per ottenere un'immagine più chiara.
- Regolare l'astigmatismo ad alta ingrandimento. A tal fine, regolare i cambi di astigmatismo (assomigliano alle finestre di messa a fuoco sottile / grossolana) e controllare l'immagine per la chiarezza ingrandendo digitalmente sul software del computer.
- Se la funzione di scansione lenta per raccogliere un'immagine di alta qualità. Salvare l'immagine raccolta come file .TIFF, che verrà utilizzato per l'analisi. Assicurarsi che la barra dati sia selezionata se le misurazioni saranno effettuate durante l'analisi.
- Raccogli le immagini ad angoli diversi (fino a 52 ° ruotando manualmente l'angolo direttamente sul SEM. Le immagini angolate tendono a rivelare informazioni più approfondite.
- Cambiare la tensione del fascio in base alle celle in fase di acquisizione. Tenere questo per la maggior parte tra 5 - 15 kV per tutti gli esperimenti. Al termine dell'immagine, spegnere il fascio e sollevare la distanza di lavoro a 20 mm. La camera può quindi essere scaricata e lo stadio può essere rimosso. Copiare tutte le immagini su un'unità per ulteriori analisi.
5. Elaborazione e analisi delle immagini
- Scaricare e installare il software libero FIJI (http://fiji.sc) sul computer.
- Aprire il file immagine in FIJI.
- Utilizzando la funzione di linea, tracciare con precisione la barra di scala.
- Fare clic sulla scheda Analizza nel programma FIJI e infine selezionare la funzione Seleziona scala. Apparirà una finestra che richiederà l'impostazione della distanza nota basata sulla barra di scala. Modificare anche l'unità di lunghezza e fare clic su OK.
- Ora che il programma è calibrato per la distanza, utilizzare la funzione di linea per misurare la lunghezza della cella. Per ottenere la lunghezza, utilizzare la funzione di linea per tracciare la cella nella sua interezza. Seleziona nuovamente la scheda Analizza, quindi fai clic su Misura. La lunghezza dovrebbe appOrecchio nelle unità indicate precedentemente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile è un batterio che forma spore e quindi è essenziale determinare le differenze morfologiche tra cellule vegetative e spore prima di qualsiasi analisi funzionale. La Figura 1 mostra immagini rappresentative di cellule vegetative che sono state catturate durante la fase esponenziale della curva di crescita e delle cellule di spore. Come descritto, le cellule vegetative sono strutture lunghe e lisce, mentre le spore sono piccole strutture ovali che presentano un esterno ruvido. Funzionariamente, le cellule vegetative crescono e si dividono rapidamente e sono responsabili della virulenza delle infezioni da C. difficile, mediante la secrezione di tossine, mentre le spore sono normalmente inattive e poco attive. Quindi, gli antibiotici sono principalmente attivi contro le cellule vegetative, mentre le spore sono solitamente resistenti al trattamento farmacologico, a causa di diversi strati proteggenti il nucleo con il DNA e la mancanza di attività fisiologica. A causa di questi fatti, la maggioranzaDell'analisi morfologica si concentra sulle cellule vegetative. 11 , 12
Una curva antibiotica di uccisione è la metodologia standard per dimostrare l'efficacia antibiotica contro i batteri in crescita. Le concentrazioni usate con il ceppo C. difficile R20291 sono state basate sui valori MIC, 1 μg / mL per la vancomicina e 0,51 μg / mL per metronidazolo. Come mostrato in Figura 2 , le cellule di controllo crescono e raggiungono un plateau, mentre le cellule trattate diminuiscono nelle unità di formazione totale della colonia (CFU) fino al limite di rilevazione (LOD) che dimostra l'effetto battericida. Come dimostrato, la vankomicina ( Figura 2A ) e metronidazolo ( Figura 2B ) sono efficaci per uccidere C. difficile a concentrazioni supraMIC (4xMIC). Si può notare che le curve di uccisione degli antibiotici sembrano simili, tuttavia i farmaci hanno diversi meccanismi di AC(La vancomicina impedisce la sintesi della parete cellulare mentre il metronidazolo influenza la replicazione del DNA). Pertanto, proponiamo che le curve antibiotiche di uccisione potrebbero non avere abbastanza di un potere discriminatorio per fornire differenze dettagliate tra questi antibiotici. Abbiamo utilizzato la microscopia per fornire una maggiore discriminazione.
A causa della sua dimensione microscopica, C. difficile non è possibile immagini senza ingrandimento elevato. Questo ha fornito l'opportunità di utilizzare la microscopia a scansione elettronica (SEM), un metodo di imaging che può ottenere la risoluzione a scala nanometrica, per valutare gli effetti dettagliati del trattamento antibiotico direttamente sulle cellule. Per dimostrare l'utilità di questo approccio, le cellule sono state immagazzinate prima e dopo il trattamento farmacologico per determinare la modifica della morfologia ( Figura 3A ). Come dimostrato, alcune delle pareti delle cellule sono state colpite, come nel caso della vancomicina, e alcune delle cellule erano più piccole in dimensioni,Come per il metronidazolo. Per verificare se la dimensione delle cellule sia stata influenzata, abbiamo analizzato la lunghezza delle celle usando il programma FIJI. Le dimensioni cellulari vegetative possono variare alcune nel caso di controllo, ma la maggior parte sono di lunghezza di circa 6 μm ( Figura 3B ). Quando si considerano molte cellule dalle impostazioni di controllo e trattamento, si nota rapidamente che la lunghezza della cellula è prevalentemente influenzata in metronidazolo ma non è influenzata dal trattamento con vankomicina ( Figura 3C ).
Figura 1: Differenziazione tra tipi di cellule mediante scansione della microscopia elettronica. Sono mostrate immagini rappresentative di cellule vegetative e spore Clostridium difficile. Le cellule vegetative sono strutture di asta che sono lunghe e flagellate. Al contrario, le cellule di spore sono piccole e hanno un mantello grezzo e sconnesso. Le spore sono pseudo-colorate per l'immagine purpoSes solo. Le barre di scala sono visualizzate sulle immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curve Antibiotiche Time-Kill. Le curve di uccisione SupraMIC sono state trasportate per quattro diversi antibiotici: vancomicina (A) , metronidazolo (B) . Questi antibiotici avevano un'azione di uccisione significativa contro il ceppo C. difficile R20291 e si avvicinavano al limite di rilevazione (LOD) per il conteggio delle unità di formazione della colonia (CFU). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esame degli effetti farmacologici del trattamento antibiotico. Le immagini delle cellule trattate e non trattate sono state prese in più punti temporali durante gli studi cinetici di uccisione (A) . Viene mostrato un esempio rappresentativo di una cellula vegetativa di controllo misurata per la lunghezza (B) . Le cellule trattate e non trattate sono state misurate e confrontate (C) . Gli esperimenti sono stati eseguiti in almeno duplicati e> 17 cellule sono state misurate per gruppo. * P <0,05 rispetto ai controlli e ai gruppi di trattamento con vankomicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'obiettivo dello studio è stato quello di creare un metodo ad alto throughput per l'isolamento di C. difficile e la prova di suscettibilità antibiotica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) come mezzo per una caratterizzazione più approfondita dell'azione farmacologica dell'antibiotico. Utilizzando i protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato che l'imaging della risposta fenotipica della cellula al trattamento antibiotico può rivelare una visione dell'azione farmacologica del farmaco. In totale, la porzione di imaging di questo protocollo dura circa 2 ore dopo la raccolta delle cellule, ma può essere molto più discriminatorio rispetto agli studi cinetici tipici di uccisione. Mentre l'apprendimento per l'utilizzo di un SEM può essere tecnicamente impegnativo, la preparazione dei campioni è relativamente semplice e veloce. Riteniamo che questi protocolli descritti qui forniscano un approccio obiettivo per valutare l'azione farmacologica del trattamento antibiotico.
Considerando le somiglianze tra tLe curve di uccisione degli antibiotici ( Figura 2 ), abbiamo cercato di determinare se esistessero differenze tra la risposta della cellula al trattamento farmacologico. Utilizzando SEM, abbiamo determinato che metronidazolo avesse effetti sulla lunghezza cellulare nelle concentrazioni supraMIC del farmaco. Mentre questi fenotipi non sono stati riportati in precedenza, sono coerenti con i meccanismi di azione degli antibiotici e suggeriscono un effetto sul metabolismo cellulare e sulla crescita. Al contrario, la vancomicina ha avuto effetti significativi sulla parete cellulare, che è anche coerente con il suo meccanismo di azione. 13 Mentre esistono somiglianze tra la cinetica di uccisione tra questi antibiotici, risulta dalle immagini SEM che esistono significative differenze fenotipiche. Creare una libreria di fenotipo antibiotico permetterà una caratterizzazione più approfondita di farmaci che potrebbero non avere un chiaro meccanismo di azione identificato, come nel caso del ridinilazolo.
becausE questo metodo è tecnicamente impegnativo, potrebbero essere necessarie modifiche per affrontare la questione scientifica, compresa la preparazione costante delle cellule e le alterazioni di sputtering del rivestimento in oro. Troppa rivestimento può sfocare gli effetti sull'esterno delle cellule, ma non abbastanza rivestimento può provocare la carica del fascio e distorcere le immagini. Per evitare ciò, preparate campioni con diverse quantità di rivestimento in oro per ottimizzare il tempo di sputtering. Infine, una metodologia coerente tra gli studi permetterà di effettuare confronti inter-sperimentali.
Una limitazione dell'utilizzo di SEM è che è limitata all'osservazione dei cambiamenti della morfologia cellulare; Pertanto, sono necessari studi funzionali per confermare qualsiasi sospetta risposta. A causa di ciò, riteniamo che questo protocollo di imaging possa essere usato come mezzo per condurre studi funzionali. Nonostante questa limitazione, l'etichettatura immunogold può essere fatta usando SEM per confermare eventuali modifiche sospette nella tratta o nella aggregazione di proteine;Tuttavia, non abbiamo ancora condotto questi esperimenti.
A causa della pipeline attiva di nuovi antibiotici per il trattamento di C. difficile, è necessaria una valutazione più approfondita dell'azione farmacologica. Come qui presentato, SEM offre un'opportunità unica, altamente produttiva e affidabile per caratterizzare l'azione farmacologica. Imaging di molti effetti antibiotici diversi tra vari ceppi di C. difficile , potremo capire perché alcuni antibiotici sono più efficaci rispetto ad altri specifici ceppi patogeni come il ceppo epidemico 027 / NAP1 / BI. Inoltre, l'analisi SEM può essere utile per discriminare gli effetti antibiotici tra ribotipi o ceppi e potrebbe essere utilizzato per studiare altre specie batteriche che dimostrano la sua ampia applicabilità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
