Summary
وصف هنا هو وسيلة لإنتاج السيتوكينات الخارجية في الطعم أجنبي المستمدة المريض (بدكس) الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الأسبوعي للخلايا الخلوية ترانزدوسد خط الخلايا. هذا الأسلوب يوسع فائدة بدكس ويوفر خيار عابرة أو متواصلة تسليم السيتوكينات الخارجية في العديد من النماذج بدكس.
Abstract
يتم إنتاج طعم أجنبي المستمدة المريض (بدكس) الفئران عن طريق زرع الخلايا البشرية إلى الفئران المناعية ناقصة. هذه النماذج هي أداة هامة لدراسة آليات الدم و الخبيث الطبيعي و هي المعيار الذهبي لتحديد العلاج الكيميائي الفعال لكثير من الأورام الخبيثة. نماذج بدكس ممكنة لأن العديد من السيتوكينات الماوس تعمل أيضا على الخلايا البشرية. ومع ذلك، هذا ليس هو الحال بالنسبة لجميع السيتوكينات، بما في ذلك العديد التي تعتبر حاسمة لدراسة تكون الدم الطبيعي والخبيث في الخلايا البشرية. التقنيات التي مهندس الفئران لإنتاج السيتوكينات البشرية (المعدلة وراثيا وتدق في نماذج) تتطلب نفقات كبيرة قبل فائدة من هذا النموذج وقد ثبت. تقنيات أخرى هي كثيفة العمالة (حقن السيتوكين المؤتلف أو العدوى) وفي بعض الحالات تتطلب مستويات عالية من الخبرة التقنية (حقن هيدروديناميكي من الحمض النووي). ويصف هذا التقرير طريقة بسيطة لتوليد الفئران بدكس التي لها سيان الإنسان الخارجيةتوكين (تسلب، الليمفاوية اللحمية الغدة الصعترية) عن طريق الحقن داخل الصفاق الأسبوعي من سدى التي تم ترانزدوسد إلى أوفيركسريس هذا السيتوكين. استخدام هذا الأسلوب يوفر في الجسم الحي مصدر إنتاج السيتوكينات المستمر الذي يحقق مستويات فسيولوجية تعميم السيتوكين الإنسان في الماوس. مستويات البلازما من السيتوكينات البشرية يمكن أن تختلف على أساس عدد من الخلايا اللحمية حقن، ويمكن البدء في إنتاج السيتوكينات في أي نقطة في التجربة. وتشمل هذه الطريقة أيضا سيتوكين سلبية الفئران السيطرة التي تنتج بالمثل، ولكن من خلال الحقن داخل الصفاق من سدى ترانزدوسد مع ناقلات التحكم. لقد أثبتنا سابقا أن خلايا اللوكيميا التي تحصد من تسلب معربا عن بدكس، بالمقارنة مع بدكس السيطرة، يحمل نمط التعبير الجيني أشبه عينة المريض الأصلي. معا تنتج السيتوكين والفئران بدكس السيتوكين السلبية التي تنتجها هذه الطريقة توفير نظام نموذج التي استخدمناها بنجاح لدراسةدور تسلب في تكون الدم الطبيعي والخبيث.
Introduction
زينوغرافتس المشتقة من المريض (بدكس) هي قوية في نموذج الجسم الحي لدراسة إنتاج الخلايا المكونة للدم والخبيثة في بيئة الثدييات "الأم". في معظم الأحيان، يتم إنتاج بدكس عن طريق حقن أو زرع الخلايا البشرية في الفئران المناعية نقص المناعة. إنتاج بدكس باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم يسمح في الدراسات المجراة من الدم البشري العادي وتطوير الخلايا المناعية. بدكس تنتج من سرطان الدم أو الخلايا السرطانية الأخرى تجعل من الممكن لدراسة الآليات الجينية وتحديد العلاجات الفعالة في سياق مجموعة من المناظر الطبيعية والطفرات الوراثية الموجودة في السكان. 1 ونتيجة لذلك، بدكس هي المعيار الذهب الحالي للبحوث الطبية الحيوية متعدية لتحديد العلاجات الفعالة وأداة هامة لفهم آليات تطور السرطان. نماذج بدكس هي أداة أساسية للمساعدة في البحث في الأمراض الفوارق الصحية بسبب محددة الآفات الجينية، أو أي مرض حيث التغيرات في المشهد الجيني للمريض يمكن أن تسهم إلى حد كبير في تكوين الأورام ونتائج العلاج.
ماوس الإنسان بدكس نماذج ممكنة لأن العديد من السيتوكينات الماوس تقليد بما فيه الكفاية نظائرها الإنسان في تفعيل مستقبلات السيتوكين من الخلايا البشرية بينما هم داخل الماوس. على سبيل المثال، انترلوكين 7 (إيل-7) يوفر إشارة حاسمة لتطوير الخلايا البشرية B. 2 في هذه الحالة، الماوس إيل-7 لديه التماثل كافية مع الإنسان إيل-7 أن السيتوكين الماوس يحفز مسارات الإشارات في السلائف الخلية B الإنسان. 2 ، 3 ، 4 ومع ذلك، هذا ليس هو الحال بالنسبة اللمفاوية اللحمية الغدة الصعترية (تسلب)، 5 ، 6 والتي من بين السيتوكينات الأخرى (إيل-3، المحببة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (غم-كسف)، عامل الخلايا الجذعية (سف) ،ريف "> 7 مهم لإنتاج الخلايا المكونة للدم الطبيعية والخبيثة، وعندما تظهر الفئران والسيتوكينات البشرية منخفضة التماثل السيتوكينات الماوس لا تنشيط مستقبلات كل منها على الخلايا البشرية.لتغلب على هذه العقبة، وقد تم استخدام عدد من الاستراتيجيات لتهريب السيتوكينات البشرية في الفئران بدكس، وتشمل حقن السيتوكينات البشرية المؤتلف، والحقن الهيدروديناميكي من الحمض النووي، والتعبير لنتيفيرال، التعبير المعدلة وراثيا واستبدال الجنين نوكين 7 يصف هذا التقرير طريقة للهندسة بدكس لإنتاج السيتوكين البشري عن طريق بوساطة اللحمية تسليم السيتوكينات ( الشكل 1 ).
في الطريقة الموضحة هنا، صممت الفئران بدكس للتعبير عن السيتوكين البشري، تسلب، أو بمثابة الضوابط السلبية سيتوكين. يتم تحقيق تسلب معربا عن بدكس عن طريق الحقن داخل الصفاق أسبوعيا من الخلايا اللحمية التي تم ترانزدوسد للتعبير عن مستويات عالية من تسلب الإنسان.يتم هندسة السيتوكين سلبية بدكس "السيطرة" الفئران بالمثل؛ على الرغم من ترانسدوسد سدى التحكم مع ناقلات التحكم. هذا الأسلوب يحقق المستويات الفسيولوجية الطبيعية من تسلب الإنسان في الفئران بدكس حقن مع تسلب + سدى. لا لوحظ تسلب قابل للكشف في الفئران بدكس تلقي سدى خلوى سلبية. اخترنا خط الخلايا انسجة الإنسان هس-27A لدراستنا لأنه ينمو بقوة في الثقافة ويظهر مستوى منخفض جدا من إنتاج السيتوكينات التي لا تدعم انتشار الخلايا الاصلية معزولة في كوكولتوريس. 8 لتعبير الإنسان تسلب، تم ترانزدوسد سدى مع الجيل المتقدم ناقلات لنتيفيرال الذاتي تعطيل مشتقة من العمود الفقري وصفها سابقا، 9 ويشمل عنصر كبت / كتس وعنصر وودشوك التهاب الكبد بعد النسخي التنظيمي (وري) لزيادة التعبير التحوير. تم بناء جين تسلب البشري في هذا المتجه تحت سيطرة عامل استطالة -1(إف-1) ألفا المروج لتحقيق قوية، التأسيسية، والتعبير على المدى الطويل.
هندسة هذا الإنسان سيتوكين تعزيز نموذج بدكس يتكون من 4 خطوات رئيسية. أولا، يتم توسيع سدى ترانزدوسد في المختبر وتقييمها من قبل مقايسة المناعي المرتبط الانزيم (إليسا) لإنتاج مستقر، مستوى عال سيتوكين. ثانيا، يتم التحقق من نشاط سيتوكين الإنسان التي تنتجها الخلايا انسجة ترانسدوسد (وعدم وجود نشاط السيتوكين من سدى السيطرة) باستخدام التدفق الخلوي الفوسفو. خطوط الخلايا المعروفة بأنها تستجيب للسيتوكين من الفائدة (في هذه الحالة، تسلب) وتحضن مع طاف الخلايا اللحمية ومعايرة لالفسفرة الناجم عن السيتوكين. ثالثا، يتم حقن الفئران مع سدى الإنسان ترانسدوسد ثم يتم تقييم البلازما الماوس من قبل إليسا لمستويات سيتوكين الإنسان على أساس أسبوعي. رابعا، يتم زرع الخلايا المكونة للدم البشرية ويتم تقييم الآثار الوظيفية في الجسم الحي من السيتوكين البشري على هدف معروف ( تسليم السيتوكينات البشرية عن طريق الخلايا اللحمية تقدم كل من مزايا وعيوب بالمقارنة مع طرق أخرى لتقديم / إنتاج السيتوكينات البشرية في الفئران بدكس. 7 بالمقارنة مع حقن السيتوكين الإنسان المؤتلف، والتسليم بوساطة سدى عادة ما تكون أقل تكلفة (تكلفة زراعة الخلايا اللحمية هو أقل من تكلفة السيتوكين المؤتلف) وأقل كثافة اليد العاملة (حقنة واحدة في الأسبوع مقابل حقن متعددة في الأسبوع). كما يتم تخفيف مسألة قصيرة العمر الخلوي السيتوكين منذ سدى تنتج باستمرار السيتوكين خارجي. تسليم السيتوكين عن طريق الحقن الهيدروديناميكي من الحمض النووي قد تكون أقل تكلفة من التسليم عن طريق سدى. ومع ذلك، فإنه هو عابرة على نحو مماثل، وقد تتطلب مهارة فنية أكثر من الحقن البريتوني أسبوعي بسيط المطلوبة للتسليم بوساطة سدى. لنتيفيرال التعبير الجيني في الماوس قد توفر أقل ترانسينت طريقة تسليم السيتوكينات؛ ومع ذلك، في أيدينا لم تتحقق مستويات تسلب الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو كثيفة العمالة، مما يتطلب إنتاج مستمر من ناقلات لنتيفيرال. المعدلة وراثيا أو تدق في الفئران عرض مستقر التعبير على المدى الطويل من السيتوكينات ويمكن هندستها للتعبير معين الأنسجة، والتي يمكن أن تكون ميزة. من ناحية أخرى، فإن التعبير المعدلة وراثيا للجين السيتوكين البشري على الخلفية الماوس نقص المناعة المطلوبة لفئران بدكس، يستلزم استثمارا هائلا من الموارد قبل أن يتم إنشاء قيمة النموذج. وعلاوة على ذلك، نماذج المعدلة وراثيا لا تسمح عموما لخيار تغيير توقيت بدء سيتوكين أو مستوى في إنتاج سيتوكين الجسم الحي . ويمكن تحقيق هذه مع تسليم بوساطة سدى ببساطة عن طريق تغيير نقطة زمنية لبدء حقن الخلايا اللحمية أو جرعة من خلايا انسجة حقن. الخلايا اللحمية بوساطة سيتوكين تسليم ميثأود مفصلة هنا استخدمت لتطوير بدكس لتقييم دور تسلب في الإنسان العادي B التنمية الخلايا 4 و 6 وخطورة عالية B- خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد. 6 هذا الأسلوب يوفر وسيلة بديلة السيتوكين التسليم لاستخدامها في توليد نماذج مماثلة مع السيتوكينات البشرية الأخرى من تسلب. هذا النموذج يمكن أيضا أن تكون مفيدة لتوليد البيانات الأولية التي يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كانت قيمة السيتوكين المعدلة وراثيا أو السيتوكين تدق في نموذج بدكس سيكون جديرة من الوقت والاستثمار المال. 
الشكل 1: نموذج بدكس هندسيا لإنتاج سايتوكين الإنسان الخارجية في الفئران. ( 1A ) تجربة التصميم والحصول على خلايا انسجة الإنسان ترانسدوسد ( 1B ) الحصول على خلايا الإنسان (الخلايا الجذعية المكونة للدم، وخلايا اللوكيميا، وما إلى ذلك ) لتوليد بدكس (المستمدة المريض طعم أجنبي) الفئران. ( 2A ) حقن سدى المهندسة و ( 2B ) زرع الخلايا البشرية في الفئران نقص المناعة وفقا الجدول الزمني التجريبي. ( 3A-B ) رصد تركيزات السيتوكينات في طاف سدى والبلازما الماوس من قبل إليسا. ( 4 ) حصاد الخلايا البشرية وتقييم الآثار الوظيفية في الجسم الحي من السيتوكين الإنسان الحاضر في بدكس. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت الدراسات وفقا ل لوما ليندا الجامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك) ومجلس المراجعة المؤسسية (إيرب) وافق البروتوكولات وفقا لجميع المبادئ التوجيهية الاتحادية.
تنبيه: يجب التعامل مع بدكس والأنسجة البشرية وفقا لإجراءات السلامة لمنع انتقال مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم.
1. الثقافة والتوسع من الخلايا الخلوية ترانزدوسد سترومال
ملاحظة: في كل مرة سدى ستروما، حصاد طاف الثقافة (1 مل قسامة) وتخزينها في -80 درجة مئوية للتقدير المستقبلي من مستوى السيتوكين عبر فحص إليسا.
- إعداد وسط ثقافة R10 وتجميد المتوسطة كما هو موضح في جدول المواد.
- توليد 10 ، 11 أو الحصول على سدى السيطرة (ترانزدوسد مع ناقلات فارغة) و سيتوكين المنتجة (تسلب +) سدى."> 6 مخزن في النيتروجين السائل (لن 2 ) حتى استخدام خلايا انسجة ذوبان الجليد كما هو موضح 12 وصفيتها في 5 مل من R10 المتوسطة في قوارير ثقافة خلية T-25 منفصلة.الخلايا الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ كو 2. هذا هو ما بعد الذوبان "مرور # 1".
- مرة واحدة سدى هي متموجة (24-48 ساعة)، وخلايا مرور عن طريق التربسين باستخدام 1 × التربسين إدتا (0.25٪) وإعادة طلاء في قارورة ثقافة T-150. هذا هو ما بعد الذوبان "مرور # 2".
- عندما سدى تحقيق كونفلنسي في قوارير T-150 (3-4 أيام في وقت لاحق)، مرور الخلايا عن طريق التربسين. استخدم تعليق الخلية هذا للاحتياجات التجريبية.
- توسع الخلايا إلى قوارير متعددة
- تقسيم الخلايا تحصد بين ثلاث قوارير T-150 والثقافة حتى متموجة. كرر هذه الخطوة إذا كان التوسع سدى ضروري. نموذجي انسجة الإنسان (هس-27A) عدد الخلايا عند التقاء في قارورة T-150 هو ~ 5 × 10 6 .
- خلية sالغضب
- نقل تعليق خلية تحصدها إلى أنبوب مخروطي وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق، صب طاف و ريسوسبيند الخلايا في تجميد المتوسطة. تجميد وتخزينها في لن 2 ~ 1.5 × 10 6 خلايا في قارورة.
- لحقن سدى داخل الشريان داخل الفئران، انتقل إلى الخطوة 4.1.
- توسع الخلايا إلى قوارير متعددة
2. إليسا فحوصات لمراقبة في المختبر سايتوكين إنتاج من سدى ترانسدوسد
- شراء المتاحة تجاريا إليسا عدة فحص للكشف عن السيتوكين من الفائدة.
- ذوبان انسجة الخلايا اللحمية من السيطرة و سيتوكين المنتجة (تسلب +) سدى حصادها في أوائل والمتوسط وأواخر الممرات ( الشكل 2 ).
- تحديد تركيز تسلب في عينات طاف باستخدام مجموعة إليسا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. 13 تجميع هذه البيانات التسلسلية لمراقبة استقرار إنتاج السيتوكينات أثناء زراعة الخلايا ه ( الشكل 2A-B ).
- تحديد وتجاهل سدى المنتجة السيتوكين مع انخفاض أو أقل من التعبير السيتوكينات، وكذلك أي قارورة المقابلة في التخزين ( الشكل 2A-B ).
- تحديد والحفاظ على سدى تنتج السيتوكينات التي تثبت تركيزات مستقرة، عالية المستوى السيتوكينات. استخدام هذه الذوبان للتجارب.
- استخدام عدة إليسا لمراقبة روتينية سدى طوال مدة زراعة الخلايا (على الأقل 1 مرة خلال مقاطع ما بعد الذوبان في وقت مبكر ومتوسط وأواخر) لضمان إنتاج السيتوكينات مستقرة أو، في حالة سدى السيطرة، وغياب إنتاج السيتوكينات .
3. فوسفهو تدفق القياسات الخلوية لتقييم نشاط السيتوكين التي تنتجها سدى
ملاحظة: تقييم طاف من سدى المهندسة قبل التجربة الأولى للتحقق من النشاط الحيوي ذات الصلة من السيتوكين ولدت ستروما لتجربة فردية.إف "> 6 وبمجرد التحقق من صحة سدى المهندسة، ليس من الضروري إجراء مزيد من الاختبارات ما لم يتم تقديم سدى التي تم إنتاجها مع ناقل جديد.
- شراء MUTZ5 و / أو مه-CALL4 سرطان الدم خطوط الخلايا (تسلب استجابة)، 14 المؤتلف سيتوكين الإنسان، والأجسام المضادة المعتمدة لاستخدامها في فحوصات التدفق الخلوي الفوسفو للكشف عن الأهداف الفسفورية المصب المناسب.
- ذوبان الجليد طاف تحصد من السيطرة و ستيتوكين التعبير عن سدى.
- لوحة خلايا الخلايا اللوكيميا في R20 المتوسطة (انظر جدول المواد ) في تركيز 0.2 × 10 6 خلايا لكل بئر في 96 لوحة زراعة الأنسجة جيدا. لوحة 3 بئر لكل حالة للسماح للفحوصات ثلاثية. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. هذه المرة يسمح لفقدان أي الفسفرة التي وقعت خلال ظروف الثقافة السابقة.
ملاحظة: 12 بئرا لكل خط الخلية يوفر ثلاث فحوصات لكل حالة تجريبية هو مبين في الخطوة 3.4. <لي> بعد 2 ساعة في الثقافة، ونقل الخلايا من كل بئر لفصل 4 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق، في 4 درجات مئوية. صب طاف. - إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر لكل من الظروف التجريبية التالية (إجراء فحوصات في ثلاث نسخ): 1) السيطرة السلبية وسائل الإعلام فقط، 2) السيطرة الإيجابية وسائل الإعلام مع السيتوكين المؤتلف في تركيز التشبع (ق) (تسلب في 15 نانوغرام / مل، الخ )، 3) السيطرة ستروما طاف من سدى السيطرة، و 4) سيتوكين-ستروما طاف من سدى المنتجة السيتوكين.
- احتضان الخلايا لمدة المحدد من قبل فحص فوسفهو التجارية محددة (على سبيل المثال 30 دقيقة ل فوسفهو-STAT5 في MUTZ5 أو مه-CALL4 ردا على تسلب).
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وصب طاف.
- أداء فوسفهو التدفق الخلوي تلطيخ لكل بروتوكول الشركة المصنعة وجمع تدفق البيانات الخلوي. 15
- بوابة على خلايا سليمة على أساس الأمام (فسك، يشير إلى حجم الخلية) والجانب (سك، يشير إلى دقة الخلية) مبعثر الضوء.
- تحديد متوسط كثافة الفلورسنت (مفي) من الخلايا سليمة في كل عينة. مقارنة متوسط مؤسسة التمويل الأصغر التي تم الحصول عليها من القيم الثلاثية من طاف الخلايا اللحمية إلى ضوابط وسائل الإعلام الإيجابية والسلبية.
4. حقن سيتوكين-ترانسدوسد سدى في الفئران
ملاحظة: ثقافة هس-27A سدى لمدة لا تقل عن 3 ممرات ما بعد الذوبان قبل حقنها في الفئران لضمان الخلايا السليمة وإنتاج السيتوكينات كافية.
- إعداد سدى
- نقل الحصاد تعليق الخلايا اللحمية إلى أنبوب مخروطي وقسامة 10 ميكرولتر لعد الكريات. الحصول على عدد الخلايا الحية باستخدام تريبان الأزرق. 16 الطرد المركزي المتبقية سيل تعليق في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف من الخلايا مكعبات و ريسوسبيند بلطف الخلايا في الحجم اللازم من الفوسفات المعقمة مخزنة المالحة (بس) لحقن الماوس (اعتمادا على عدد من الفئران لحقن).
ملاحظة نموذجي تركيز الخلايا اللحمية لحقن الماوس: 0.5 × 10 6 -5 × 10 6 خلايا في الماوس في 200 برنامج تلفزيوني ميكرولتر. - الحفاظ على تعليق خلية انسجة في 4 درجات مئوية (أو على الجليد) حتى مباشرة قبل الحقن. تأكد من أن تعليق الخلية هو على الأقل في درجة حرارة الغرفة (رت) (~ 25 درجة مئوية) لحقن الفئران.
- حقن الخلايا اللحمية
- تطهير غطاء السلامة الحيوية، تجميع المواد للحقن ومن ثم وضع قفص الماوس في الداخل.
- مزيج بلطف تعليق الخلية عن طريق انقلاب قبل وضع 200 ميكرولتر إلى حقنة السلين.
- باستخدام تقنيات الحقن داخل البريتوني القياسية، 17كبح الماوس وإدارة 200 ميكرولتر تعليق الخلية في تجويف البريتوني. وقد أظهرت تفاصيل سابقا من قبل ماشولز وآخرون. 18
5. المسلسل جمع الدم ورصد البلازما للخلايا السيتوكين الإنسان الخارجية في الفئران
- جمع الدم عن طريق قصاصة الذيل
- تطهير غطاء السلامة البيولوجية وتجميع الماوس الفاصل، مقص وغيرها من الأدوات / اللوازم لهذا الإجراء.
- ضع الماوس في مقيدة وتأمين أنبوب لتقليل حركة الماوس.
- تطهير الذيل والمقصات الجراحية مع الكحول الآيزوبروبيل. تطبيق كريم موضعي مخدر على الذيل.
- باستخدام مقص جراحي حاد جدا قص قبالة حوالي 0.5-1 ملم من طرف ذيل الماوس. جمع ما يقرب من 80 ميكرولتر من الدم المحيطي باستخدام أنابيب الشعرية هيبارينيزد.
ملاحظة: إذا تم جمع الدم مع هذه الطريقة أكثر من ستة تيميس، إزالة الذيل يجب أن تكون محافظة مع احترام كمية الذيل إزالتها. كما قصاصات التقدم حتى الذيل يزيد القطر، فإنه نزيف أسرع، والشفاء يستغرق وقتا أطول.
- فصل البلازما
- نقل الدم باستخدام حقنة لمبة (لطرده من أنابيب الشعرية) في أنبوب K2 إدتا ميكروتينر المسمى. عكس 20 مرات لمنع التخثر.
ملاحظة: تخثر الدم عادة من ذيل الذيل سريع. ومع ذلك، إذا استمر نزيف أطول من ~ 2 دقيقة استخدام قلم رصاص / مسحوق مطهر للمساعدة في تخثر الدم. - أنابيب الطرد المركزي جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقسامة البلازما للتخزين (-20 درجة مئوية) حتى جاهزة لمقايسة إليسا.
- إذا كانت هناك حاجة إلى الفأر البشرية بيانات الخيمرية الخلية من الدم الماوس، ثم علاج بيليه المتبقية كما هو موضح في الخطوة 6.3.1. وإلا، تجاهل بيليه خلية الدم.
- نقل الدم باستخدام حقنة لمبة (لطرده من أنابيب الشعرية) في أنبوب K2 إدتا ميكروتينر المسمى. عكس 20 مرات لمنع التخثر.
- تعديل إليسا للالمجهرية الصغرىأبوم من البلازما الماوس
ملاحظة: تم تعديل الإجراء إليسا الشركة المصنعة من الموصى بها 100 ميكرولتر حجم العينة إلى حجم 40 ميكرولتر لاستيعاب الأحجام الصغيرة التي تم جمعها من الفئران. ليس من الممكن لتشغيل عينات البلازما الماوس في الجسم الحي في ثلاث نسخ مع هذه المجلدات محدودة. في نهاية التجربة ~ يتم جمع 500 ميكرولتر من الدم بعد الوفاة عن طريق ثقب القلب. يتم استخدام تركيزات سايتوكين تقييمها في 100 ميكرولتر من القتل الرحيم البلازما للتحقق من صحة 40 ميكرولتر في البيانات الجسم الحي لكل الماوس.- ذوبان الجليد عينات البلازما المجمدة.
- تمييع متسلسل معايير إليسا وصفيحة لهم في ثلاث نسخ في 40 ميكرولتر لكل بئر.
- إضافة 40 ميكرولتر من كل عينة البلازما الماوس إلى لوحة إليسا.
ملاحظة: إذا كانت عينة الماوس أقل من 40 ميكرولتر، ثم جلب حجم يصل إلى 40 ميكرولتر مع العازلة إليسا. سجل هذا الحجم مخفف واستخدامها لحساب عامل التخفيف لكل عينة المخفف. متىتحليل البيانات إليسا مضاعفة تركيز العينة المخففة من قبل عامل التخفيف العينة لتحديد تركيز السيتوكين الفعلي في العينة الأصلية. - استكمال فحص إليسا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
6. زرع الخلايا المكونة للدم في الفئران
- تشعيع تحت المميتة لشرط نخاع العظم لزرع
ملاحظة: جامعة لوما ليندا (لو) يستخدم مصدر الإشعاع الكوبالت -60. يتم وضع الحيوانات في ريستراينر فطيرة الذي وضعه 80 سم من مصدر الإشعاع في 20 × 20 سم الميدان ومع طبقة 0.5 سم من ليكسان على رأس المكبح. يتم احتساب الوقت التعرض لتحقيق 225 جرعة سغي استنادا إلى أحدث معايرة المصدر (حاليا 2-3 دقائق لهذا المصدر).- شبه الفئران تشعي الفئران (مجموع جرعة تشعيع الجسم من 225 سغي الحد الأقصى للفئران المناعية نقص المناعة).
- زرع الخلايا المكونة للدم ~ 24 ساعة في وقت لاحق عبر </ إم> الوريد حقن الوريد الذيل.
- زرع الخلايا الوريدية داخل الدم
- إعداد تعليق خلية الإنسان لزرع في حجم 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني العقيمة في الماوس: CD34 + الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسك): 1 × 10 5 إلى 5 × 10 5 خلايا في خلايا الماوس والخلايا اللوكيميا / عينات المريض: 1 × 10 6 إلى 5 × 10 6 خلايا في الماوس.
- إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية (النقل على الجليد) حتى مباشرة قبل زرع. ضمان الخلايا على الأقل في رت قبل زرع.
- تطهير غطاء السلامة الحيوية وإعداد منطقة غطاء محرك السيارة لحقن زرع.
- ضع الماوس في قفص الاحترار لمدة لا تقل عن 5 دقائق للسماح تمدد الأوردة الذيل.
- مزيج بلطف تعليق الخلية ورسم 200 ميكرولتر إلى حقنة السلين. وضع بأمان الإبرة جانبا حيث أنها ستبقى العقيمة.
- ضع الماوس في ضبط النفس وتطهير الذيل مع الكحول الآيزوبروبيل. </ لى>
- باستخدام تقنيات الحقن في الوريد القياسية، 17 حقن تعليق خلية الإنسان في الوريد الذيل الماوس.
ملاحظة: الحقن الوريد الذيل قد يستغرق عدة محاولات، وخاصة بالنسبة معالج الحيوان المبتدئ. كوفاسسيكس و رابر's جوف فيديو 19 يوفر مظاهرة مفصلة لهذه التقنية الحيوانية. - رصد الانتعاش الماوس لمدة ~ 5 دقائق. تسجيل أي أحداث ضارة أثناء الحقن (على سبيل المثال الخلايا المنسكبة، نزف كبير، الصدمة الذيل المفرط).
- تحليل خيمرية الخلية البشرية في الدم المحيطية الماوس
- الحصول على بيليه خلية الدم المتبقية في أنبوب ميكروتينر بعد فصل البلازما (الخطوة 5.2.3).
- لتحلل خلايا الدم الحمراء (رك)، ريسوسبيند بيليه الدم المتبقية في حجم بس تساوي البلازما إزالتها (لتحل محل حجم البلازما) وتخلط جيدا (دوامة / ماصة).
- نقل كل عينة الدم إعادة تعليق إلى أنبوب 4 مل المسمىومن ثم إضافة رك تحلل العازلة إلى كل أنبوب في نسبة 1: 9 (900 ميكرولتر العازلة تحلل رك ل 100 ميكرولتر إعادة تعليق الدم). احتضان لمدة 5 دقائق في رت. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 500 x ج) والصب.
- أداء الثانية رك تحلل العازلة حضانة (5 دقائق في رت). أجهزة الطرد المركزي والصب كما كان من قبل.
- غسل الخلايا المتبقية في ~ 1 مل بس. أجهزة الطرد المركزي والصب كما كان من قبل.
- ريسوسبيند بيليه في حجم برنامج تلفزيوني مناسب لتدفق الخلوي القياسية تلطيخ (وهذا يختلف وفقا لالمصنع وبروتوكولات المختبر الفردية). 20 استخدام الأجسام المضادة المناعية التحقق من صحة لتدفق سيوتميتري لتحديد خلايا الماوس (الماوس CD45 +) والخلايا البشرية (CD45 البشري +) 6 ، 21 فضلا عن علامات الكريات البيض البشرية إضافية محددة النسب النسبية للخلية.
ملاحظة: فمن المستحسن أن تأخذ حجم صغير (5 ميكرولتر -20 ميكرولتر) من كل عينة الماوس لإنشاء "عينات مجمعة". لاستخدام ل غير ملوثين، وقابلية البقاء، وعينات السيطرة إيزوتيب. ومن أفضل الممارسات أن يكون لها ضوابط غير ملوثين والنمط إيسوتيب لكل حالة تجريبية.
7. تقييم وظيفي في فيفو سايتوكين النشاط
- القتل الرحيم الماوس والأنسجة الحصاد
- الموت ببطء الفئران عن طريق الاختناق كو 2 في نقطة زمنية تجريبية معينة.
- حصاد الدم عن طريق ثقب القلب وجمع البلازما كما في الخطوات 5.2.1-5.2.2.
ملاحظة: جمع الدم قبل أنسجة أخرى لأنه يبدأ التخثر مباشرة بعد الموت. - معالجة الدم الماوس، قسامة وتخزين البلازما كما هو الحال في الخطوة 5.2.2.
- في وقت لاحق، وتقييم تركيز السيتوكينات الخارجية في البلازما التي تم الحصول عليها في القتل الرحيم عبر إليسا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تقييم ومقارنة تركيزات السيتوكينات الخارجية في البلازما الماوس من المسلسل في الجسم الحيوجمع الدم، وعينات البلازما القتل الرحيم (الموصوفة في القسم 5.3).
- إضافة بس إلى عينة الدم المتبقية لتحل محل حجم البلازما وعملية كما هو موضح في الخطوات 6.3.1 و 6.3.2. إجراء المقايسات التدفق الخلوي مباشرة أو ريسوسبيند الخلايا في تجميد المتوسطة لتخزين لن 2 .
- حصاد نخاع العظام (بم) والطحال من الفئران بدكس وإعداد تعليق خلية واحدة كما هو موضح سابقا. 22
- الحصول على التهم الخلية لكل بدكس عينة الأنسجة الماوس باستخدام حمض الخليك 3٪ مع الميثيلين الأزرق (ليسيس أغشية الخلايا و كرات الدم الحمراء ترك نوى سليمة من الخلايا الحية) في 1: 1 التخفيف وعد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تبويب مجموع تعداد الخلايا لنخاع العظام وعينات الطحال لكل حيوان.
- أجهزة الطرد المركزي (500 x ج، 15 دقيقة) تعليق خلية وصب طاف. إجراء فحوصات تدفق الخلوي من نخاع العظم و / أو خلايا الطحال على الفور أو ريسوسبيند في تجميد المتوسطة ل لن <سوب> 2 تخزين.
ملاحظة: تجميد 10 بم قسامات (للفحوصات البيوكيميائية في المستقبل) و ~ 5 أليكوتس الطحال (لزرع بدكس في المستقبل) في الماوس. - المناعي لتحديد الآثار في الجسم الحي وظيفية
- إعداد واحد سيد مزيج (مم) من الأجسام المضادة التدفق الخلوي إلى المناعي السكان المكونة للدم (ق) استجابة للسيتوكين الفائدة ومم الثانية من الأجسام المضادة السيطرة النمط النووي ( الشكل 5 وجدول المواد).
- ذوبان الجليد أكسس بدكس الأنسجة (37 درجة مئوية حبة حمام) أعدت في الخطوة 7.4.
- غسل الخلايا المذابة عن طريق نقلها إلى أنبوب مخروطي وإضافة 3X حجم أقل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي (500 x ج، 5 دقائق) وصب طاف.
- كرر الخطوة غسل (7.5.3).
- إنشاء أليكوتس المجمعة من خلال اتخاذ ~ 10 ميكرولتر -20 خلايا ميكرولتر من كل عينة بدكس للسيطرة غير ملوثين، ومراقبة البقاء على قيد الحياة، وضوابط إيزوتيب (انظر الخطوة 6.4.6 ملاحظة). وصمة عار جميع العينات، باستثناء شنينستيد السيطرة، مع قابلة للتثبيت صباغة البقاء (علامة الخلية الميتة)، احتضان ويغسل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- وصمة عار كل عينة خلية بدكس مع فينوتيبينغ-مم وفقا لمعيار التدفق الخلوي بروتوكول تلطيخ. على نحو مشابه وصمة عار العينة إيزوتيب-- مراقبة عينة (ق) مع إيزوتيب-مم. احتضان جميع العينات، وغسل مع برنامج تلفزيوني، وإصلاح العينات عن طريق إعادة تعليق في بارافورمالدهيد 1٪.
- جمع تدفق البيانات الخلوي وتحليل البيانات باستخدام استراتيجية النابضة المناسبة للسكان الخلية (ق) من الفائدة ( الشكل 5 ). والترحيل نموذجي هو كما يلي:
- تحديد الخلايا السليمة عن طريق رسم بوابة فسك و سك التي تستبعد الحطام.
- تحديد السكان الخلايا الحية عن طريق التباعد على الخلايا التي هي سلبية للعلامة الخلية الميتة (وهذا هو "الخلايا الحية الكلية").
- استخدام البوابات الفرعية داخل "مجموع الخلايا الحية" لتحديد بوبولتيونس الخلية مع المناعي المطلوب (انظر الشكل 5).
- الحصول علىتردد السكان الخلية الفرعية ضمن مجموع عدد الخلايا الحية من تحليل التدفق الخلوي. 6 ، 21
- حساب عدد الخلايا المستهدفة في كل الأنسجة عن طريق ضرب تردد الخلية الفرعية الخلية B، ضمن الخلايا الحية الإجمالية (التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.5.6.4) من قبل مجموع التعدادات الخلية الحية في الأنسجة التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.3 (٪ B خلية فرعية س " عدد خلايا الكريات الدموية "؛ انظر الجدول 1 )
- مقارنة التعداد الخلية من السكان الخلية المستهدفة بين السيطرة على الفئران بدكس والسيتوكين معربا عن (تسلب +) بدكس الفئران لتحديد في الجسم الحي الآثار الوظيفية للخلايا السيتوكين الإنسان الخارجية ( الجدول 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر الشكل 1 نظرة عامة على النموذج. مرة واحدة وقد تم الحصول على السيتوكينات المنتجة (تسلب + سدى) والسيطرة سدى تم توسيعها في الثقافة. قبل حقن سدى في الفئران، يتم تقييم طاف الخلايا اللحمية من قبل إليسا للتحقق من إنتاج السيتوكينات ( الشكل 2 ) ويستخدم قياس التدفق الخلوي الفوسفو (بروتوكول رقم 3) للتحقق من نشاط السيتوكين التي تنتجها سدى. يتم جمع طاف من الثقافات الخلايا اللحمية متموجة (سدى السيطرة و تسلب + سدى) عندما يتم تمرير الخلايا. يستخدم إليسا لمراقبة تركيز تسلب في طاف مرة واحدة على الأقل في أوائل، منتصف، والمراحل المتأخرة. وتظهر بيانات تمثيلية من سدى السيطرة في الشكل 2A . يجب التخلص من الثقافات السيطرة على الخلايا اللحمية التي تظهر التعبير تسلب (وأي قوارير المجمدة أسفل منها). يتم توسيع الثقافات السيطرة مع تسلب لا يمكن كشفها وتجميدها لاستخدامها في المستقبل.كما هو مبين في الشكل 2B الثقافات من تسلب + سدى تظهر انخفاض مستوى الإنتاج تسلب (وقوارير المجمدة أسفل منها) يتم التخلص منها. تسلب + سدى تظهر مستقرة، يتم اختيار إنتاج رفيع المستوى من السيتوكين للتوسع والتخزين للاستخدام في التجارب المستقبلية. يظهر متوسط مستويات تسلب في طاف من ثقافات متعددة من السيطرة و تسلب + سدى في الشكل 2C .
يظهر الجدول الزمني التجريبي لإنتاج الفئران بدكس السيطرة مع السيتوكين الإنسان في الشكل 3 . تبدأ الثقافات خلية انسجة 3 أسابيع قبل زرع و إليسا فحص من إنتاج في تسلسل في المختبر في طاف الثقافة يتم تنفيذ كما هو موضح في الشكل 2. في الجسم الحي الإنسان تسلب في البلازما الماوس يتم رصد أسبوعيا ( الشكل 4 ) باستخدام "إليسا تعديل ل أحجام صغيرة من البلازما الماوس "وصفها في بروتوكول رقم 4. Peripheraيتم جمع الدم في وقت واحد مع البلازما ويتم مقايسة كما هو موضح في بروتوكول رقم 6 تحت عنوان "تحليل تشيمريسم الخلايا البشرية في الدم المحيطية الماوس." بدكس حقن مع سدى السيطرة أظهرت باستمرار البلازما الإنسان تسلب المستويات التي هي أقل من عتبة للكشف ( الشكل 4A ). مستوى البلازما من تسلب في الفئران بدكس حقن مع تسلب + سدى يتناسب مع عدد من تسلب + الخلايا اللحمية حقن خلال 1-2 أسابيع السابقة. مستويات البلازما تسلب تنخفض بسرعة إذا تم وقف حقن الخلايا اللحمية. 6 كما هو مبين في الشكل 4B ، والحقن الأسبوعية من 0.5 × 10 6 تسلب + سدى (المنتجة في المتوسط> 1000 بيكوغرام / مل من تسلب في طاف الثقافة) أعطى مستويات البلازما تسلب بالقرب من الحد الأدنى من المستويات الفسيولوجية (~ 10-10 بغ / مل ). حقن أسبوعي من 5 × 10 6 تسلب + سدى في الفئران بدكس أدى إلى مستويات البلازما تسلب التي تصل إلى مستويات الفسيولوجية العالية (~ 35 بيكوغرام / مل) كما هو مبين في
وقد تبين تسلب لزيادة إنتاج السلائف الخلية B البشرية العادية. 23 وهكذا، لتقييم وظيفة في الجسم الحي من تسلب قارنا المنتج أيون من سلائف الخلية B البشرية الطبيعية في السيطرة وتسلب + الفئران بدكس زرعها مع الخلايا الجذعية المكونة للدم كما هو مبين في الشكل 5 وفي الجدول 1 . ويبين الشكل 5A التدفق الخلوي النابضة ل إمونوفينوتيبينغ تستخدم لتحديد مجموعات فرعية من خلايا الإنسان B النسب. وترد في الجدول 1 حسابات عينة لتعداد عدد الخلايا في كل مجموعة فرعية لوحدة تحكم بدكس واحدة ووحدة تسلب + بدكس واحدة. كما هو مبين في الشكل 5B، يتم زيادة الخلايا النسبية B بشكل كبير في تسلب + بالمقارنة مع السيطرة على بدكس وهذه الزيادة تبدأ مع أقدم السلائف الخلية B (الخلايا المؤيدة لل B). لم يكن عدد الخلايا النسبية غير B تختلف اختلافا كبيرا بين السيطرة و تسلب + بدكس (لا تظهر البيانات). يوفر هذا الفحص وسيلة للتحقق من أن تسلب الإنسان المنتجة في الجسم الحي في تسلب + بدكس تمارس في الجسم الحي آثار وظيفية على السكان الخلية المستهدفة.
أور 2 "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
الشكل 2: إليسا لمراقبة تسلب تركيزات السيتوكين في ستروما طاف. تم استخدام مقايسات إليسا لقياس تركيزات تسلب في طاف من سدى السيطرة (ترانسدوسد مع ناقلات التحكم) و تسلب + سدى (ترانسدوسد للتعبير عن الإنسان تسلب) مرة واحدة على الأقل خلال الممرات التالية الخلية: في وقت مبكر (مرور 1-5)، المتوسطة (الممرات 6-12)، وفي وقت متأخر (الممرات 13-20). عتبة الكشف عن الإنسان تسلب إليسا الفحص المستخدمة هنا هو 1.9 بيكوغرام / مل (خط متقطع الأحمر). ( A ) السيطرة سدى تنتج تركيزات الإنسان تسلب الحد الأدنى؛ وهذه المستويات هي عموما أقل من عتبة الكشف إليسا لمدة التجربة. يتم التخلص من سدى السيطرة في الثقافة التي تظهر زيادة تركيزات تسلب (> 15 بيكوغرام / مل) جنبا إلى جنب مع جميع قسامة المجمدة من تلك الثقافة. ( ب ) إنتاج الإنسان تسلب يختلف بين الثقافات الناتجة عن ديفيرنر قارورة من تسلب + سدى ( ن = 9) وطوال فترة الثقافة. يتم التخلص من سدى تسلب التي تظهر انخفاض إنتاج السيتوكين أو غير مستقرة (تسلب <1،000 بغ / مل). ( C ) متوسط تركيزات تسلب للسيطرة (الأخضر) و تسلب + (الأزرق) سدى (وسائل وفواصل الثقة 95٪). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الجدول الزمني التجريبي لتوليد بدكس الفئران مع المنشأ الخلوي الإنسان الإنتاج. في المختبر والجسم الحي أجزاء من التجربة التقدم في وقت واحد. السيطرة و + تسلب ثقافة سدى الخلايا بدأت 2-3 أسابيع قبل زرع الخلايا المكونة للدم، والذي يضمن ما لا يقل عن 3 ممرات الخلايا قبل الأول (فيوك -1) من الحقن الأسبوعية لحقن الخلايا. وهذا يضمن أن الخلايا اللحمية هي صحية، التكاثري وإنتاج مستويات السيتوكينات كافية. يتم جمع قسامات طاف عندما يتم تمرير الخلايا وتستخدم المقايسات إليسا لتحديد تركيز تسلب (انظر الشكل 2 ) في طاف سدى. يتم تشعيع الحيوانات في يوم 0، يوم واحد قبل زرع الخلايا المكونة للدم البشري في يوم 1. ويبدأ جمع الدم أسبوعي 1-2 أسابيع بعد الحقن سدى الأولى. في هذا الوقت، يجب أن تكون تركيزات سايتوكين الإنسان الخارجية للاكتشاف في البلازما الماوس باستخدام المقايسات إليسا المعدلة ( الشكل 4 ). نقطة نهاية التجربة هي 5-16 أسابيع بعد زرع الخلايا البشرية. وهذا يعتمد على كمية من الخيميائية خلية الإنسان الكشف عنها في الماوس الدم المحيطي. وعادة ما يتم تأسيس تكون الدم الطبيعي قبل أسبوع 5-7، الخيمية خلية الخيمية يختلف بين خطوط الخلايا والعينات الأولية (3-16 أسابيع). نجاح زرع بدكس والتقدم تعتمد أيضاعلى عدد الخلايا البشرية التي تم حقنها في عملية الزرع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحقيق الفسيولوجية الإنسان تسلب تركيز السيتوكينات في البلازما الماوس. الفئران تلقي الحقن داخل الصفاق الأسبوعية (200 ميكرولتر) من الخلايا ترانزدوسد ويتم جمع البلازما لتقييم تركيزات الإنسان تسلب (إليسا الفحص) في الجسم الحي في الفئران مع مرور الوقت. تلقت الفئران "السيطرة" 5 × 10 6 خلايا سدى السيطرة، في حين أن "تسلب + منخفضة" (منخفضة تسلب جرعة سدى) الفئران تلقى 0.5 × 10 6 تسلب + سدى الخلايا، و "تسلب + عالية" (عالية تسلب جرعة سدى) الفئران تلقى 5 × 10 6 تسلب + خلايا انسجة كل أسبوع. الإنسان تسلب إليسا الفحص عتبة الكشف 1.9 بيكوغرام / مل (خط متقطع الأحمر) والمجموعة الفسيولوجية البشرية من تسلب هو ~ 5 إلى 35 بيكوغرام / مل (التظليل الرمادي). 24 (المرجع 11 والمعاطف البيانات غير المنشورة) ( A ) "السيطرة" الماوس البلازما لديها باستمرار مستويات تسلب <5 بيكوغرام / مل أو أقل من عتبة الكشف إليسا. ( B ) "تسلب + منخفضة" البلازما الماوس يظهر مستويات الفسيولوجية منخفضة من تسلب. في حين ( C ) "تسلب + عالية" البلازما الماوس يظهر مستويات الفسيولوجية عالية. ( D ) متوسط تركيزات تسلب لكل مجموعة تجريبية (يعني ± سيم من جميع الفئران و تيمبوانتس) تبين أن مستويات تسلب الكشف في البلازما الماوس يتناسب مع جرعة سدى وردت. التحكم في مستويات البلازما الماوس تحت عتبة الكشف إليسا و "تسلب + عالية" مستويات البلازما أربعة أضعاف أكبر من "تسلب + منخفضة" مستويات البلازما الماوس."> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فحص السكان العاديين خلية B البشرية التحقق من صحة ن فيفو آثار وظيفية من تسلب الإنسان الخارجية في الفئران بدكس. تم تصميم الفئران بدكس مع السيطرة و تسلب + سدى وزرعها مع خلايا CD34 + الإنسان معزولة عن دم الحبل السري. تم استخدام المناعية الظاهرية عن طريق التدفق الخلوي لتحديد مجموعات فرعية من السلائف الخلية B الإنسان في نخاع العظام التي تحصد من السيطرة و تسلب + بدكس على النحو التالي: نخاع العظام المحصودة، وذاب وملطخة صباغة البقاء قابلة للتثبيت، وملطخة لتدفق الخلوي للكشف عن المضادة للالتهابات، CD45 الإنسان، CD19، CD34، κ & λ سلسلة الخفيفة، وإما إيغد السطح و إيغم أو داخل الغلوبولين المناعي (ميكروغرام). ( A ) مجموع سيل المعيشةكانت مسورة على أساس علامة الجدوى. وتظهر المؤامرات المتتالية بوابات لاحقة لتحديد مجموعات فرعية متسلسلة ب تنمويا (البيانات المعروضة من تسلب + بدكس). ( B ) تم تحديد تواتر كل مجموعة فرعية ضمن الخلايا الحية الكلية عن طريق برنامج التدفق الخلوي وأحسبت أعداد الخلايا في كل خلية فرعية فرعية ب. (انظر الجدول 1). تعداد الخلايا لكل خلية فرعية فرعية في السيطرة (أسود، ن = 3) و تسلب + (الأزرق، ن = 5) الفئران بدكس هي الرسوم البيانية. (يعني ± سيم، * p <0.05، ** p <0.01، **** p <0.0001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خلية الخلية البشرية | التكرار. من إجمالي خلايا المعيشة | يعيش خلية العد in بم | # الخلايا في السكان |
| التحكم الماوس | |||
| مجموع الخلايا الحية | 100.00٪ | 39.5 × 10 6 | 39.5 × 10 6 |
| hCD45 + | 98.50٪ | 39.5 × 10 6 | 38.9 × 10 6 |
| إجمالي CD19 + | 27.20٪ | 39.5 × 10 6 | 10.7 × 10 6 |
| برو-B | 24.20٪ | 39.5 × 10 6 | 9.56 × 10 6 |
| قبل-B | 1.70٪ | 39.5 × 10 6 | 0.68 × 10 6 |
| غير ناضج ب | 0.83٪ | 39.5 × 10 6 | 0.33x 10 6 |
| ناضجة ب | 0.68٪ | 39.5 × 10 6 | 0.27 × 10 6 |
| تسلب + الماوس | |||
| مجموع الخلايا الحية | 100.00٪ | 72.0 × 10 6 | 72.0 × 10 6 |
| hCD45 + | 99.30٪ | 72.0 × 10 6 | 71.5 x 10 6 |
| إجمالي CD19 + | 65.10٪ | 72.0 × 10 6 | 46.8 × 10 6 |
| برو-B | 60.20٪ | 72.0 × 10 6 | 43.3 × 10 6 |
| قبل-B | 2.70٪ | 72.0 × 10 6 | 1.92 × 10 6 |
| غير ناضج ب | 1.60٪ | 72.0 × 10 6 | 0.11 × 10 6 |
| ناضجة ب | 0.40٪ | 72.0 × 10 6 | 0.29 × 10 6 |
الجدول 1: تواتر وتعداد الخلايا البشرية الطبيعية ب مجموعات فرعية في بدكس نخاع العظم. تم تحديد وتيرة (٪) من كل مجموعة فرعية خلية B ضمن الخلايا الحية الإجمالية عن طريق تحليل التدفق الخلوي (انظر الشكل 5A لاستراتيجية القوارب). نخاع العظام الممثل (بم) البيانات من تحكم واحد الماوس بدكس (تلقى السيطرة سدى حقن، 5 × 10 6 خلايا / أسبوع) واحد تسلب + بدكس الماوس (تلقى تسلب حقن سدى، 5 × 10 6 خلايا / الأسبوع). وسجلت مجموع التعداد خلية بم المعيشة في القتل الرحيم وتم استخدام علم المناعة الخلوي تدفق التدفق الخلوي لتقييم تردد مجموعة فرعية (٪) وحساب حجم كل خلية فرعية الخلية الفرعية (عدد الخلايا الفرعية مجموعة = "توتالخلايا الحية "x" التردد الفرعي ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة وسريعة وفعالة نسبيا من حيث التكلفة للهندسة بدكس للتعبير عن السيتوكين البشري الخارجي. وتستند الاستراتيجية الموصوفة هنا على الحقن داخل الصفاق الأسبوعي من خط الخلايا اللحمية ترانزدوسد للتعبير عن السيتوكين البشري، تسلب. قبل تنفيذ الطرق الموصوفة هنا، تم إنشاء سدى مصممة للتعبير عن مستويات عالية من السيتوكين من الفائدة (تسلب) و سدى تحكم مماثلة هندسيا. في البروتوكولات المعروضة هنا، يتم توسيع سدى في الثقافة وفحصها للقدرة على توفير مستقرة، وارتفاع مستوى إنتاج السيتوكينات مع مرور الوقت (أو لغياب إنتاج السيتوكينات في حالة سدى السيطرة). وأجريت فحوصات للتحقق من نشاط السيتوكينات التي تم إنشاؤها سدى والجداول الزمنية التجريبية لحقن الخلايا اللحمية وضعت لإنتاج بدكس مع الإنسان الفسيولوجية تسلب (والسيطرة على الفئران التي تفتقر الإنسان تسلب). إجراءات لرصد مستويات البلازما من تسلب الإنسان وللتحقق من آثارها في الجسم الحي وظيفية على السكان الخلية استجابة استجابة خلوى.
وينبغي النظر في عدة عوامل في اختيار الخلايا اللحمية والنواقل التي سيتم استخدامها في البروتوكولات المقدمة هنا. يجب أن خطوط الخلايا اللحمية لا تنتج داخليا مستويات عالية من السيتوكين، ويجب أن لا تستجيب للسيتوكين من الفائدة. للدراسات هنا، تم اختيار خط خلايا انسجة العظم النخاعي البشري، هس-27A لأنه ينمو بقوة في الثقافة مع إنتاج السيتوكينات على مستوى منخفض. 8 الطريقة الموصوفة هنا تشمل أيضا "السيطرة" بدكس هندسيا مع نفس سدى كما تسلب + بدكس، ولكن دون أوفيركسريسيون من تسلب. مقارنات من النتائج في تسلب + والتحكم بدكس تسمح لنا للسيطرة على أي آثار بسبب الخلايا اللحمية الذاتية إنتاج السيتوكينات. نقل الخلايا اللحمية مع ناقلات التي تشمل البروتينات الفلورية أو غيرها من علامات اختيار يمكن أن تكون مفيدة لعزل الخلايا ثفي من المرجح أن أوفيركسريكس السيتوكين من الفائدة. ومع ذلك، فمن الضروري لفحص سايتوكين طاف لتحديد مستوى السيتوكين التي تنتجها الخلايا اللحمية لأن في مستويات الجسم الحي البلازما السيتوكين في الفئران ترتبط مع تركيز السيتوكين في طاف الخلايا اللحمية، 6 وكذلك عدد من سدى حقن على ( الشكل 4 ).
من المهم أن يتم التحقق من نشاط السيتوكين التي تنتجها سدى قبل دراسات بدكس. استخدمنا الفوسفو التدفق الخلوي لفحص الجزيئات فوسفهوريلاتد المصب من تسلب التحفيز في الخلايا التي تستجيب ل تسلب. تسلب ينشط مسارات جاك-STAT5 و PI3 / أكت / متور. خطوط الخلايا MUTZ5 و مه-CALL4 سرطان الدم تعبر عن مستويات عالية من مكونات مستقبلات تسلب وتظهر STAT5، أكت والبروتين الريباسي S6 فسفرة بعد تحفيز تسلب. 14 هنا استخدمنا فوفو التدفق الخلويلتقييم الفسفرة من STAT5 (pSTAT5) الناجم عن المصب من تحفيز تسلب. في العمل السابق قمنا بتقييم للأحداث فسفوريلاتيون تحفيز إضافية تسلب: فوسفهو-أكت (باكت) والبروتين الفوسفات الريباسي S6 (PS6، المصب من متور). وأظهرت النتائج أن فحص باكت أقل حساسية و PS6 أكثر حساسية من فحص PSTAT5. 6 عندما يتم إجراء فحوصات الفوسفو، ينبغي استزراع الخلايا استجابة مع مستويات التشبع من تسلب الإنسان المؤتلف كسيطرة إيجابية ومع وسائل الإعلام فقط (لا السيتوكين) كسيطرة سلبية. طاف من سدى السيطرة يجب أن يعاير جنبا إلى جنب أن من تسلب + سدى كوسيلة ثانية للتحقق (بالإضافة إلى إليسا) أن تسلب لا تنتج عن طريق سدى السيطرة. هذا أيضا بمثابة عنصر تحكم لضمان أن إنتاج السيتوكينات الذاتية ليست مسؤولة عن الفسفرة لوحظ في فحوصات تسلب + الخلايا. وينبغي أن يكون الفسفرة الناجم عن عينات سدى تنتج السيتوكين سيميلأر إلى أن نلاحظ مع حالة السيتوكين المؤتلف، على الرغم من أنه قد يكون أقل إذا كان تركيز السيتوكين في طاف أقل مما كانت عليه في التشبع، السيطرة الإيجابية. السيطرة الإيجابية مع مستويات تسلب المؤتلف التي تطابق المستويات التي لاحظتها إليسا ل تسلب + سدى هي بديل جيد.
تحديد المؤشرات الوظيفية المعروفة من النشاط في الجسم الحي خلوى يمكن أن يكون تحديا. قد لا يكون فوسفهوريلاتيون فحوصات ممكن لأن الفسفرة الناجم عن السيتوكين البشري خارجي في الجسم الحي يمكن أن تفقد بسرعة خلال حصاد الأنسجة. منذ وقد أظهرت تسلب لزيادة إنتاج السلائف الخلية B الإنسان، 23 تم التحقق من التأثير الوظيفي ل تسلب في بدكس عن طريق فحص لفي الجسم الحي الزيادات في السكان الخلية الخلية السل البشري باستخدام التدفق الخلوي إمونوفينوتيبينغ. يمكن أن تكون استراتيجية بديلة مقايسة للتغيرات التي يسببها السيتوكين محددة في التعبير الجيني و كومبارينغ في الخلايا التي تحصد من السيتوكين معربا عن بدكس للخلايا من السيطرة بدكس. 6
الهدف النهائي للتعبير سايتوكين الإنسان في بدكس هو توليد نموذج قبل السريرية التي نماذج أكثر عن قرب في الجسم الحي البيئة الموجودة في المرضى. تم اختبار هذا من خلال مقارنة التعبير الجينوم كله في الأنسجة البشرية معزولة عن بدكس السيطرة ومن السيتوكين معربا (تسلب +) بدكس لعينات المريض الأصلي. وأظهرت هذه الدراسات أن التعبير الجيني في عينات المرضى هو أقرب بكثير إلى خلايا سرطان الدم من تسلب + بدكس من الضوابط. 6 ومع ذلك، ركزت دراساتنا على الليمفاويات. وهناك عدد من السيتوكينات تعزيز النخاعي المنتجة في الماوس لا تفعيل نظرائهم مستقبلات الإنسان. هناك سيتوكين الفئران نوكين الإنسان (الفئران نسغس وغيرها) التي تعالج هذه المسألة. في الواقع، قيمة واحدة من نموذج وصفنا هنا هو أنه يمكن استخدامها في الفئران نسغ لإنشاء نموذج أكثر إغلاقإلي نماذج الإنسان في بيئة الجسم الحي من خلال التعبير عن تسلب بالإضافة إلى السيتوكينات البشرية النخاعية تعزيز. من ناحية أخرى، يمكن إنشاء نظام السيتوكين +/- في الفئران نسغ باستخدام الطريقة الموصوفة هنا لكل من هذه السيتوكينات تعزيز النخاعي. هذا النموذج يمكن أن تستخدم لدراسة دقيقة في الجسم الحي دور كل منهم في ميلوبويس و / أو سرطان الدم النخاعي.
بدكس المهندسة التي تنتج مستويات الفسيولوجية الإنسان تسلب يوفر نموذج قبل السريرية التي تحاكي عن كثب البيئة في الجسم الحي الموجودة في المرضى من بدكس الكلاسيكية. 4 كما وصفت إنتاج الفئران بدكس التحكم التي يتم هندستها بالمثل، كما هو موضح. معا السيطرة وخلق بدكس المنتجة للالخلايا إنشاء الإنسان نموذج تسلب +/- النظام الذي استخدمنا بنجاح لتقييم دور تسلب في إنتاج الجسم الحي من الخلايا B الطبيعية والخبيثة الإنسان. 4 ، 6 هذانموذج هو ذات الصلة للغاية لدراسات شكل معين من مخاطر عالية من B- خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (B-آل) التي تتميز التعديلات الجينية مما يؤدي إلى أوفيركسريسيون من CRLF2. CRLF2 هو مستقبلات لل سيتوكين تسلب وبالتالي تسلب التي يسببها CRLF2 يشير على الأرجح يسهم في تكوين الجين وتطور CRLF2 + B-آل. استخدام بدكس لدراسة هذا المرض هو أمر بالغ الأهمية خاصة لأن بدكس تسمح لنا لدراسة سرطان الدم في سياق المشهد الجيني للمريض. المشهد الجيني كمساهم مرض تورط بقوة في CRLF2 + B-آل، والذي يحدث خمسة أضعاف في كثير من الأحيان في الأطفال من أصل هسباني / لاتيني من غيرها، ويشكل نصف جميع الحالات B-آل في مرضى داون. نماذج بدكس تعبر عن تسلب الإنسان مثل واحد وصف هنا سيكون أداة هامة في تحديد العلاجات وفهم آليات المرض من CRLF2 + B-آل وكذلك لفهم تكون الدم الطبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
