Summary
Di seguito è descritto un metodo per produrre citochine esogene nei topi xenograft (PDX) derivanti dal paziente mediante iniezione intraperitoneale settimanale di una linea cellulare stromale trasfusa da citochine. Questo metodo amplia l'utilità di PDX e fornisce l'opzione per la consegna transiente o sostenuta della citochine esogena in una moltitudine di modelli PDX.
Abstract
I topi xenograft (PDX) derivati dal paziente vengono prodotti trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. Questi modelli sono uno strumento importante per studiare i meccanismi di ematuria normale e maligna e sono il gold standard per identificare le chemioterapie efficaci per molte malattie maligne. I modelli PDX sono possibili perché molte delle citochine del mouse agiscono anche sulle cellule umane. Tuttavia, questo non è il caso di tutte le citochine, tra cui molti che sono critici per lo studio di ematuria normale e maligna nelle cellule umane. Le tecniche che ingegneranno i topi per produrre citochine umane (modelli transgenici e knock-in) richiedono una significativa spesa prima che sia stata dimostrata l'utilità del modello. Altre tecniche sono labor intensive (iniezione di citochine ricombinanti o lentivirus) e in alcuni casi richiedono elevati livelli di competenza tecnica (iniezione idrodinamica del DNA). Questo rapporto descrive un metodo semplice per la generazione di topi PDX che presentano una via umana esogenaTokine (TSLP, linfopoietina stromale stromico) mediante iniezione intraperitoneale settimanale di stroma che sono state trasdotte per sovraespressione di questa citochina. L'uso di questo metodo fornisce una sorgente in vivo di produzione continua di citochine che raggiunge livelli fisiologici della citochina umana circolante nel topo. I livelli plasmatici della citochina umana possono essere variati in base al numero di cellule stromali iniettate e la produzione di citochine può essere avviata in qualsiasi punto dell'esperimento. Questo metodo comprende anche i topi di controllo negativo di citochine che sono prodotti analogamente, ma attraverso l'iniezione intraperitoneale di stroma trasfusa con un vettore di controllo. Abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule di leucemia raccolte da PDL che esprimono TSLP, rispetto al controllo PDX, presentano un modello di espressione genica più simile al campione originale del paziente. Insieme i topi PDX produttori e citochine-negativi prodotti da questo metodo forniscono un sistema di modello che abbiamo utilizzato con successo per studiareRuolo del TSLP in ematuria normale e maligna.
Introduction
I xenografts derivati da pazienti (PDX) sono un potente modello in vivo per studiare la produzione di cellule ematopoietiche normali e maligne in un ambiente mammifero nativo. Più spesso, PDX è prodotto produrre iniettando o trapiantando le cellule umane in topi immunitari deficienti. La produzione di PDX utilizzando normali cellule staminali ematopoietiche umane consente studi in vivo di sangue umano normale e sviluppo di cellule immunitarie. PDX prodotto da leucemia o da altre cellule tumorali consente di studiare meccanismi oncogeni e di identificare terapie efficaci nel contesto della gamma di paesaggi genetici e mutazioni presenti nella popolazione umana. 1 Di conseguenza, PDX è l'attuale standard oro per la ricerca biomedica di traduzioni per identificare terapie efficaci e un importante strumento per comprendere i meccanismi della progressione del cancro. I modelli PDX sono uno strumento essenziale per aiutare la ricerca sulle disparità di salute malattie dovute a specifiche Lesioni genetiche o qualsiasi malattia in cui le variazioni del paesaggio genetico di un paziente possano contribuire sostanzialmente all'operazione di oncogenesi e trattamento.
I modelli PDX del mouse-umano sono possibili perché molti citochine del mouse adeguatamente imitano i loro analoghi umani nell'attivare i recettori delle cellule umane mentre sono all'interno del mouse. Ad esempio, l'interleuchina-7 (IL-7) fornisce un segnale critico per lo sviluppo di cellule B umane. 2 In questo caso, il mouse IL-7 ha sufficiente omologia con l'umano IL-7 che la citocina del mouse stimola i percorsi di segnalazione nei precursori di cellule B umani. 2 , 3 , 4 Tuttavia, questo non è il caso del linfopoetina stromale tromico (TSLP), 5 , 6 che tra le altre citochine (IL-3, fattore stimolante colonia del granulocyte-macrofago (GM-CSF), fattore di cellule staminali (SCF) ,Ref "> 7 è importante per la produzione di cellule ematopoietiche umane normali e maligne Quando le citochine del mouse e dell'uomo mostrano una bassa omologia le citochine del mouse non attivano i rispettivi recettori sulle cellule umane Per superare questo ostacolo sono state utilizzate varie strategie Per progettare l'espressione di citochine umane nei topi PDX, tra cui l'iniezione di citochine umane ricombinanti, l'iniezione idrodinamica del DNA, l'espressione lentivirale, l'espressione transgenica e la sostituzione del gene knockin.7 Questo rapporto descrive un metodo per la progettazione di PDX per la produzione di citochina umana tramite stromal media Citochine ( Figura 1 ).
Nel metodo mostrato qui, i topi PDX sono progettati per esprimere la citocina umana, TSLP, o per servire come controlli negativi per la citochina. PDX che esprimono TSLP sono ottenute mediante iniezioni intraperitoneali settimanali di cellule stromali che sono state trasdotte per esprimere elevati livelli di TSLP umani.I topi di controllo "PDX" negativi per citochine sono costruiti similmente; Sebbene lo stroma di controllo venga trasduzione con un vettore di controllo. Questo metodo raggiunge i normali livelli fisiologici del TSLP umano in topi PDX iniettati con lo stroma TSLP +. Nessun TSLP rilevabile è osservato nei topi PDX che ricevono lo stroma citochina-negativo. Abbiamo scelto la linea cellulare HS-27A per i nostri studi, perché cresce robustamente in coltura e presenta un livello molto basso di produzione di citochine che non supporta la proliferazione di cellule progenitrici isolate nelle coculture. 8 Per l'espressione TSLP umana, lo stroma è stato trasdritto con un vettore lentivirale auto-inattivo di una generazione avanzata derivato da una spina dorsale precedentemente descritta 9 e comprende l'elemento cPPT / cts e l'elemento regolatore post-trascrizionale dell'epatite di legno (WPRE) per aumentare l'espressione di transgene. Il gene TSLP umano è stato costruito in questo vettore sotto il controllo del fattore di allungamento-1(EF-1) alfa promotore per ottenere un'espressione robusta, costitutiva e a lungo termine.
L'ingegnerizzazione di questo modello PDX migliorato per via umana-citochina è costituito da 4 fasi principali. Innanzitutto, lo stroma transdurato viene ampliato in vitro e valutato mediante un test immunosorbente enzimatico (ELISA) per una stabile produzione di citochine ad alto livello. In secondo luogo, l'attività della citochina umana prodotta dalle cellule stromali trasdurate (e la mancanza di attività di citochine da uno stroma di controllo) viene verificata usando citometria a fosfo-flusso. Le linee cellulari note per essere sensibili alla citochina di interesse (in questo caso, TSLP) vengono incubate con il surnatante di cellule stromali e sono state analizzate per la fosforilazione indotta da citocina. In terzo luogo, i topi vengono iniettati con lo stroma umano trasduttore e poi il plasma del topo viene valutato mediante ELISA per livelli di citochina umana su base settimanale. Quarta, le cellule ematopoietiche umane vengono trapiantate e gli effetti funzionali in vivo della citochina umana vengono valutati su un bersaglio noto ( La consegna della citochina umana tramite cellule stromali offre vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi di erogazione / produzione di citochine umane nei topi PDX. 7 Rispetto all'iniezione della citochina umana ricombinante, la somministrazione di stroma-mediata è generalmente meno costosa (il costo della coltura cellulare stromale è minore del costo della citochina ricombinante) e meno intensivo di lavoro (una iniezione a settimana rispetto a più iniezioni a settimana). Anche il problema della breve emivita di citochine è mitigato dal momento che lo stroma produce continuamente la citochina esogena. La somministrazione di citochina tramite iniezione idrodinamica del DNA può essere meno costosa della consegna tramite lo stroma. Tuttavia, è allo stesso modo transitorio e può richiedere più abilità tecnica rispetto alla semplice iniezione intraperitoneale settimanale richiesta per la somministrazione di stroma-mediata. L'espressione genica lentivirale nel topo può fornire una traccia minoreMetodo nsient di consegna della citochine; Tuttavia, nelle nostre mani non sono stati raggiunti livelli fisiologici di TSLP. Inoltre, questo metodo è intenso per il lavoro, che richiede la produzione continua di vettore lentivirale. I topi transgenici o knock-in offrono una stabile espressione a lungo termine della citochina e possono essere progettati per un'espressione specifica del tessuto, che può essere un vantaggio. D'altra parte, l'espressione transgenica del gene citocinico umano sullo sfondo del mouse immunitario deficiente richiesto per i topi PDX richiede un investimento immenso di risorse prima che il valore del modello sia stato stabilito. Inoltre, i modelli transgenici in genere non consentono l'opzione di variare la tempistica dell'iniziazione della citochina o del livello della produzione di citochine in vivo . Questi possono essere ottenuti con consegna mediata da stroma semplicemente cambiando il punto di tempo per l'inizio dell'iniezione di cellule stromali o la dose di cellule stromali iniettate. Metodo di somministrazione della citocina mediata dalle cellule stromaliOd dettagliata qui è stata usata per sviluppare PDX per valutare il ruolo di TSLP nello sviluppo normale delle cellule B umane 4 e 6 e nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B ad alto rischio. 6 Questo metodo fornisce un metodo alternativo di somministrazione della citocina per l'impiego nella generazione di modelli simili con citochine umane diverse da TSLP. Questo modello può anche essere utile per la generazione di dati preliminari che possano aiutare a determinare se il valore di un modello PDX di tipo cromosomico o citochinico per citochine sarebbe degno dell'investimento sostanziale del tempo e del denaro. 
Figura 1: Modello PDX progettato per produrre citochina umana esogena nei topi. ( 1A ) Eseguire esperimenti di progettazione e ottenere cellule stromali umane trasdurate ( 1B ) Ottenere cellule umane (cellule staminali ematopoietiche, cellule di leucemia, ecc .) Per generare PDX (topi derivanti da xenograft). ( 2A ) Iniettare lo stroma progettato e ( 2B ) trapianto di cellule umane in topi immuni deficienti secondo il programma sperimentale. ( 3A-B ) Monitorare le concentrazioni di citochine nel supernatante dello stroma e nel plasma del topo mediante ELISA. ( 4 ) Raccogliere le cellule umane e valutare gli effetti funzionali in vivo della citochina umana presente nel PDX. Per favore clicca quiPer visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Gli studi sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e dal consiglio d'amministrazione istituzionale di Loma Linda (IRB) e secondo tutte le linee guida federali.
ATTENZIONE: PDX e tessuti umani devono essere trattati secondo procedure di sicurezza per evitare la trasmissione di patogeni derivanti dal sangue.
1. La cultura e l'espansione delle cellule stromali transdestinate da citochine
NOTA: Ogni volta che il stroma viene passato, raccogliere il supernatante della coltura (aliquota 1 mL) e conservare a -80 ° C per la quantificazione futura del livello della citocina mediante il dosaggio ELISA.
- Preparare il mezzo di coltura R10 e il mezzo di congelamento come descritto nella Tabella dei Materiali.
- Generare 10 , 11 o ottenere lo stroma di controllo (trasduttore con vettore vuoto) e lo stroma della produzione di citochine (TSLP +)."> 6 Conservare in azoto liquido (LN 2 ) fino all'uso.Puotare le cellule stromali come descritto 12 e placcarle in 5 ml di mezzo R10 in bolle separate per la coltura T-25. Cellule di coltura in un incubatore a 37 ° C con il 5% CO 2. Questo è il post-scongelamento "passaggio # 1".
- Una volta che lo stroma è confluente (24-48 h), le cellule di passaggio da trypsinizzazione utilizzando 1 × triptofina EDTA (0,25%) e ri-placcatura in una tazza di coltura T-150. Questo è il post-scongelamento "passaggio # 2".
- Quando lo stroma raggiunge confluenza nelle tazze T-150 (3-4 giorni più tardi), passaggio le cellule da trypsinizzare. Utilizzare questa sospensione cellulare per esigenze sperimentali.
- Espansione cellulare a più fiaschi
- Distribuire le cellule raccolte tra tre tazze T-150 e la cultura fino a confluire. Ripetere questo passaggio se è necessaria un'espansione dello stroma. Il numero di cellule stromali umane (HS-27A) a confluenza in un pallone T-150 è di ~ 5 x 10 6 .
- Cellula sessa in riserva
- Trasferire la sospensione delle cellule raccolte in un tubo conico e centrifugare a 500 xg per 5 minuti, decantare il surnatante e risospendere le cellule in mezzo di congelamento. Bloccare e conservare in LN 2 ~ 1.5 x 10 6 cellule per flaconcino.
- Per le iniezioni di stroma intra-periotoneale nei topi, procedere al punto 4.1.
- Espansione cellulare a più fiaschi
2. Saggi ELISA per monitorare la produzione di citochine in vitro da Stromo transdetto
- Acquistare un kit di analisi ELISA commercialmente disponibile per rilevare la citochina di interesse.
- Sostituire il supernatante di cellule stromali dal controllo e la stroma prodotta da citochine (TSLP +) raccolti nei passaggi primi, medi e tardivi ( Figura 2 ).
- Determinare la concentrazione di TSLP nei campioni di supernatante usando un kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. 13 Compilare questi dati seriali per monitorare la stabilità della produzione di citochine durante il coltura cellulare E ( Figura 2A-B ).
- Identificare e scartare lo stroma produttivo di citochine con espressione citochina ridotta o non ottimale, nonché qualsiasi fiale corrispondente in deposito ( Figura 2A-B ).
- Identificare e mantenere stroma produttrice di citochine che dimostrano concentrazioni stabili e elevate di citochine. Usare queste sbavature per esperimenti.
- Utilizzare il kit ELISA per monitorare periodicamente lo stroma per tutta la durata della coltura cellulare (almeno una volta durante i passaggi di post-scongelamento iniziali, medi e tardi) per garantire una produzione stabile della citocina o, nel caso dello stroma di controllo, l'assenza di produzione di citochine .
3. Analisi della citometria di fosforo per valutare l'attività della citochina prodotta da Stroma
NOTA: Valutare il surnatante da uno stroma progettato prima del primo esperimento per verificare la pertinente bioattività della citochina generata da stroma per un singolo esperimento.Ef "> 6 Una volta che il stroma progettato è convalidato, ulteriori test non è necessario a meno che non venga introdotto lo stroma che è stato prodotto con un nuovo vettore.
- Acquistare linee cellulari di leucemia MUTZ5 e / o MHH-CALL4 (TSLP reattive), 14 citochine umane ricombinanti e anticorpi approvati per l'impiego in saggi di citometria a flusso fosforico per rilevare appropriati obiettivi di fosforilazione a valle.
- Sciogliere il supernatante raccolto dal controllo dello stroma esprimente la citochina.
- Piattare le linee delle cellule di leucemia nel mezzo R20 (vedere tabella dei materiali ) ad una concentrazione di 0,2 x 10 6 cellule per pozzetto in una piastra di coltura da tessuto da 96 pozzetti. Piatti 3 pozzetti per condizione per consentire i dosaggi triplicati. Incubare per 2 ore a 37 ° C. Questa volta consente la perdita di qualsiasi fosforilazione che si è verificata durante le condizioni di coltura precedenti.
NOTA: 12 pozzetti per linea cellulare forniscono i dosaggi triplicati per ogni condizione sperimentale mostrata nel passaggio 3.4. <Dopo 2 ore di coltura, trasferire le cellule da ogni pozzetto per separare i tubi da 4 mL e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Decanta il sovranatante. - Riposizionare le cellule in 200 μl per ciascuna delle seguenti condizioni sperimentali (eseguire i dosaggi in triplice copertura): 1) solo mezzo di controllo negativo, 2) supporto di controllo positivo con citochina ricombinante a concentrazioni saturanti (TSLP a 15 ng / Ml, ecc .), 3) controllo dello stroma-supernatante da stroma di controllo, e 4) supernatante citochina-stroma da stroma produttrice di citochine.
- Incubare le cellule per la durata specificata da specifici fosfomi commerciali ( es. 30 min per fosfo-STAT5 in MUTZ5 o MHH-CALL4 in risposta a TSLP).
- Centrifugare a 500 xg per 5 min a 4 ° C e decantare il surnatante.
- Eseguire la colorazione della citometria a flusso fosforico per protocollo del produttore e raccogliere dati di citometria a flusso. 15
- Porta su cellule intatte basate su avanzamento (FSC, indica la dimensione cellulare) e lato (SSC, indica granularità cellulare) scatter luce.
- Determinare l'intensità fluorescente media (MFI) delle cellule intatte in ciascun campione. Confronta l'MPI media ottenuta dai valori triplicati del supernatante di cellule stromali a quella dei controlli medi e positivi negativi.
4. Iniezione di stroma transdestinata da citochine nei topi
NOTA: Lo stroma della cultura HS-27A per un minimo di 3 passaggi post-scongelamento prima di iniettarli in topi per garantire le cellule sane e un'adeguata produzione di citochine.
- Preparazione dello stroma
- Trasferire la sospensione delle cellule stromali raccolte in un tubo conico e una aliquota di 10 μL per il conteggio dell'emocitometro; Ottenere il numero di cellule vive usando tripan blu. 16 Centrifugare il ce rimanenteLl sospensione a 500 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante dalle cellule pelletate e riposizionare delicatamente le cellule nel volume necessario di salina fosfata tamponata sterile (PBS) per l'iniezione del mouse (a seconda del numero di topi da iniettare).
NOTA Concentrazione tipica di cellule stromali per l'iniezione del mouse: 0,5 x 10 6 -5 x 106 cellule per mouse in 200 μl di PBS. - Tenere la sospensione della cellula stromale a 4 ° C (o in ghiaccio) fino immediatamente prima dell'iniezione. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia almeno a temperatura ambiente (~ 25 ° C) per l'iniezione dei topi.
- Iniezione di cellule Stromal
- Disinfettare la cappa di bio-sicurezza, assemblare i materiali per le iniezioni e quindi posizionare la gabbia del mouse all'interno.
- Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per inversione prima di preparare 200 μL in una siringa tubercolina.
- Utilizzando tecniche standard di iniezione intra-peritoneale, 17Frenare il topo e somministrare la sospensione cellulare di 200 μl nella cavità peritoneale. Dettagli sono stati precedentemente dimostrati da Machholz et al. 18
5. Sorveglianza di serie e monitoraggio del plasma per la citochina umana esogena nei topi
- Raccolta del sangue attraverso il taglio della coda
- Disinfettare il cappuccio di biosicurezza e assemblare il dispositivo di ritenzione del topo, forbici e altri attrezzi / forniture per la procedura.
- Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenzione e fissare il tubo per minimizzare il movimento del mouse.
- Disinfettare la coda e le forbici chirurgiche con alcool isopropilico. Applicare la crema anestetica topica sulla coda.
- Utilizzando forbici chirurgiche molto taglienti tagliate fuori circa 0,5-1 mm della punta della coda del mouse. Raccogliere circa 80 μL di sangue periferico usando tubi capillari eparinizzati.
NOTA: Se il sangue verrà raccolto con questo metodo più di sei tiMes, la rimozione della coda dovrebbe essere conservatrice rispetto alla quantità di coda rimossa. Mentre gli snips avanzano nella coda, il diametro aumenta, emorragia più velocemente e la guarigione richiede più tempo.
- Separazione del plasma
- Trasferire il sangue usando una siringa a bulbo (per espellerla dai tubi capillari) in un tubo a microelemento K 2 EDTA etichettato; Invertire 20 volte per prevenire la coagulazione.
NOTA: generalmente la coagulazione del sangue dalla coda della coda è veloce. Tuttavia, se la emorragia persiste per più di ~ 2 minuti usa una matita / polvere di stitichezza per aiutare la coagulazione. - Centrifugare i tubi di raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore e allontanare il plasma per lo stoccaggio (-20 ° C) fino a quando è pronto per il test ELISA.
- Se i dati del cimerismo di cellule umani e umani sono necessari dal sangue del mouse, quindi trattare il pellet rimanente come descritto nella fase 6.3.1. Altrimenti, scartare il pellet di cellule del sangue.
- Trasferire il sangue usando una siringa a bulbo (per espellerla dai tubi capillari) in un tubo a microelemento K 2 EDTA etichettato; Invertire 20 volte per prevenire la coagulazione.
- ELISA modificata per micro-volUmie del plasma del topo
NOTA: La procedura ELISA del produttore è stata modificata dal volume di campione raccomandato da 100 μL a un volume di 40 μL per accogliere i micro-volumi raccolti dai topi. Non è possibile eseguire campioni di plasma al plasma in vivo in triplice con questi volumi limitati. Alla fine dell'esperimento vengono raccolti ~ 500 μL di sangue post-mortem mediante puntura cardiaca. Le concentrazioni di citochine valutate in 100 μL di plasma di eutanasia vengono utilizzate per convalidare i dati in vivo di 40 μL per ogni topo.- Eseguire campioni di plasma congelati.
- Diluire seriamente le norme ELISA e piattarle in tripple a 40 μL per pozzetto.
- Aggiungere 40 μL di ogni campione di plasma del mouse alla piastra ELISA.
NOTA: Se un campione del mouse è inferiore a 40 μL, portare il volume fino a 40 μL con il buffer ELISA. Registrare questo volume diluente e utilizzarlo per calcolare un fattore di diluizione per ciascun campione diluito. quandoL'analisi dei dati ELISA moltiplica la concentrazione del campione diluito per il fattore di diluizione del campione per determinare la reale concentrazione di citochina nel campione originale. - Completare il dosaggio ELISA secondo le istruzioni del produttore.
6. Trapianto di cellule ematopoietiche nei topi
- Irradiazione subletale per la cura del midollo osseo per il trapianto
NOTA: L'Università Loma Linda (LLU) utilizza una sorgente di radiazioni Cobalt-60. Gli animali sono collocati in un contenitore a torta, posizionato a 80 cm dalla sorgente di radiazione in un campo di 20 x 20 cm e con uno strato di Lexan di 0,5 cm in cima al restriente. Il tempo di esposizione è calcolato per raggiungere una dose di 225 cGy basata sulla più recente calibrazione della sorgente (attualmente 2-3 min per questa sorgente).- I topi irradiati sotto letale (dose totale di irradiazione del corpo di 225 cGy massimo per topi immunitari deficienti).
- Le cellule ematopoietiche del trapianto ~ 24 h più tardi tramite </ Em> iniezione endovenosa per via endovenosa.
- Trapianto di cellule ematopoietiche intra-venose
- Preparare le sospensioni di cellule umane per il trapianto in un volume di 200 μl di PBS sterile per mouse: CD34 + cellule staminali ematopoietiche (HSC): 1 x 10 5 a 5 x 10 5 cellule per le cellule di leucemia e del mouse e campioni di pazienti: 1 x 10 6 a 5 x 10 6 cellule per mouse.
- Tenere le cellule a 4 ° C (trasporto su ghiaccio) fino a subito prima del trapianto. Assicurarsi che le cellule siano almeno a RT prima del trapianto.
- Disinfettare la cappa di bio-sicurezza e preparare l'area del cappuccio per le iniezioni di trapianto.
- Posizionare il mouse nella gabbia di riscaldamento per almeno 5 minuti per consentire la dilatazione delle vene della coda.
- Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e prelevare 200 μL in una siringa tubercolina. Posizionare l'ago in modo sicuro dove rimarrà sterile.
- Posizionare il mouse in un contenitore e disinfettare la coda con alcool isopropilico/ Li>
- Utilizzando tecniche standard di iniezione endovenosa, 17 iniettare la sospensione delle cellule umane in vena della coda del topo.
NOTA: Le iniezioni delle vene di coda possono richiedere diversi tentativi, in particolare per un gestore animale novizio. Kovacscics e il video Joaver 19 di Raper fornisce una dimostrazione dettagliata di questa tecnica animale. - Monitoraggio del recupero del mouse per ~ 5 min. Registrare eventuali eventi avversi durante l'iniezione ( ad es. Le cellule versate, la grave emorragia, il trauma eccessivo della coda).
- Analisi del cimerismo delle cellule umane nel sangue periferico del mouse
- Ottieni il pellet di cellule del sangue che rimane nel tubo del microtainer dopo la separazione del plasma (punto 5.2.3).
- Per la lisi di globuli rossi (RBC), risospendere il pellet di sangue restante in un volume di PBS pari al plasma rimosso (per sostituire il volume del plasma) e mescolare bene (vortex / pipetta).
- Trasferire ogni campione di sangue sospeso in un tubo di 4 ml etichettatoE quindi aggiungere un tampone di lisi RBC a ciascun tubo in un rapporto 1: 9 (900 μl di tampone di lisi RBC per 100 μL di sospensione sospesa). Incubare per 5 minuti a RT. Centrifugare (5 min, 500 xg) e decanta.
- Eseguire l'incubazione secondo buffer del lysis di RBC (5 min a RT). Centrifugare e decantare come prima.
- Lavare le altre cellule in ~ 1 mL di PBS. Centrifugare e decantare come prima.
- Riposizionare il pellet in un volume di PBS appropriato per la colorazione standard di citometria a flusso (questo varia a seconda del produttore e dei singoli protocolli di laboratorio). Utilizzare gli anticorpi immunofenotipo convalidati per il cyotmeter di flusso per identificare le cellule del mouse (mouse CD45 +) e le cellule umane (umano CD45 +) 6 , 21 Così come ulteriori marcatori di leucociti umani specifici del linfatico cellulare di interesse.
NOTA: Si raccomanda di prendere un piccolo volume (5 μL-20 μL) da ciascun campione del mouse per creare "campioni aggregati"; Da utilizzare per i campioni di controllo non conservati, di redditività ed isotipi. È pratica migliore avere controlli non conservati e isotipo per ogni condizione sperimentale.
7. Valutazione funzionale dell'attività in vivo di citochine
- Eutanasia del mouse e raccolta dei tessuti
- Eutanizzare i topi attraverso l'asfissia del CO 2 nel punto sperimentale designato.
- Raccogliere il sangue attraverso la puntura cardiaca e raccogliere il plasma come nei passaggi 5.2.1-5.2.2.
NOTA: raccogliere il sangue prima di altri tessuti perché inizia a coagulare immediatamente dopo la morte. - Processare il sangue del mouse, l'aliquota e memorizzare il plasma come nel punto 5.2.2.
- In un secondo momento, valutare la concentrazione di citochine esogena nel plasma ottenuto in eutanasia tramite ELISA secondo il protocollo del produttore. Valutare e confrontare le concentrazioni di citochine esogene nel plasma del topo dalla serie in vivoLa raccolta del sangue ei campioni di plasma di eutanasia (descritti nel paragrafo 5.3).
- Aggiungere PBS al residuo campione di sangue per sostituire il volume e il processo del plasma come descritto nei passaggi 6.3.1 e 6.3.2. Effettuare immediatamente i test di citometria a flusso o risospendere le cellule in mezzo di congelamento per lo stoccaggio LN 2 .
- Raccogliere midollo osseo (BM) e milza da topi PDX e preparare sospensioni singole cellule come precedentemente descritto. 22
- Ottieni i conteggi di cellule per ogni campione di tessuto del mouse PDX utilizzando l'acido acetico del 3% con blu metilene (membrane delle cellule di lisi e RBC lasciando nuclei intatti di cellule viventi) in una diluizione 1: 1 e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Tabulare il numero totale di cellule per i campioni di midollo osseo e milza per ciascun animale.
- Centrifugare le cellule (500 xg, 15 min) e decantare il surnatante. Eseguire test di flusso-citometria di midollo osseo e / o cellule della milza immediatamente o riposizionare in mezzo di congelamento per LN <Sub> 2 stoccaggio.
NOTA: congelare 10 aliquote BM (per i prossimi dosaggi biochimici) e ~ 5 aliquote della milza (per i futuri trapianti PDX) per mouse. - Immunofenotipizzazione per identificare effetti funzionali in vivo
- Preparare un master-mix (MM) di anticorpi di citometria a flusso di immunopenotipo popolazione popolazione ematopoietica responsabile alla citochina di interesse e un secondo MM degli anticorpi di controllo isotipo ( Figura 5 e Tabella dei Materiali).
- Aliquote del tessuto PDX di scavo (bagno di perle di 37 ° C) preparato al punto 7.4.
- Lavare le cellule scongelate trasferendole in un tubo conico e aggiungendo almeno 3 volte il volume di PBS. Centrifugare (500 xg, 5 min) e decantare il surnatante.
- Ripetere il passo di lavaggio (7.5.3).
- Creare aliquote poolate prendendo ~ 10 μL-20 μL di ciascun campione PDX per il controllo non conservato, il controllo della vitalità e i controlli isotipici (vedere la nota 6.4.6). Macchiare tutti i campioni, tranne l'uControllato con un colorante di vitabilità fisso (marcatore a cellule morte), incubare e lavare secondo il protocollo del produttore.
- Macchiare ogni campione di cellule PDX con fenotipizzazione-MM secondo il protocollo standard di colorazione della citometria a flusso; Allo stesso modo macchiare i campioni di controllo isotipo poolato con l'isotipo-MM. Incubare tutti i campioni, lavare con PBS e fissare i campioni ri-sospendere in 1% di paraformaldeide.
- Raccogliere i dati della citometria a flusso e analizzare i dati utilizzando una strategia di gating appropriata per le popolazioni di cellule interessate ( Figura 5 ). Un cancello tipico è il seguente:
- Definire le celle intatte tracciando una porta FSC e SSC che esclude i detriti.
- Identificare la popolazione delle cellule viventi gating sulle cellule che sono negativi per il marker di cellule morte (questa è la "cellula vivente totale").
- Utilizzare sottocanne all'interno delle "cellule viventi totali" per definire le popolazioni cellulari con l'immunofenotipo desiderato (vedere la Figura 5).
- Ottenere ilFrequenza delle popolazioni di cellule sub-cellule entro il numero totale di cellule viventi dall'analisi della citometria a flusso. 6 , 21
- Calcolare il numero di cellule bersaglio in ciascun tessuto moltiplicando la frequenza del sottoinsieme di cellule B entro le cellule viventi totali (ottenute nel passaggio 7.5.6.4) dai conteggi totali di cellule vive per tessuto ottenuto nel passaggio 7.3 (sottoinsieme di cellule% B " Conteggio delle cellule emocitometriche ", vedi tabella 1 )
- Confronti i conteggi delle cellule delle popolazioni di cellule target tra topi PDX e topi PDX esprimenti citocina (TSLP +) per determinare gli effetti funzionali in vivo della citochina umana esogena ( Tabella 1 ).
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Representative Results
Una panoramica del modello è mostrata in Figura 1 . Una volta ottenuti la produzione di citochine (TSLP + stroma) e lo stroma di controllo, vengono ampliati nella coltura. Prima dell'iniezione di stroma nei topi, il supernatante di cellule stromali viene valutato mediante ELISA per verificare la produzione di citochine ( Figura 2 ) e la citometria a fosfocondensazione (protocollo n. 3) per verificare l'attività della citochina prodotta dallo stroma. Il sopranatante viene raccolto da colture di cellule stromali confluenti (stroma di controllo e stroma TSLP + +) quando le cellule sono passate. ELISA è usato per monitorare la concentrazione di TSLP nel supernatante almeno una volta durante i passaggi primi, medi e tardi. I dati rappresentativi dello stroma di controllo sono mostrati in Figura 2A . Controllare le colture di cellule stromali che mostrano l'espressione di TSLP (e qualsiasi flaconcino congelato da esse). Le culture di controllo con TSLP non rilevabili vengono espanse e congelate per un futuro utilizzo.Come mostrato nella figura 2B, vengono eliminate le colture di TSLP + stroma che mostrano una produzione TSLP a basso livello (e flaconi congelati da essi). TSLP + stroma che mostra stabile produzione ad alto livello della citocina sono selezionati per l'espansione e l'immagazzinaggio per l'uso in futuri esperimenti. I livelli medi di TSLP nel supernatante da diverse colture di controllo e di TSLP + stroma sono mostrati in Figura 2C .
La timeline sperimentale per la produzione di topi PDX di controllo con la citocina umana è mostrata in Figura 3 . Le colture di cellule stromali sono iniziate 3 settimane prima del trapianto e il saggio ELISA della produzione di TSLP in vitro nel supernatante di coltura viene eseguito come descritto nella figura 2. Il TSLP umano in vivo nel plasma del mouse viene monitorato settimanalmente ( Figura 4 ) usando "ELISA modificata per Micro-volumi di plasma del topo "descritti nel protocollo n. 4. PeripheraIl sangue viene raccolto contemporaneamente al plasma e viene analizzato come descritto nel protocollo n. 6 sotto "Analisi del cimerismo delle cellule umane nel sangue periferico del mouse". PDX iniettato con lo stroma di controllo ha costantemente mostrato livelli plasmatici di TSLP umani che sono al di sotto della soglia di rilevamento ( Figura 4A ). Il livello plasmatico di TSLP in topi PDX iniettati con TSLP + stroma è proporzionale al numero di cellule stromali TSLP + iniettate durante le 1-2 settimane precedenti. I livelli plasmatici di TSLP cadono rapidamente se le iniezioni di cellule stromali vengono sospese. 6 Come visto nella figura 4B , le iniezioni settimanali di 0,5 x 10 6 TSLP + stroma (producendo in media> 1.000 pg / mL di TSLP nel supernatante di coltura) hanno dato livelli plasmatici TSLP vicino al limite inferiore dei livelli fisiologici (~ 5-10 pg / ml ). L'iniezione settimanale di 5 x 10 6 TSLP + stroma nei topi PDX ha determinato livelli plasmatici di TSLP che raggiungono livelli elevati fisiologici (~ 35 pg / ml) come mostrato in
È stato dimostrato che TSLP aumenta la produzione di normali precursori umani di cellule B. 23 Pertanto, per valutare la funzione in vivo di TSLP abbiamo confrontato il prodotto Ioni di precursori umani normali umani B nel controllo e topi TSLP + PDX trapiantati con cellule staminali ematopoietiche come mostrato nella Figura 5 e nella Tabella 1 . La figura 5A mostra la guarnizione di citometria a flusso per immunofeneotipizzazione utilizzata per identificare sottogruppi di cellule di origine umana B. I calcoli di esempio per l'enumerazione del numero di celle in ogni sottoinsieme per un controllo PDX e un TSLP + PDX sono mostrati nella tabella 1 . Come mostrato nella Figura 5B, le cellule di derivazione B sono significativamente aumentate in TSLP + rispetto al controllo PDX e questo aumento inizia con i primi precursori delle cellule B (cellule pro-B). Il numero di celle di derivazione non B non era significativamente diverso tra controllo e TSLP + PDX (dati non mostrati). Questo esame fornisce un modo per verificare che il TSLP umano prodotto in vivo in TSLP + PDX eserciti effetti funzionali in vivo su una popolazione di cellule target.
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Figura 2: ELISA per monitorare le concentrazioni di cytokine TSLP in Stroma Supernatant. I test ELISA sono stati usati per misurare le concentrazioni di TSLP nel supernatante da uno stroma di controllo (trasdetto con il vettore di controllo) e TSLP + stroma (trasduzione per esprimere TSLP umano) almeno una volta durante i seguenti passaggi: primi (passaggio 1-5) 6-12) e in ritardo (passaggi 13-20). La soglia di rilevazione per il test umano TSLP ELISA utilizzato qui è 1,9 pg / mL (linea rossa tratteggiata). ( A ) Lo stroma di controllo produce concentrazioni TSLP umane minimamente rilevabili; Questi livelli sono generalmente al di sotto della soglia di rilevazione ELISA per la durata dell'esperimento. Lo stroma di controllo in coltura che mostra concentrazioni crescenti di TSLP (> 15 pg / mL) viene scartato insieme a tutte le aliquote congelate da quella coltura. ( B ) La produzione di TSLP umana varia tra le culture generate da differenT flaconi scongelati di TSLP + stroma ( n = 9) e per tutto il periodo di coltura. Lo stroma TSLP che mostra la diminuzione o la produzione di citochine instabile (TSLP <1.000 pg / mL) sono anche scartati. ( C ) Le concentrazioni TSLP medio per lo stroma di controllo (verde) e TSLP + (blu) (mezzi e intervalli di confidenza del 95%). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Timeline sperimentale per la generazione di topi PDX con produzione di citochine umana esogena. Le parti in vitro e in vivo dell'esperimento procedono contemporaneamente. La coltura delle cellule di stroma di controllo e + TSLP viene avviata 2-3 settimane prima del trapianto di cellule ematopoietiche, che assicura un minimo di 3 passaggi di cellule prima della prima (aWk -1) delle iniezioni settimanali di cellule stromali. Ciò assicura che le cellule stromali siano sane, proliferative e producendo livelli adeguati di citochine. Le aliquote supernantane vengono raccolte quando le cellule sono passate ei saggi ELISA vengono utilizzati per determinare la concentrazione di TSLP (vedi figura 2 ) nel supernatante dello stroma. Gli animali vengono irradiati al giorno 0, un giorno prima del trapianto di cellule ematopoietiche umane il giorno 1. La raccolta di sangue settimanale inizia da 1 a 2 settimane dopo le prime iniezioni di stroma. A questo punto, le concentrazioni di citochine umane esogene dovrebbero essere rilevabili nel plasma del topo usando i test ELISA modificati ( Figura 4 ). L'endpoint dell'esperimento è di 5-16 settimane dopo il trapianto di cellule umane; Questo dipende dalla quantità di cimerismo delle cellule umane rilevate nel sangue periferico del mouse. L'ematopoiesi normale è generalmente ben consolidata dalla settimana 5-7, il cimerismo delle cellule di leucemia varia tra le linee cellulari ei campioni primari (3-16 settimane). Dipende anche il successo e la progressione del trapianto PDXSul numero di cellule umane iniettate al trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Raggiungere le concentrazioni citochine umane TSLP fisiologiche nel plasma del topo. I topi ricevono iniezioni intraperitoneali settimanali (200 μL) di cellule trasdotte e il loro plasma viene raccolto per valutare in vivo le concentrazioni di TSLP umane (saggio ELISA) in vivo nei topi nel tempo. I topi " Control" hanno ricevuto 5 x 10 cellule di stroma di controllo, mentre i topi "TSLP + low" (bassi TSLP stroma dose) hanno ricevuto 0,5 x 106 cellule di stroma TSLP + e "TSLP + high" (alta dose di stroma TSLP) ricevuto 5 x 10 6 cellule stromali TSLP + ogni settimana. Il test umano TSLP ELISA La soglia di rilevazione è 1,9 pg / mL (linea rossa tratteggiata) e la gamma fisiologica umana di TSLP è di ~ 5 a 35 pg / mL (ombreggiatura grigia). 24 ) ( A ) Il plasma del mouse "Control" ha costantemente livelli TSLP <5 pg / mL o inferiore alla soglia di rilevazione ELISA. ( B ) Il plasma del topo "TSLP + basso" mostra bassi livelli fisiologici di TSLP; Mentre ( C ) "plasma TSLP + high" del mouse mostra livelli elevati fisiologici. ( D ) Le concentrazioni TSLP medie per ogni gruppo sperimentale (media ± SEM di tutti i topi e timepoints) mostrano che i livelli di TSLP rilevati nel plasma del topo sono proporzionali alla dose di stroma ricevuta; I livelli plasmatici del mouse del controllo sono inferiori alla soglia di rilevazione ELISA ei livelli plasmatici "TSLP + high" sono quattro volte più elevati dei livelli plasmatici del mouse "TSLP + low"."> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi delle popolazioni normali di cellule umane B Convalida gli effetti funzionali di TSLP umano esogeno nei topi PDX. I topi PDX sono stati progettati con controllo e TSLP + stroma e trapiantati con cellule CD34 + umane isolate dal sangue del cordone ombelicale. L'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso è stata utilizzata per identificare sottoinsiemi di precursori di cellule umani B nel midollo osseo raccolto dal controllo e da TSLP + PDX come segue: il midollo osseo raccolto è stato scongelato e macchiato con colorante di vitabilità fisso e colorato per la citometria a flusso per rilevare anti- CD45 umani, CD19, CD34, κ & λ catena leggera, e IgD sia IgD sia IgM o IgM intracellulari (cμ). ( A ) Vita totale celSono stati eseguiti ganci basati su un marcatore di redditività. Le successive tracce mostrano i cancelli successivi per identificare i sottosettori di lineage B sequenzialmente sviluppati (i dati mostrati sono da TSLP + PDX). ( B ) La frequenza di ciascun sottoinsieme all'interno delle cellule viventi totali è stata determinata mediante software di citometria a flusso e sono stati calcolati numeri di cellule in ciascun sottoinsieme di cellule B. (Vedi tabella 1). I conteggi delle cellule per ogni sottoinsieme di cellule B nel controllo (nero, n = 3) e TSLP + (blu, n = 5) PDX vengono sottoposti a grafica. (Media ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Popolazione delle cellule umane | Freq. Delle cellule viventi totali | Vivere Cell Count iN BM | # Cellule in popolazione |
| Mouse di controllo | |||
| Cellule viventi totali | 100,00% | 39,5 x 10 6 | 39,5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98,50% | 39,5 x 10 6 | 38,9 x 10 6 |
| Totale CD19 + | 27.20% | 39,5 x 10 6 | 10,7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39,5 x 10 6 | 9,56 x 10 6 |
| Pre-B | 1,70% | 39,5 x 10 6 | 0,68 x 10 6 |
| Immature B | 0,83% | 39,5 x 10 6 | 0,33X 10 6 |
| Mature B | 0,68% | 39,5 x 10 6 | 0,27 x 10 6 |
| TSLP + Mouse | |||
| Cellule viventi totali | 100,00% | 72,0 x 10 6 | 72,0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99.30% | 72,0 x 10 6 | 71,5 x 10 6 |
| Totale CD19 + | 65.10% | 72,0 x 10 6 | 46,8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72,0 x 10 6 | 43,3 x 10 6 |
| Pre-B | 2,70% | 72,0 x 10 6 | 1,92 x 10 6 |
| Immature B | 1,60% | 72,0 x 10 6 | 0,11 x 10 6 |
| Mature B | 0,40% | 72,0 x 10 6 | 0,29 x 10 6 |
Tabella 1: frequenza e conteggi di sottili cellule B umane normali nel midollo osseo PDX. La frequenza (%) di ogni sottoinsieme di cellule B all'interno delle cellule viventi totali è stata determinata mediante analisi della citometria a flusso (vedere la Figura 5A per la strategia di gating). Dati rappresentativi del midollo osseo (BM) da un solo topo PDX (iniezioni di stroma di controllo ricevute, 5 x 10 6 cellule / settimana) e un topo TSLP + PDX (iniezioni stroma TSLP ricevute, 5 x 10 6 cellule a settimana). I conteggi totali di cellule BM sono stati registrati in eutanasia e la citometria di flusso immunitario-fenotipo è stata utilizzata per valutare la frequenza del sottosistema (%) e calcolare la dimensione di ciascuna popolazione di sottoinsieme di cellule B (numero di cellule sottoinsieme = "totAl "cellule viventi" x "frequenza subset").
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Discussion
Questo manoscritto descrive un metodo semplice, veloce e relativamente conveniente per progettare PDX per esprimere la citochina umana esogena. La strategia qui descritta si basa su iniezioni intraperitoneali settimanali di una linea cellulare stromale trasfusa per esprimere la citocina umana, TSLP. Prima di eseguire i metodi qui descritti, sono stati generati stromi progettati per esprimere livelli elevati della citochina di interesse (TSLP) e dello stroma di controllo simile. Nei protocolli qui presentati, lo stroma viene ampliato nella cultura e proiettato per la capacità di fornire una produzione stabile e alta di citochine nel tempo (o per l'assenza della produzione di citochine nel caso dello stroma di controllo). Sono stati eseguiti saggi per verificare l'attività della citochina generata da stroma e sono state sviluppate temporali sperimentali per l'iniezione di cellule stromali per produrre PDX con TSLP umano fisiologico (e topi di controllo che non dispongono di TSLP umano). Procedure per il monitoraggio dei livelli plasmatici di TSLP umani ePer la verifica dei suoi effetti funzionali in vivo sulle popolazioni cellulari sensibili alle citochine.
Diversi fattori devono essere presi in considerazione nella scelta delle cellule stromali e dei vettori che verranno utilizzati nei protocolli qui presentati. Le linee cellulari stromali non dovrebbero produrre endogeno elevati livelli di citochine e non dovrebbero essere sensibili alla citochina di interesse. Per studi qui, la linea di cellule stromali del midollo osseo umano, HS-27A, è stata selezionata perché cresce robustamente nella coltura con la produzione di citochine a basso livello. 8 Il metodo descritto qui include anche "controllo" PDX costruito con lo stesso stroma di TSLP + PDX, ma senza sovraespressione di TSLP. I confronti dei risultati in TSLP + e nel controllo PDX ci permettono di controllare tutti gli effetti dovuti alla produzione endogena di citochine di cellule stromali. La trasduzione di cellule stromali con vettori che includono proteine fluorescenti o altri marcatori selectable può essere utile per isolare le cellule thSono probabili overexpress la citocina di interesse. Tuttavia, è essenziale determinare il supernatante della citocina per determinare il livello di citochina prodotto dalle cellule stromali poiché i livelli di citocina plasmatica in vivo nei topi correlano con la concentrazione di citochine nel supernatante di cellule stromali 6 , così come il numero di stroma iniettato su un Settimanalmente ( Figura 4 ).
È importante che l'attività della citochina prodotta da uno stroma sia verificata prima degli studi di PDX. Abbiamo utilizzato la citometria a flusso fosfatico per il dosaggio di molecole fosforilate a valle della stimolazione TSLP in cellule che rispondono a TSLP. TSLP attiva i percorsi JAK-STAT5 e PI3 / AKT / mTOR. Le linee cellulari delle leucemie MUTZ5 e MHH-CALL4 esprimono livelli elevati dei componenti del recettore TSLP e mostrano la fosforilazione S5 della proteina STAT5, AKT e ribosomica a seguito di stimolazione TSLP. 14 Qui abbiamo usato la citometria di phopho-flowPer valutare la fosforilazione di STAT5 (pSTAT5) indotta a valle della stimolazione TSLP. Nel lavoro precedente abbiamo valutato gli eventi addizionali di fosforilazione stimolati da TSLP: fosfo-AKT (pAKT) e proteina fosfoliposomica S6 (pS6, a valle di mTOR). I risultati hanno mostrato che il test pAKT è meno sensibile e il pS6 è più sensibile del saggio pSTAT5. 6 Quando si eseguono test di fosfociti, le cellule reattive devono essere coltivate con livelli saturi di TSLP umano ricombinante come un controllo positivo e solo con mezzi (nessuna citochina) come controllo negativo. Supernatant da stroma di controllo dovrebbe essere analizzato lungo il lato che da TSLP + stroma come un secondo mezzo di verifica (oltre a ELISA) che TSLP non è prodotto da stroma di controllo. Questo serve anche come un controllo per assicurare che la produzione di citochine endogene non sia responsabile della fosforilazione osservata nei saggi delle cellule TSLP +. Idealmente, la fosforilazione indotta da campioni di stroma produttori di citochine dovrebbe essere simileSi osserva con la condizione di citochine ricombinante, anche se può essere più bassa se la concentrazione di citochina nel surnatante è inferiore rispetto al controllo saturante e positivo. Un buon controllo con livelli di TSLP ricombinanti che corrispondono ai livelli osservati da ELISA per lo stroma TSLP + sono una buona alternativa.
La identificazione di indicatori funzionali noti dell'attività in vivo di citochine può essere una sfida. Assaggi di fosforilazione non può essere possibile perché la fosforilazione indotta dalla citochina umana esogena in vivo può essere rapidamente persa durante il raccolto tissutale. Poiché TSLP è stato dimostrato di aumentare la produzione di precursori di cellule B umani, 23 l'effetto funzionale di TSLP in PDX è stato verificato analizzando gli incrementi in vivo della popolazione precursore della cellula umana B mediante immunofenotipizzazione a flusso cytometrico. Una strategia alternativa potrebbe essere la prova di specifici cambiamenti indotti da citochine nell'espressione genica e nel confrontoNg nelle cellule raccolte da PDX che esprimono citochine alle cellule del controllo PDX. 6
L'obiettivo finale dell'espressione della citocina umana in PDX è generare un modello preclinico che più strettamente modella l'ambiente in vivo presente nei pazienti. Questo è stato testato confrontando l'espressione di intero genoma nei tessuti umani isolati dal PDX di controllo e da PDX espresso da citochine (TSLP +) nei campioni originali dei pazienti. Questi studi hanno dimostrato che l'espressione genica nei campioni dei pazienti è significativamente più vicina alle cellule di leucemia da TSLP + PDX rispetto ai controlli. 6 Tuttavia, i nostri studi si sono concentrati sulla linfopoiesi. Un certo numero di citocine che promuovono mieloide prodotte nel mouse non attivano le loro controparti del recettore umano. Ci sono topi knockin umani (topi NSGS e altri) che affrontano questo problema. Infatti, un valore del modello che descriviamo qui è che può essere utilizzato nei topi NSGS per creare un modello più chiusoEly modella l'ambiente umano in vivo esprimendo TSLP in aggiunta alle citochine umane che promuovono mieloide. D'altra parte, un sistema di citochine +/- potrebbe essere generato in topi NSG utilizzando il metodo descritto qui per ciascuna di queste citochine che promuovono mieloide. Questo modello può essere utilizzato per studiare il preciso ruolo in vivo di ciascuno di essi in myelopoie e / o leucemia mieloide.
PDX progettato che produce livelli fisiologici del TSLP umano fornisce un modello preclinico che più imitava l'ambiente in vivo presente nei pazienti rispetto al classico PDX. 4 Sono inoltre descritti la produzione di topi PDX di controllo che sono analogamente progettati. Insieme il controllo e la produzione di citochine PDX creano un modello umano TSLP +/- che abbiamo usato con successo per valutare il ruolo di TSLP nella produzione in vivo di cellule B umane normali e maligne. 4 , 6 QuestoIl modello è molto rilevante per studi di una particolare forma ad alto rischio di leucemia linfoblastica acuta (B-ALL) cellulare caratterizzata da alterazioni genetiche che portano ad una sovraespressione di CRLF2. CRLF2 è un recettore per la citochina TSLP e quindi la segnalazione di CRLF2 indotta da TSLP contribuisce probabilmente alla oncogenesi e alla progressione di CRLF2 + B-ALL. L'uso di PDX per studiare questa malattia è particolarmente critico perché PDX ci permette di studiare la leucemia nel contesto del paesaggio genetico del paziente. Il paesaggio genetico come contribuente di malattia è fortemente implicato in CRLF2 + B-ALL, che si verifica cinque volte più spesso nei bambini ispanici / latini rispetto ad altri e costituisce metà di tutti i casi di B-ALL nei pazienti con sindrome di Down. I modelli PDX che esprimono il TSLP umano come quello descritto qui saranno uno strumento importante per identificare le terapie e comprendere i meccanismi della malattia di CRLF2 + B-ALL così come per comprendere la normale ematuria.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
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- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
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