Summary
这里描述了通过每周腹膜内注射细胞因子转导的基质细胞系，在患者来源的异种移植物（PDX）小鼠中产生外源性细胞因子的方法。该方法扩大了PDX的效用，并提供了许多PDX模型中瞬时或持续的外源细胞因子递送的选择。
Abstract
通过将人细胞移植到免疫缺陷小鼠中来产生患者来源的异种移植（PDX）小鼠。这些模型是研究正常和恶性造血机制的重要工具，是确定许多恶性肿瘤的有效化学疗法的黄金标准。 PDX模型是可能的，因为许多小鼠细胞因子也对人细胞起作用。然而，对于所有细胞因子来说，情况并非如此，包括许多对于研究人类细胞中正常和恶性造血作用至关重要的细胞因子。设计小鼠产生人细胞因子（转基因和敲入模型）的技术在模型的有用性已被证明之前需要大量费用。其他技术是劳动密集型（注射重组细胞因子或慢病毒），在某些情况下需要高水平的技术专长（流体动力学注射DNA）。本报告描述了一种产生具有外源性人类细胞的PDX小鼠的简单方法（TSLP，胸腺基质淋巴细胞生成素） 通过每周腹膜内注射已被转导过表达该细胞因子的基质。使用这种方法提供了实现小鼠循环中人细胞因子生理水平的连续细胞因子产生的体内来源。人细胞因子的血浆水平可以基于注射的基质细胞的数量而变化，并且细胞因子产生可以在实验的任何点开始。该方法还包括类似地产生的细胞因子阴性对照小鼠，但是通过腹膜内注射用对照载体转导的基质。我们以前已经表明，与对照PDX相比，从表达TSLP的PDX收获的白血病细胞表现出更像原始患者样品的基因表达模式。通过这种方法产生的细胞因子产生和细胞因子阴性的PDX小鼠一起提供了一个我们已经成功地用于研究的模型系统TSLP在正常和恶性造血中的作用。
Introduction
患者来源的异种移植物（PDX）是一种强大的体内模型，用于研究“天然”哺乳动物环境中正常和恶性造血细胞的产生。最常见的是，通过将人细胞注射或移植到免疫缺陷小鼠中来产生PDX。使用正常人造血干细胞的PDX生产允许对正常人血液和免疫细胞发育的体内研究。由白血病或其他癌细胞产生的PDX可以研究致癌机制，并在人群中存在的遗传景观和突变范围的背景下鉴定有效的治疗方法。 1因此，PDX是目前翻译生物医学研究的黄金标准，用于识别有效的治疗方法，也是理解癌症进展机制的重要工具。 PDX模型是帮助研究健康差异疾病的重要工具遗传病变或任何疾病，其中患者遗传景观的变化可以显着地促成肿瘤形成和治疗结果。
小鼠 - 人PDX模型是可能的，因为许多小鼠细胞因子在它们在小鼠内部时激活人类细胞的细胞因子受体时充分模拟了它们的人类类似物。例如，白细胞介素-7（IL-7）为人B细胞发育提供了关键信号。 2在这种情况下，小鼠IL-7与人IL-7具有足够的同源性，小鼠细胞因子刺激人B细胞前体中的信号通路。 2，3，4然而，胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP），其中其他细胞因子（IL-3，粒细胞 - 巨噬细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），干细胞因子（SCF） ，对于正常和恶性人造血细胞的生产来说重要的是，当小鼠和人类细胞因子显示出低同源性时，小鼠细胞因子不会在人细胞上激活它们各自的受体，为了克服这个障碍，已经使用了许多策略在PDX小鼠中设计人类细胞因子的表达，包括注射重组人细胞因子，流体动力注射DNA，慢病毒表达，转基因表达和敲入基因置换7本报告介绍了一种通过基质介导的方法制备人类细胞因子细胞因子递送（ 图1 ）。
在本文所示的方法中，PDX小鼠被工程化以表达人细胞因子，TSLP，或用作细胞因子阴性对照。表达TSLP的PDX通过每周腹膜内注射已被转导以表达高水平人TSLP的基质细胞来实现。细胞因子阴性PDX“对照”小鼠被类似地设计;虽然控制基质用控制载体转导。该方法在注射TSLP +基质的PDX小鼠中达到人TSLP的正常生理水平。在接受细胞因子阴性基质的PDX小鼠中未观察到可检测的TSLP。我们选择人类基质细胞系HS-27A作为我们的研究，因为它在培养中强壮地生长，并且显示非常低水平的细胞因子产生，其不支持共培养物中分离的祖细胞的增殖。 8对于人TSLP表达，使用来自先前描述的骨架9的先进一代自身灭活慢病毒载体转导基质，并且包括cPPT / cts元件和土拨鼠肝炎后转录调节元件（WPRE）以增加转基因表达。在延伸因子-1的控制下将人TSLP基因构建到该载体中（EF-1）α启动子，以实现强壮，组成型和长期表达。
这种人细胞因子增强的PDX模型的工程包括4个主要步骤。首先，转导的基质在体外扩增 ，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）来评估稳定的高水平细胞因子产生。第二，使用磷酸流式细胞术验证转导的基质细胞产生的人细胞因子的活性（和来自对照基质的细胞因子活性的缺乏）。已知对感兴趣的细胞因子（本例中为TSLP）有反应的细胞系与基质细胞上清液一起温育，并测定细胞因子诱导的磷酸化。第三，将小鼠注射转导的人类基质，然后每周一次通过ELISA评估人细胞因子水平的小鼠血浆。第四，移植人类造血细胞，并在已知靶标上评估人细胞因子的体内功能效应（ 与其他在PDX小鼠中递送/产生人细胞因子的方法相比， 通过基质细胞递送人细胞因子提供了优点和缺点。与注射重组人细胞因子相比，基质介导的递送通常较便宜（基质细胞培养的成本低于重组细胞因子的成本）和较少的劳动密集型（每周一次注射，而每周多次注射）。短暂的细胞因子半衰期的问题也被缓解，因为基质不断产生外源细胞因子。 通过流体动力注射DNA递送细胞因子可能比通过基质递送更便宜。然而，它类似地是短暂的，并且可能需要比基质介导递送所需的简单的每周腹膜内注射更多的技术技能。小鼠中的慢病毒基因表达可以提供较少的转录细胞因子递送的方法;然而，在我们手中，生理TSLP水平未达到。另外，这种方法是劳动密集型的，需要连续生产慢病毒载体。转基因或敲入小鼠提供稳定的细胞因子的长期表达，并且可以被设计用于组织特异性表达，这可以是一个优点。另一方面，人类细胞因子基因在PDX小鼠所需的免疫缺陷小鼠背景上的转基因表达在模型的价值建立之前需要大量的资源投入。此外，转基因模型通常不允许改变细胞因子起始的时间或体内细胞因子产生的水平的选择。这些可以通过简单地改变引发基质细胞注射的时间点或注射的基质细胞的剂量来实现基质介导的递送。 基质细胞介导的细胞因子转运在这里详细描述的用于开发PDX以评估TSLP在正常人B细胞发育4,6和高风险B细胞急性淋巴细胞白血病中的作用。该方法提供了替代细胞因子递送方法，用于产生与TSLP以外的人细胞因子相似的模型。该模型还可用于产生初步数据，可以帮助确定细胞因子转基因或细胞因子敲入PDX模型的价值是否值得大量的时间和金钱投资。 
图1：用于在小鼠中产生外源人细胞因子的PDX模型。 （ 1A ）设计实验并获得转导的人类基质细胞（ 1B ）获得人类细胞（造血干细胞，白血病细胞等 ）产生PDX（患者来源的异种移植物）小鼠。 （ 2A ）根据实验时间表将注射工程基质和（ 2B ）将人类细胞移植入免疫缺陷小鼠。 （ 3A-B ）通过ELISA监测基质上清液和小鼠血浆中的细胞因子浓度。 （ 4 ）收获人体细胞并评估PDX中存在的人细胞因子的体内功能效应。 请点击这里以查看该图的较大版本。
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Protocol
根据洛马琳达大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）和机构审查委员会（IRB）批准的协议和根据所有联邦指南进行研究。
注意：PDX和人体组织应按照安全规程处理，以防止血液传播的病原体传播。
细胞因子转导的基质细胞的培养和扩增
注意：每次基质传代，收获培养上清（1 mL等分试样），并储存在-80°C，以便将来通过 ELISA测定定量细胞因子水平。
- 如材料表中所述，制备R10培养基和冷冻培养基。
- 产生10,11或获得对照基质（用空载体转导）和产生细胞因子（TSLP +）的基质。“> 6在液氮（LN 2 ）中储存，直到使用，如所述12解冻基质细胞，并将其置于分开的T-25细胞培养瓶中的5 mL R10培养基中，培养细胞在37℃的培养箱中， CO 2 ，这是解冻后的“第1号”。
- 一旦基质汇合（24-48 h），通过胰蛋白酶消化，使用1×胰蛋白酶EDTA（0.25％）并在T-150培养瓶中重新铺板。这是解冻后的“通道＃2”。
- 当基质在T-150烧瓶（3-4天后）中达到融合时，通过胰蛋白酶消化细胞。使用这种细胞悬浮液用于实验需要。
- 细胞膨胀到多个烧瓶
- 将收获的细胞在三个T-150烧瓶之间分离并培养直至汇合。如果需要基质扩张，重复此步骤。在T-150烧瓶中汇合时典型的人间质（HS-27A）细胞计数为〜5×10 6 。
- 细胞torage
- 将收获的细胞悬浮液转移到锥形管中，并以500×g离心5分钟，倾析上清液并将细胞重悬于冷冻培养基中。冷冻并存放LN 2〜1.5×10 6个细胞/瓶。
- 对于小鼠中的periotoneal基质注射进入步骤4.1。
- 细胞膨胀到多个烧瓶
2.用于监测转导基质体外细胞因子生产的ELISA测定
- 购买市售的ELISA测定试剂盒以检测感兴趣的细胞因子。
- 解冻早期，中期和晚期传代期收获的来自对照和细胞因子产生（TSLP +）基质的基质细胞上清液（ 图2 ）。
- 使用ELISA试剂盒根据制造商的说明书确定上清液样品中的TSLP浓度。编制这些序列数据来监测细胞培养期间细胞因子产生的稳定性 e（ 图2A-B ）。
- 鉴定并丢弃具有减少或次优的细胞因子表达的细胞因子产生基质，以及储存中任何相应的小瓶（ 图2A-B ）。
- 识别和维持表现出稳定，高水平细胞因子浓度的产生细胞因子的基质。使用这些解冻进行实验。
- 使用ELISA试剂盒在细胞培养期间常规监测基质（在解冻后早期，中期和晚期至少1次），以确保稳定的细胞因子产生，或在对照基质的情况下，不存在细胞因子产生。
3.磷酸流动细胞分析法测定细胞因子产生的细胞因子活性
注意：在第一次实验之前评估工程基质的上清液，以验证基因产生的细胞因子的相关生物活性用于个别实验。一旦工程基因被验证，进一步的测试是不必要的，除非引入了用新载体产生的基质。
- 购买MUTZ5和/或MHH-CALL4白血病细胞系（TSLP反应性）， 14种重组人细胞因子，以及批准用于磷酸流式细胞术检测以检测合适的下游磷酸化靶标的抗体。
- 从对照和表达细胞因子的基质中解冻收获的上清液。
- 在96孔组织培养板中以0.2×10 6个细胞浓度将R20培养基（参见表格 ）中的白血病细胞系平板化。每个条件平板3孔以允许一式三份测定。在37℃孵育2小时。这一次允许在先前培养条件下发生的任何磷酸化的损失。
注意：每个细胞系12个孔为步骤3.4所示的每个实验条件提供一式三份测定。 <在培养2小时后，将细胞从每孔转移到4mL管中，并在4℃下以500×g离心5分钟。倾倒上清液。 - 对于以下实验条件中的每一个，将细胞重新悬浮在200μL中（一式三份进行测定）：1）仅阴性对照培养基，2）在饱和浓度下（TSLP为15ng）的重组细胞因子的阳性对照培养基/ mL 等 ），3）控制来自对照基质的基质上清液，以及4）来自细胞因子产生基质的细胞因子 - 基质上清液。
- 在特定商业磷酸化测定指定的持续时间内孵育细胞（ 例如 ，对于TSUP，MUTZ5或MHH-CALL4中的磷酸化STAT5为30分钟）。
- 在4℃下以500xg离心5分钟并倾析上清液。
- 按照制造商的方案进行磷酸流式细胞仪染色，并收集流式细胞术数据。 15
- 基于正向（FSC，表示细胞大小）和侧（SSC，表示细胞粒度）光散射的完整细胞上的门。
- 确定每个样品中完整细胞的中值荧光强度（MFI）。比较从基质细胞上清液的一式三份值获得的平均MFI与阳性和阴性介质对照的平均MFI。
4.将细胞因子转导的基质注射入小鼠
注意：培养HS-27A基质至少3次解冻前通道，然后将其注入小鼠，以确保健康细胞和充分的细胞因子产生。
- 基质的制备
- 将收获的基质细胞悬浮液转移到锥形管中，并将等分试样10μL用于血细胞计数器;使用台盼蓝获得活细胞计数。 16离心剩下的ce以500×g悬浮5分钟。
- 从造粒的细胞吸出上清液，并轻轻地将细胞重悬于必要体积的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用于小鼠注射（取决于注射的小鼠数目）。
注意小鼠注射的典型基质细胞浓度：在200μLPBS中每只小鼠0.5×10 6 -5×10 6个细胞。 - 将基质细胞悬浮液保持在4°C（或冰上），直到注射前。确保细胞悬浮液至少在室温（RT）（〜25°C）下注射小鼠。
- 基质细胞注射
- 消毒生物安全罩，组装注射材料，然后将鼠笼放在里面。
- 在将200μL拉伸成结核菌素注射器之前，通过反转轻轻混合细胞悬浮液。
- 使用标准腹膜内注射技术， 17约束小鼠并将200μL细胞悬浮液施用于腹膜腔。 Machholz 等人先前已经详细说明了这些细节。 18
5.小鼠外源人细胞因子的系列血液收集和血浆监测
- 通过尾巴剪取血液收集
- 消毒生物安全罩，组装鼠标垫，剪刀等工具/用品。
- 将鼠标放在限制器中并固定管，以尽量减少鼠标移动。
- 用异丙醇消毒尾巴和手术剪刀。在尾部涂上局部麻醉霜。
- 使用非常锋利的外科剪刀剪掉约0.5 - 1毫米的小鼠尾巴。使用肝素化毛细管收集大约80μL的外周血。
注意：如果采用这种方法六次以上采集血液mes，尾部去除应保守相对于尾部的去除量。随着剪刀向上延伸，直径增加，出血更快，愈合时间更长。
- 等离子体分离
- 使用灯泡注射器（将其从毛细管中排出）转移到标记的K 2 EDTA大容量管中;反转20次以防止凝血。
注意：通常来自尾夹的血液凝固很快。然而，如果出血持续时间超过约2分钟，请使用浸液式铅笔/粉末来辅助凝血。 - 根据制造商的说明离心血液采集管，并等离子体储存（-20°C）直到准备进行ELISA测定。
- 如果需要来自小鼠血液的小鼠 - 人细胞嵌合数据，则如步骤6.3.1所述处理剩余的颗粒。否则，丢弃血细胞沉淀。
- 使用灯泡注射器（将其从毛细管中排出）转移到标记的K 2 EDTA大容量管中;反转20次以防止凝血。
- 微量修饰ELISA小鼠血浆的umes
注意：制造商的ELISA程序从推荐的100μL样品体积修改为40μL体积，以适应从小鼠收集的微量体积。不可能以这些有限的体积一式三份运行体内小鼠血浆样品。在实验结束时，通过心脏穿刺收集大约500μL的死后血液。在100μL安乐死血浆中评估的细胞因子浓度用于验证每只小鼠的40μL 体内数据。- 解冻冷冻的小鼠血浆样品。
- 连续稀释ELISA标准品，并以40μl/孔将其平板化一式三份。
- 向ELISA板中加入每只小鼠血浆样品40μL。
注意：如果小鼠样品小于40μL，则使用ELISA缓冲液将体积高达40μL。记录此稀释液体积，并使用它来计算每个稀释样品的稀释因子。什么时候分析ELISA数据将稀释的样品浓度乘以样品的稀释因子，以确定原始样品中的实际细胞因子浓度。 - 根据制造商的说明完成ELISA测定。
6.将造血细胞移植入小鼠
- 亚致死辐射条件移植骨髓
注意：洛马琳达大学（LLU）使用Co-60辐射源。将动物放置在距离辐射源80cm处的20×20cm场中并且在距离限制器顶部具有0.5cm的Lexan层的饼形限制器中。计算暴露时间，以达到225 cGy剂量，根据最近的校准源（目前为2-3分钟）。- 次级照射小鼠（全身照射剂量为免疫缺陷小鼠最大225cGy）。
- 移植造血细胞〜24小时后通过<静脉注射静脉注射。
- 静脉内造血细胞移植
- 准备人体细胞悬浮液移植体积200μL无菌PBS每只小鼠：CD34 +造血干细胞（HSC）：1×10 5至5×10 5细胞/小鼠和白血病细胞系/患者样本：1×10 6至每只小鼠5×10 6个细胞。
- 将细胞保持在4°C（冰上运输）直至移植前。移植前确保细胞至少在室温下。
- 消毒生物安全罩，准备移植注射罩。
- 将鼠标置于加温笼中至少5分钟以允许尾静脉扩张。
- 轻轻混匀细胞悬浮液，并将200μL加入结核菌素注射器。安全地将针放在一边将其保持无菌的地方。
- 将鼠标放在约束中，用异丙醇对尾巴进行消毒/ LI>
- 使用标准静脉注射技术， 17将人细胞悬液注入小鼠尾静脉。
注意：尾静脉注射可能需要几次尝试，特别是对于新手动物处理器。 Kovacscics和Raper的JoVE视频19提供了这种动物技术的详细演示。 - 监测鼠标恢复约5分钟。记录注射期间的任何不良事件（ 例如溢出的细胞，主要出血，过度的尾部创伤）。
- 分析小鼠外周血中的人细胞嵌合
- 在血浆分离后获得剩余在血管中的血球细胞（步骤5.2.3）。
- 对于红血细胞（RBC）裂解，将剩余的血球重新悬浮在等体积的PBS中，等离子体移除（以取代血浆体积）并充分混合（涡流/移液管）。
- 将每个再悬浮的血液样品转移到标记的4 mL管中然后以1:9的比例向每个管中加入RBC裂解缓冲液（900μLRBC裂解缓冲液用于100μL重悬浮的血液）。在室温下孵育5分钟。离心机（5分钟，500×g）和倾析。
- 进行第二次RBC裂解缓冲液孵育（室温5分钟）。离心和倾析如前。
- 洗涤〜1 mL PBS中的剩余细胞。离心和倾析如前。
- 将沉淀重悬于适合于标准流式细胞术染色的PBS体积（根据制造商和个别实验室方案而异）。 20使用验证流式细胞术的免疫分型抗体鉴定小鼠细胞（小鼠CD45 +）和人类细胞（人类CD45 +）6,21 以及对感兴趣的细胞系特异性的其它人白细胞标志物。
注意：建议从每个小鼠样品取小体积（5μL-20μL）以创建“合并样品”;用于未染色，活力和同种型对照样品。对于每个实验条件，最佳做法有未染色和同种型对照。
7. 体内细胞因子活性的功能评估
- 小鼠安乐死和组织收获
- 在指定的实验时间点通过 CO 2窒息来安乐死小鼠。
- 通过心脏穿刺获取血液并收集血浆，如步骤5.2.1-5.2.2所示。
注意：在其他组织之前收集血液，因为它在死亡后立即开始凝结。 - 按步骤5.2.2处理小鼠血液，等分并储存血浆。
- 随后，根据制造商的方案， 通过 ELISA来评估在安乐死中获得的血浆中的外源性细胞因子浓度。评估并比较来自连续体内的小鼠血浆中的外源性细胞因子浓度采血和安乐死血浆样品（见5.3节）。
- 将PBS添加到剩余的血液样品中以取代等离子体体积和过程，如步骤6.3.1和6.3.2所述。立即进行流式细胞术检测或将细胞重新悬浮于冷冻介质中以保留LN 2 。
- 从PDX小鼠收获骨髓（BM）和脾脏，并如前所述制备单细胞悬液。 22
- 使用3％乙酸与亚甲蓝（裂解细胞膜和RBCs离开活细胞的完整核），以1：1的稀释度和使用血细胞计数器计数细胞获得每个PDX小鼠组织样品的细胞计数。列出每只动物的骨髓和脾脏样品的总细胞计数。
- 离心机（500×g，15分钟）细胞悬浮液并倒出上清液。立即进行骨髓和/或脾细胞的流式细胞术测定，或重悬于冷冻培养基中，sub> 2存储。
注意：每只小鼠冷冻10个BM等分试样（用于未来的生化测定）和〜5个脾脏等分试样（用于未来的PDX移植）。 - 免疫分型鉴定体内功能的影响
- 为感染目标细胞因子和第二MM同种型对照抗体（ 图5和材料表）制备免疫表型造血细胞群的流式细胞计数抗体的一种主混合物（MM）。
- 在步骤7.4中制备的解冻PDX组织等分试样（37℃珠浴）。
- 通过将解冻的细胞转移到锥形管中并加入至少3倍体积的PBS来洗涤解冻的细胞。离心（500×g，5分钟）并倒出上清液。
- 重复洗涤步骤（7.5.3）。
- 通过从每个PDX样品中获取〜10μL-20μL细胞，用于未染色的对照，活力对照和同种型对照（参见步骤6.4.6注释），创建合并的等分试样。污染所有样品，除了您使用可固定的活力染料（死细胞标记）进行染色控制，根据制造商的方案孵育和洗涤。
- 根据标准流式细胞术染色方案，用表型-MM染色每个PDX细胞样品;用同种型MM相似地染色合并的同种型对照样品。孵育所有样品，用PBS洗涤，并通过重悬浮于1％多聚甲醛中固定样品。
- 收集流式细胞术数据并使用适合感兴趣的细胞群体的门控策略分析数据（ 图5 ）。典型的门控如下：
- 通过绘制排除碎片的FSC和SSC门来定义完整的单元格。
- 通过选择对死细胞标记为阴性的细胞（这是“总活细胞”）来识别活细胞群体。
- 在“总活细胞”中使用子门来定义具有所需免疫表型的细胞多数（参见图5）。
- 获得来自流式细胞术分析的总活细胞计数中子集细胞群的频率。 6，21
- 通过将B细胞亚群的频率乘以总活细胞（步骤7.5.6.4中获得）乘以步骤7.3中获得的每组织的总活细胞计数（％B细胞亚群x“）来计算每个组织中的靶细胞数目血细胞计数器细胞计数“; 见表1 ）
- 比较对照PDX小鼠和表达细胞因子（TSLP +）的PDX小鼠之间的靶细胞群的细胞计数，以确定外源人细胞因子的体内功能效应（ 表1 ）。
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Representative Results
模型的概述如图1所示 。一旦产生了细胞因子产生（TSLP +基质）和对照基质，它们在培养物中扩增。在将基质注入小鼠之前，通过ELISA评估基质细胞上清液以验证细胞因子产生（ 图2 ），并使用磷酸流式细胞术（方案＃3）来验证由基质产生的细胞因子的活性。当细胞传代时，上清液从融合的基质细胞培养物（对照基质和TSLP +基质）中收集。 ELISA用于在早期，中期和晚期传代中至少检测一次上清液中TSLP的浓度。来自对照基质的代表性数据显示在图2A中 。应该丢弃显示TSLP表达的基质细胞培养物（以及从其中冷冻的任何小瓶）。控制不可检测的TSLP的培养物被扩大并冷冻以备将来使用。如图2B所示，丢弃显示低水平TSLP产生的TSLP +基质的培养物（以及从它们冷冻的小瓶）。选择显示稳定，高水平的细胞因子产生的TSLP +基质进行扩增和储存以用于将来的实验。来自对照和TSLP +基质的多个培养物的上清液中TSLP的平均水平显示在图2C中 。
制备具有人细胞因子的对照PDX小鼠的实验时间线如图3所示 。在移植前3周开始基质细胞培养，并且如图2所述进行培养上清液中的体外 TSLP产生的ELISA测定。每周监测小鼠血浆中的体内人TSLP（ 图4 ），使用“修饰的ELISA方案＃4中描述的小体积的微量血浆。 Peripheral血液与血浆同时收集，并按照“Protocol of human cell chimerism in mouse peripheral blood”中方案6所述进行测定。注射对照基质的PDX一致显示低于检测阈值的血浆人类TSLP水平（ 图4A ）。注射TSLP +基质的PDX小鼠中TSLP的血浆水平与前1-2周内注射的TSLP +基质细胞数成正比。如果间歇细胞注射停止，TSLP的血浆水平迅速下降。 6 如图4B所示 ，每周注射0.5×10 6个 TSLP +基质（在培养上清液中平均产生> 1,000pg / mL的TSLP）在生理水平的下限附近（〜5-10pg / mL）产生血浆TSLP水平）。在PDX小鼠中每周注射5×10 6个 TSLP +基质导致血浆TSLP水平达到高生理水平（〜35pg / mL），如
TSLP已显示增加正常人B细胞前体的产生。因此，为了评估TSLP 的体内功能，我们对产品进行了比较 如图5和表1所示，移植了造血干细胞的对照组和TSLP + PDX小鼠中的正常人B细胞前体的离子。 图5A显示了用于鉴定人B谱系细胞亚群的免疫表型分型的流式细胞仪选通。用于枚举一个对照PDX和一个TSLP + PDX的每个子集中的细胞数的样本计算如表1所示 。如图5B所示，与对照PDX相比，TS谱图中B谱系细胞显着增加，这种增加从最早的B细胞前体（pro-B细胞）开始。对照组和TSLP + PDX组之间非B系细胞数无明显差异（数据未显示）。该测定提供了一种验证在TSLP + PDX 中体内产生的人TSLP对靶细胞群体的体内功能作用的方法。
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图2： 用于监测基质上清液中TSLP细胞因子浓度的ELISA。使用ELISA测定法在以下细胞传代期间至少测定来自对照基质（用对照载体转导）和TSLP +基质（转导以表达人TSLP）的上清液中的TSLP浓度：早期（第1-5代），中间（通道6-12）和晚（第13-20段）。这里使用的人TSLP ELISA测定的检测阈值为1.9pg / mL（红色虚线）。 （ A ）对照基质产生最低可检测的人类TSLP浓度;这些水平通常低于实验持续时间的ELISA检测阈值。随着从该培养物中冷冻的所有等分试样，丢弃显示TSLP浓度增加（> 15pg / mL）的培养物中的对照基质。 （ B ）由不同的培养物产生的人类TSLP生产是不同的t解冻小瓶TSLP +基质（ n = 9）和整个培养期间。显示出降低或不稳定的细胞因子产生（TSLP <1,000pg / mL）的TSLP基质也被丢弃。 （ C ）对照（绿色）和TSLP +（蓝色）基质的平均TSLP浓度（平均值和95％置信区间）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3： 用外源人细胞因子生成产生PDX小鼠的实验时间表。 实验的体外和体内部分同时进行。在造血细胞移植前2-3周开始对照和+ TSLP基质细胞培养，其确保在第一次（至Wk -1）每周基质细胞注射。这确保基质细胞是健康的，增殖的并产生足够的细胞因子水平。当传代细胞时收集上清液等分试样，并使用ELISA测定法测定基质上清液中的TSLP浓度（ 见图2 ）。在第1天的人类造血细胞移植前一天，在第0天照射动物。在第一次基质注射后1至2周开始每周采血。此时，使用修饰的ELISA测定法可以在小鼠血浆中检测外源性人细胞因子浓度（ 图4 ）。实验终点是人类细胞移植后5-16周;这取决于在小鼠外周血中检测到的人细胞嵌合体的量。正常造血通常在第5-7周确定，白血病细胞嵌合体在细胞系和初级样本之间变化（3-16周）。 PDX移植成功和进展也依赖于关于在移植时注射的人类细胞的数量。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4： 实现小鼠血浆中生理人TSLP细胞因子浓度。小鼠接受每周腹膜内注射（200μL）转导的细胞，并收集其血浆以评估小鼠体内人TSLP浓度（ELISA测定）。 “对照”小鼠接受5×10 6个对照基质细胞，而“TSLP +低”（低TSLP基质剂量）小鼠接受0.5×10 6个 TSLP +基质细胞，“TSLP +高”（高TSLP基质剂量）小鼠接受5×10 6个 TSLP +基质细胞每周。人TSLP ELISA测定检测阈值为1.9pg / mL（红色虚线），TSLP的人体生理范围为〜5〜35pg / mL（灰色阴影）。 24 （参考文献11和Coats未发表的数据）（ A ）“对照”小鼠血浆一致地具有<5pg / mL或低于ELISA检测阈值的TSLP水平。 （ B ）“TSLP +低”小鼠血浆显示低生理水平的TSLP;而（ C ）“TSLP +高”小鼠血浆显示出高的生理水平。 （ D ）每个实验组的平均TSLP浓度（所有小鼠和时间点的平均值±SEM）显示小鼠血浆中检测到的TSLP水平与接受的基质剂量成比例;对照小鼠血浆水平低于ELISA检测阈值，“TSLP +高”血浆水平比“TSLP +低”小鼠血浆水平高四倍。“>请点击此处查看此图的较大版本。
图5： 正常人B细胞群的测定验证 外 源性人类TSLP在PDX小鼠中的 体内 功能效应。 PDX小鼠用对照和TSLP +基质进行工程化，并移植自从脐带血分离的人CD34 +细胞。通过流式细胞术的免疫表型用于鉴定从对照和TSLP + PDX收获的骨髓中人B细胞前体的亚群，如下：收获骨髓，解冻并用可固定的活力染色染色，用流式细胞仪染色，人CD45，CD19，CD34， κ＆λ轻链，以及表面IgD和IgM或细胞内IgM（cμ）。 （ A ）生活细胞总数ls是基于生存能力标记门控。连续图显示随后的门，以识别发育顺序的B系族亚群（数据显示来自TSLP + PDX）。 （ B ）通过流式细胞术软件测定总活细胞内每个子集的频率，并计算每个B细胞亚群中的细胞数。 （见表1）。绘制对照（黑色， n = 3）和TSLP +（蓝色， n = 5）PDX小鼠中每个B细胞亚群的细胞计数。 （平均值±SEM，* p <0.05，** p <0.01，**** p <0.0001）。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 人类细胞群体 | 频率。的总活细胞 | 活细胞计数我n BM | 人口中的＃个细胞 |
| 控制鼠标 | |||
| 总活细胞 | 100.00％ | 39.5 x 10 6 | 39.5 x 10 6 |
| hCD45 + | 98.50％ | 39.5 x 10 6 | 38.9 x 10 6 |
| 总CD19 + | 27.20％ | 39.5 x 10 6 | 10.7 x 10 6 |
| 概率 | 24.20％ | 39.5 x 10 6 | 9.56 x 10 6 |
| 前B | 1.70％ | 39.5 x 10 6 | 0.68 x 10 6 |
| 不成熟的B | 0.83％ | 39.5 x 10 6 | 0.33x 10 6 |
| 成熟B | 0.68％ | 39.5 x 10 6 | 0.27 x 10 6 |
| TSLP +鼠标 | |||
| 总活细胞 | 100.00％ | 72.0 x 10 6 | 72.0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99.30％ | 72.0 x 10 6 | 71.5 x 10 6 |
| 总CD19 + | 65.10％ | 72.0 x 10 6 | 46.8 x 10 6 |
| 概率 | 60.20％ | 72.0 x 10 6 | 43.3 x 10 6 |
| 前B | 2.70％ | 72.0 x 10 6 | 1.92×10 6 |
| 不成熟的B | 1.60％ | 72.0 x 10 6 | 0.11 x 10 6 |
| 成熟B | 0.40％ | 72.0 x 10 6 | 0.29×10 6 |
表1：PDX骨髓中正常人B细胞亚群的频率和计数。通过流式细胞术分析确定总活细胞内每个B细胞亚群的频率（％）（参见图5A的门控策略）。来自一个对照PDX小鼠（接受对照基质注射，5×10 6个细胞/周）和一个TSLP + PDX小鼠（接受TSLP基质注射，5×10 6个细胞/周）的代表性骨髓（BM）数据。在安乐死中记录了总活体BM细胞计数，免疫表型流式细胞术用于评估子集频率（％），并计算每个B细胞子集群的大小（子集细胞计数=“tot活细胞“x”子集频率“）。
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Discussion
该手稿描述了一种用于工程化PDX来表达外源人细胞因子的简单，快速且相对成本有效的方法。这里描述的策略是基于每周腹膜内注射转染以表达人细胞因子TSLP的基质细胞系。在进行本文描述的方法之前，产生用于表达高水平的感兴趣细胞因子（TSLP）和类似工程化的对照基质的基质。在本文提出的方案中，基质在培养物中扩增，并筛选随时间提供稳定，高水平细胞因子产生的能力（或在对照基质的情况下不存在细胞因子产生）。进行验证基质产生的细胞因子的活性的测定，并开发用于基质细胞注射的实验时间线以产生具有生理学人TSLP（和缺乏人类TSLP的对照小鼠）的PDX。监测人类TSLP血浆水平的程序用于验证其对细胞因子反应性细胞群的体内功能作用。
在选择本文提出的方案中使用的基质细胞和载体时，应考虑几个因素。基质细胞系不应内源性产生高水平的细胞因子，并且不应该对感兴趣的细胞因子起反应。对于这里的研究，选择人骨髓基质细胞系HS-27A，因为它在具有低水平细胞因子产生的培养物中强壮生长。 8这里描述的方法还包括使用与TSLP + PDX相同的基质设计的“控制”PDX，但不会过度表达TSLP。 TSLP +和对照PDX结果的比较可以控制由于内源性基质细胞因子产生的任何影响。用包含荧光蛋白或其他选择标记的载体转导基质细胞可有助于分离细胞可能过度表达感兴趣的细胞因子。然而，测定细胞因子上清液以确定由基质细胞产生的细胞因子的水平是重要的，因为小鼠中的体内血浆细胞因子水平与基质细胞上清液中的细胞因子浓度相关，以及在基质细胞上注射的基质数量每周（ 图4 ）。
重要的是在PDX研究之前验证由基质产生的细胞因子的活性。我们使用磷酸流式细胞术来测定对TSLP有反应的细胞中TSLP刺激下游磷酸化的分子。 TSLP激活JAK-STAT5和PI3 / AKT / mTOR途径。 MUTZ5和MHH-CALL4白血病细胞株表达高水平的TSLP受体组分，并显示TSLP刺激后的下游STAT5，AKT和核糖体蛋白S6磷酸化。这里我们使用了磷光流式细胞术评估TSLP刺激下游诱导的STAT5（pSTAT5）的磷酸化。在以前的工作中，我们评估了额外的TSLP刺激磷酸化事件：磷酸化AKT（pAKT）和磷酸核糖体蛋白S6（pS6，mTOR下游）。结果表明，pAKT检测灵敏度较低，pS6比pSTAT5检测灵敏度更高。 6当进行磷酸化测定时，响应性细胞应与饱和水平的重组人TSLP作为阳性对照，仅用培养基（无细胞因子）作为阴性对照培养。来自对照基质的上清液应沿着来自TSLP +基质的侧面进行测定，作为验证（除了ELISA之外）TSLP不是由对照基质产生的第二种方法。这也作为一个对照，以确保内源性细胞因子产生不对TSLP +细胞测定中观察到的磷酸化负责。理想地，从产生细胞因子的基质样品诱导的磷酸化应该是相似的对于用重组细胞因子条件观察，尽管如果上清液中细胞因子的浓度低于饱和的阳性对照，则可能较低。具有与通过ELISA观察到的TSLP +基质水平匹配的重组TSLP水平的阳性对照是一个很好的选择。
识别已知的体内细胞因子活性的功能指标可能是一个挑战。磷酸化的测定可能是不可能的，因为体内外源性人细胞因子诱导的磷酸化可以在组织收获期间快速丧失。由于TSLP已显示增加人B细胞前体的产生， 23通过使用流式细胞术免疫分型法测定人B细胞前体群体的体内增加来证实TSLP在PDX中的功能效应。另一种策略可能是测定特定细胞因子诱导的基因表达和比较变化在从细胞因子表达的PDX收获的细胞中的表达在来自对照PDX的细胞中的表达。 6
PDX中人细胞因子表达的最终目标是产生临床前模型，该模型更加模拟患者体内存在的环境。通过比较从对照PDX分离的人组织和表达细胞因子（TSLP +）PDX的原始患者样品中的全基因组表达进行测试。这些研究表明，患者样本中的基因表达比对照组显着更接近TSLP + PDX的白血病细胞。然而，我们的研究集中在淋巴细胞生成。在小鼠中产生的许多促进骨髓的细胞因子不会激活其受体对应物。有人类细胞因子敲入小鼠（NSGS小鼠和其他）解决这个问题。实际上，我们在这里描述的模型的一个值是它可以用于NSGS小鼠来创建一个更加闭合的模型通过表达TSLP除了促进骨髓的人细胞因子之外，还可以模拟人体内环境。另一方面，在NSG小鼠中可以使用这里描述的每种这些促进髓样细胞因子的方法产生细胞因子+/-系统。该模型可用于研究其中每一种在髓鞘和/或骨髓性白血病中的精确的体内作用。
产生生理水平的人类TSLP的工程化PDX提供了一种临床前模型，其更加模仿患者体内存在的环境，而不是传统的PDX。 还描述了类似设计的对照PDX小鼠的生产。控制和产生细胞因子的PDX一起创建了一个人类TSLP +/-模型系统，我们已经成功地用于评估TSLP在正常和恶性人B细胞的体内产生中的作用。 4，6这个模型与特异性高风险形式的B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的研究高度相关，其特征在于导致CRLF2过度表达的遗传改变。 CRLF2是TSLP细胞因子的受体，因此TSLP诱导的CRLF2信号可能有助于CRLF2 + B-ALL的肿瘤形成和进展。使用PDX研究这种疾病是特别关键的，因为PDX使我们能够在患者的遗传景观背景下研究白血病。作为疾病贡献者的遗传景观与CRLF2 + B-ALL强烈相关，其在西裔/拉丁裔儿童中的发生率高于其他儿童的五倍，并且在唐氏综合征患者中占所有B-ALL病例的一半。表达人类TSLP的PDX模型（如在此描述的）将是鉴定治疗和了解CRLF2 + B-ALL的疾病机制以及了解正常造血的重要工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
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