Summary
ここで、サイトカイン形質導入間質細胞株の毎週腹腔内注射による患者由来異種移植（PDX）マウスにおける外因性サイトカインの産生方法を記載する。この方法は、PDXの有用性を広げ、多数のPDXモデルにおける一過性または持続性外因性サイトカイン送達の選択肢を提供する。
Abstract
患者由来の異種移植片（PDX）マウスは、ヒト細胞を免疫不全マウスに移植することによって産生される。これらのモデルは、正常および悪性の造血のメカニズムを研究するための重要なツールであり、多くの悪性腫瘍の有効な化学療法を特定するためのゴールドスタンダードです。多くのマウスサイトカインもまたヒト細胞に作用するので、PDXモデルが可能である。しかし、これは、ヒト細胞の正常および悪性造血を研究するために重要な多くを含む、すべてのサイトカインの場合ではない。ヒトサイトカイン（トランスジェニックモデルおよびノックインモデル）を産生するようにマウスを操作する技術は、モデルの有用性が証明されるまでにかなりの経費を必要とする。他の技術は、労働集約的（組換えサイトカインまたはレンチウイルスの注射）であり、場合によっては、高度な技術的専門知識（DNAの流体力学的注射）を必要とする。このレポートは、外因性のヒトcyを有するPDXマウスを生成するための簡単な方法を記載しているこのサイトカインを過剰発現するように形質導入された間質の週1回の腹腔内注射を介して 、トキソプラズマ（TSLP、胸腺間質リンパ球ポエチン）この方法の使用はマウスの循環ヒトサイトカインの生理学的レベルを達成する連続サイトカイン産生のインビボ供給源を提供する。ヒトサイトカインの血漿レベルは、注入された間質細胞の数に基づいて変化させることができ、サイトカイン産生を実験の任意の時点で開始することができる。この方法はまた、同様に産生されるが、対照ベクターで形質導入された間質の腹腔内注射によって、サイトカイン陰性対照マウスを含む。我々は以前に、対照PDXと比較してTSLPを発現するPDXから採取した白血病細胞が元の患者のサンプルよりも遺伝子発現パターンを示すことを実証した。一緒に、この方法によって生成されたサイトカイン産生およびサイトカイン陰性PDXマウスは、我々が正常に使用したモデル系を提供する正常および悪性造血におけるTSLPの役割。
Introduction
患者由来異種移植片（PDX）は、「ネイティブ」哺乳動物環境において正常および悪性の造血細胞の産生を研究するための強力なin vivoモデルである。ほとんどの場合、PDXはヒトの細胞を免疫不全マウスに注入または移植することによって産生される。正常なヒト造血幹細胞を用いたPDXの産生は、正常なヒト血液および免疫細胞発生のインビボ研究を可能にする 。白血病または他の癌細胞から産生されたPDXは、発癌機構を研究し、ヒト集団に存在する遺伝的景観および突然変異の範囲に関連して有効な治療法を同定することを可能にする。結果として、PDXは、効果的な治療法を特定するための翻訳生物医学研究の現在のゴールドスタンダードであり、癌進行のメカニズムを理解するための重要なツールです。 PDXモデルは、特定の要因による健康格差の病気の研究を支援するための不可欠なツールです遺伝的病変、または患者の遺伝的景観の変化が発癌および治療結果に実質的に寄与し得る任意の疾患を含む。
多くのマウスサイトカインはマウスの中にある間にヒト細胞のサイトカイン受容体を活性化する際にヒト類似体を適切に模倣するので、マウス - ヒトPDXモデルが可能である。例えば、インターロイキン-7（IL-7）は、ヒトB細胞発生のための重要なシグナルを提供する。 2この場合、マウスIL-7は、マウスサイトカインがヒトB細胞前駆体のシグナル伝達経路を刺激するという、ヒトIL-7と十分な相同性を有する。 IL-3、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、幹細胞因子（SCF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の中でも特に、 、マウスおよびヒトサイトカインが低い相同性を示す場合、マウスサイトカインは、ヒト細胞上のそれぞれの受容体を活性化しない。この障害を克服するために、いくつかの戦略が使用されているPDXマウスにおけるヒトサイトカインの発現をエンジニアリングするために、組換えヒトサイトカインの注射、DNAの流体力学的注入、レンチウイルスの発現、トランスジェニック発現およびノックイン遺伝子の置換が含まれる。サイトカイン送達（ 図1 ）。
本明細書に示す方法において、PDXマウスは、ヒトサイトカイン、TSLPを発現するように、またはサイトカイン陰性対照として機能するように操作される。 TSLPを発現するPDXは、高レベルのヒトTSLPを発現するように形質導入された間質細胞の毎週腹腔内注射によって達成される。サイトカイン陰性PDX「対照」マウスも同様に操作される;対照間質は対照ベクターで形質導入される。この方法は、TSLP +間質を注射されたPDXマウスにおいてヒトTSLPの正常な生理学的レベルを達成する。サイトカイン陰性間質を受けるPDXマウスでは、検出可能なTSLPは観察されない。私たちは、ヒトの間質細胞株HS-27Aを培養で強く増殖し、共培養で単離した前駆細胞の増殖を支持しない非常に低いレベルのサイトカイン産生を示すので、本発明者らの研究に選択した。ヒトTSLP発現のために、間質には、先に説明した骨格9由来の先進的な自己不活性化レンチウイルスベクターを形質導入し、トランスジーン発現を増加させるためのcPPT / ctsエレメントおよびウッドチャック肝炎後転写調節エレメント（WPRE）を含む。ヒトTSLP遺伝子を伸長因子-1の制御下でこのベクターに構築した（EF-1）アルファプロモーターを使用して、強力な、構成的な、および長期の発現を達成する。
このヒト - サイトカイン増強PDXモデルの工学は、4つの主要なステップからなる。第1に、形質導入された間質をインビトロで拡大し 、安定した高レベルのサイトカイン産生のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価する。第二に、形質導入された間質細胞によって産生されたヒトサイトカインの活性（および対照間質からのサイトカイン活性の欠如）は、リン - フローサイトメトリーを用いて検証される。目的のサイトカイン（この例では、TSLP）に応答することが知られている細胞株を間質細胞上清と共にインキュベートし、サイトカイン誘導リン酸化についてアッセイする。第3に、形質導入されたヒト間質をマウスに注射し、次いで、マウス血漿をELISAによってヒトサイトカインのレベルについて毎週評価する。第4に、ヒト造血細胞を移植し、ヒトサイトカインのインビボでの機能的効果を、既知の標的（例えば、 間質細胞を介するヒトサイトカインの送達は、PDXマウスにおいてヒトサイトカインを送達/産生する他の方法と比較した場合、長所と短所の両方を提供する。ストローマ媒介性送達は、組換えヒトサイトカインの注射と比較して、一般に安価であり（間質細胞培養のコストは組換えサイトカインのコストよりも低い）、労働集約性はより低い（1週間に1回の注射と週に複数回の注射）。間質は外因性サイトカインを絶え間なく産生するので、短いサイトカイン半減期の問題も緩和される。 DNAの流体力学的注入によるサイトカインの送達は、間質を介する送達よりも安価であり得る。しかし、それは同様に一過性であり、間質媒介性送達に必要とされる単純な週1回の腹腔内注射よりも多くの技術的能力を必要とすることがある。マウスにおけるレンチウイルス遺伝子発現は、サイトカイン送達の新しい方法;しかし、私たちの手で生理学的TSLPレベルは達成されなかった。さらに、この方法は労働集約的であり、レンチウイルスベクターの連続生産を必要とする。トランスジェニックまたはノックインマウスは、サイトカインの安定した長期発現を提供し、組織特異的発現のために操作することができ、これは利点となり得る。他方、PDXマウスに必要な免疫不全マウスのバックグラウンド上のヒトサイトカイン遺伝子のトランスジェニック発現は、モデルの価値が確立される前に、膨大なリソースの投資を必要とする。さらに、トランスジェニックモデルは、一般に、サイトカイン開始のタイミングまたはインビボサイトカイン産生のレベルを変化させる選択肢を許容しない。これらは、間質細胞注入の開始時期または注入された間質細胞の用量を単に変化させることによって、間質媒介性送達によって達成することができる。 間質細胞媒介サイトカイン送達法本明細書中に詳述されたものは、正常なヒトB細胞発生4,6および高リスクB細胞急性リンパ芽球性白血病におけるTSLPの役割を評価するためのPDXを開発するために使用された。この方法は、TSLP以外のヒトサイトカインで類似のモデルを作製する際に使用するための代替サイトカイン送達方法を提供する。このモデルはまた、サイトカイントランスジェニックまたはサイトカインノックインPDXモデルの価値が相当な時間と費用を投資する価値があるかどうかを判断するのに役立つ予備的データを生成するのに有用であり得る。 
図1：マウスの外因性ヒトサイトカインを産生するように設計されたPDXモデル。 （ 1A ）設計実験および形質導入ヒト間質細胞の取得（ 1B ）ヒト細胞（造血幹細胞、白血病細胞など ）を入手してPDX（患者由来異種移植片）マウスを作製する。 （ 2A ）操作された間質を注入し、（ 2B ）ヒト細胞を実験スケジュールに従って免疫不全マウスに移植する。 （ 3A-B ）ストロマ上清およびマウス血漿中のサイトカイン濃度をELISAでモニターする。 （ 4 ）ヒト細胞を採取し、PDX中に存在するヒトサイトカインのin vivo機能的効果を評価する。 ここをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示します。
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Protocol
研究は、ローマリンダ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）および施設審査委員会（IRB）承認プロトコルに従って、すべての連邦ガイドラインに従って実施した。
注意：PDXおよびヒトの組織は、血液媒介病原体の伝播を防ぐために安全手順に従って取り扱う必要があります。
1.サイトカイン形質導入ストロマ細胞の培養と増殖
注：間質を継代するたびに、培養上清（1mLアリコート）を採取し、ELISAアッセイを介してサイトカインレベルの将来の定量化のために-80℃で保存する。
- 材料の表に記載されているように、R10培地と凍結培地を調製する。
- 10,11を生成するか、対照間質（空ベクターで形質導入）およびサイトカイン産生（TSLP +）間質を得る。使用するまで液体窒素（LN 2 ）で保存する12記載のようにストロマ細胞を解凍し、別のT-25細胞培養フラスコ中のR10培地5 mLにプレートする。37℃、5％ CO 2。これは解凍後「通過＃1」である。
- ストロマがコンフルエントになると（24〜48時間）、1×トリプシンEDTA（0.25％）を用いてトリプシン処理し、T-150培養フラスコに再プレーティングすることによって細胞を通過させる。これは解凍後の「継ぎ目＃2」です。
- ストローマがT-150フラスコ（3〜4日後）でコンフルエントになる場合、トリプシン処理により細胞を通過させる。この細胞懸濁液を実験的ニーズに使用する。
- 複数のフラスコへの細胞の拡大
- 収穫した細胞を3つのT-150フラスコに分け、コンフルエントになるまで培養する。ストロマ展開が必要な場合は、この手順を繰り返します。 T-150フラスコ中のコンフルエンスでの典型的なヒト間質（HS-27A）細胞数は約5×10 6である。
- セルストレージ
- 収穫した細胞懸濁液を円錐管に移し、500xgで5分間遠心分離し、上清を傾瀉し、凍結培地で細胞を再懸濁する。凍結し、バイアルあたりLN 2〜1.5×10 6個の細胞に保存する。
- マウスへの腹腔内ストロマ注射については、ステップ4.1に進む。
- 複数のフラスコへの細胞の拡大
2.形質導入された間質からのインビトロサイトカイン産生をモニターするためのELISAアッセイ
- 関心のあるサイトカインを検出するために、市販のELISAアッセイキットを購入する。
- 早期、中期および後期継代時に収穫された対照およびサイトカイン産生（TSLP +）間質からの間質細胞上清を解凍する（ 図2 ）。
- 上清サンプル中のTSLP濃度を、ELISAキットを用いて製造者の指示に従って決定する。 13これらの連続データを編集し、細胞培養中のサイトカイン産生の安定性をモニターする e（ 図2A-B ）。
- サイトカイン産生の間質の減少または準最適なサイトカイン発現だけでなく、保存中の任意の対応するバイアルを同定し、廃棄する（ 図2A-B ）。
- 安定した高レベルのサイトカイン濃度を示すサイトカイン産生ストローマを同定し、維持する。これらの解凍を実験に使用します。
- 安定したサイトカイン産生を確実にするため、または間質の場合はサイトカイン産生がないことを確実にするために、ELISAキットを使用して、細胞培養期間中、間欠的にストローマをモニターする（初期、中期および後期の解凍後の継代中に少なくとも1回） 。
間質によって産生されるサイトカインの活性を評価するためのホスホフローサイトメトリーアッセイ
注：個々の実験の間質生成サイトカインの関連する生物活性を確認するために、最初の実験の前に操作された間質からの上清を評価する。設計された間質が確認されたら、新しいベクターで生産された間質が導入されていない限り、さらなる試験は必要ではない。
- 適切な下流のリン酸化ターゲットを検出するために、MUTZ5および/またはMHH-CALL4白血病細胞株（TSLP反応性）、 14組換えヒトサイトカイン、およびリン酸化フローサイトメトリーアッセイでの使用が承認された抗体を購入する。
- 対照およびサイトカイン発現間質から上清を回収した。
- 96ウェル組織培養プレート中の0.2×10 6細胞/ウェルの濃度でR20培地（材料の表参照）中の白血病細胞株をプレートする。条件ごとに3つのウェルをプレートし、3回アッセイを可能にする。 37℃で2時間インキュベートする。この時間は、以前の培養条件の間に起こった任意のリン酸化の喪失を可能にする。
注：細胞株あたり12ウェルは、ステップ3.4に示される各実験条件について3回のアッセイを提供する。 <培養2時間後、各ウェルの細胞を4mLチューブに分注し、500xgで5分間、4℃で遠心分離します。上清を傾瀉する。 - 1）陰性対照培地のみ、2）飽和濃度での組換えサイトカインを含む陽性対照培地（15ngでTSLP）（以下の実験条件の各々について200μLで細胞を再懸濁する： / mL など ）、3）対照間質からのストローマ上清のコントロール、および4）サイトカイン産生間質由来のサイトカイン - ストローマ上清。
- 特異的な市販のリン酸化アッセイ（ 例えば 、TSLPに応答してMUTZ5またはMHH-CALL4中のリン酸化STAT5については30分）で指定された時間、細胞をインキュベートする。
- 4℃で5分間500 xgで遠心分離し、上清を傾瀉する。
- 製造業者のプロトコールに従ってリン酸化フローサイトメトリー染色を行い、フローサイトメトリーデータを収集する。 15
- フォワード（FSC、細胞サイズを示す）およびサイド（SSC、細胞細分性を示す）光散乱に基づいて無傷細胞上のゲート。
- 各サンプルのインタクトな細胞の中央蛍光強度（MFI）を決定する。ストローマ細胞上清の三重値から得られた平均MFIと、陽性および陰性の培地対照のそれとを比較する。
サイトカイン形質導入された間質のマウスへの注射
注：健康な細胞と適切なサイトカイン産生を確実にするためにマウスに注射する前に、最低3回の解凍後の継代でHS-27A間質を培養する。
- 間質の調製
- 収穫した間質細胞懸濁液を円錐管に移し、血球計数を10μLとする。トリパンブルーを用いて生細胞数を得る。 16残りの細胞を遠心分離する500×gで5分間、懸濁させる。
- ペレット化細胞から上清を吸引し、マウス注射のために必要な量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に細胞を静かに再懸濁する（注射するマウスの数に依存する）。
注：マウス注射のための典型的な間質細胞濃度：200μLのPBS中、マウスあたり0.5×10 6〜5×10 6細胞。 - 間質細胞懸濁液を注射直前まで4°C（または氷上）に保ちます。細胞懸濁液は、少なくとも室温（RT）（〜25℃）でマウス注射用であることを確認してください。
- 間質細胞注入
- 生物安全フードを消毒し、注射用の材料を組み立て、マウスケージを内側に置きます。
- ツベルクリン注射器に200μLを集める前に、細胞懸濁液を静かに混合する。
- 標準的な腹腔内注射技術を用いて、 17マウスを拘束し、200μLの細胞懸濁液を腹膜腔に投与する。詳細は以前にMachholz et al。 18
5.マウスにおける外因性ヒトサイトカインの連続採取と血漿モニタリング
- テール・スニップによる血液収集
- バイオセーフティフードを消毒し、手順のためにマウスの拘束具、はさみ、および他の道具/消耗品を集める。
- マウスを拘束具に置き、マウスの動きを最小限に抑えるためにチューブを固定します。
- 尾および外科用はさみをイソプロピルアルコールで消毒する。尾に局所麻酔クリームを塗布する。
- 非常に鋭い外科用ハサミを使用すると、マウスの尾の先端の約0.5〜1mmを切断する。ヘパリン処理された毛細血管を使用して約80μLの末梢血を収集する。
注：この方法で血液が採取される場合、6回以上mes、tail除去は、削除されたtailの量に関して控えめでなければなりません。尻尾が上がるにつれて直径が大きくなり、出血が早くなり、治癒に時間がかかります。
- 血漿分離
- バルブシリンジを使用して（キャピラリーチューブから血液を排出するために）標識されたK 2 EDTAマイクロテナーチューブに血液を移す。凝固を防ぐために20回転倒させる。
注：通常、テールニップからの血液凝固は速い。しかし、出血が〜2分以上持続する場合、凝固を助けるためにスタティックペンシル/パウダーを使用する。 - 製造者の指示に従って血液採取管を遠心分離し、ELISAアッセイの準備が整うまで保存用の血漿（-20℃）を分注する。
- マウス - ヒト細胞キメラデータがマウス血液から必要とされる場合、ステップ6.3.1に記載されているように残りのペレットを処理する。そうでなければ、血球ペレットを捨てる。
- バルブシリンジを使用して（キャピラリーチューブから血液を排出するために）標識されたK 2 EDTAマイクロテナーチューブに血液を移す。凝固を防ぐために20回転倒させる。
- ミクロ容積に対する改変ELISAマウス血漿のume
注：メーカーのELISA手順をマウスから採取したマイクロボリュームを収容するために推奨される100μLサンプル量から40μL容量に変更しました。これらの限られた容量では、インビボマウス血漿サンプルを三重に操作することは不可能である。実験の終了時に、500μLの死後の血液を心臓穿刺により採取する。 100μLの安楽死血漿中で評価されたサイトカイン濃度を用いて、各マウスの40μL のin vivoデータを検証する。- 凍結マウス血漿サンプルを解凍する。
- 連続的にELISA標準液を希釈し、1ウェルあたり40μLで3回プレートする。
- 各マウス血漿サンプル40μLをELISAプレートに加える。
注：マウスサンプルが40μL未満の場合は、ELISAバッファーで最大40μLにしてください。この希釈液の量を記録し、希釈した各試料の希釈係数を計算するために使用します。いつELISAデータを分析することにより、希釈サンプル濃度にサンプルの希釈率を乗じて、元のサンプル中の実際のサイトカイン濃度を決定する。 - 製造者の指示に従って完全なELISAアッセイ。
6.造血細胞のマウスへの移植
- 移植のために骨髄を治癒するための致死的照射
注：Loma Linda University（LLU）はCobalt-60放射源を使用しています。動物は、20×20cmの野で放射線源から80cm、拘束具の上に0.5cmのLexan層を置いたパイ拘束具に置く。最新の較正線源（この線源については現在2〜3分）に基づいて225cGy線量を達成するように曝露時間が計算される。- 致死量以下のマウスに照射する（免疫欠損マウスでは最大225cGyの全身照射線量）。
- 24時間後に造血細胞を移植する。/ em>静脈内尾静脈注射。
- 静脈内造血細胞移植
- CD34 +造血幹細胞（HSC）：マウス1匹あたり1×10 5〜5×10 5個の細胞および白血病細胞株/患者サンプル：1×10 6〜1×10 6個のマウスの滅菌PBS200μLの容量で移植用ヒト細胞懸濁液を調製する。 1マウスあたり5×10 6個の細胞。
- 移植直前まで細胞を4°C（氷上輸送）に保つ。細胞が移植前に少なくともRTであることを確認する。
- 生物安全フードを消毒し、移植注射用のフードエリアを準備します。
- 尾静脈の拡張を可能にするために、少なくとも5分間、加温ケージにマウスを置く。
- 静かに細胞懸濁液を混合し、200μLをツベルクリン注射器に入れる。ニードルを無菌のままにしておき、安全に針を脇に置いてください。
- マウスを拘束具に置き、イソプロピルアルコールで尾を消毒する</ li>
- 標準的な静脈注射技術を用いて、ヒトの細胞懸濁液をマウスの尾静脈に注入する。
注：尾静脈注射は、特に初心者の動物ハンドラーの場合、いくつかの試みが必要です。 KovacscicsとRaperのJoVEビデオ19は、この動物技術の詳細なデモンストレーションを提供します。 - マウスの回復を約5分間モニターする。注射中に有害事象があれば記録する（ 例えば、こぼれた細胞、重大な出血、過剰な尾の外傷）。
- マウス末梢血におけるヒト細胞キメラの解析
- 血漿分離（ステップ5.2.3）の後、マイクロテナーチューブに残っている血球ペレットを得る。
- 赤血球（RBC）溶解のために、残った血液ペレットを、血漿が除去された（血漿量を置換する）のと等しい量のPBSに再懸濁し、よく混合する（ボルテックス/ピペット）。
- それぞれの再懸濁した血液サンプルを標識した4mLチューブに移す。各チューブにRBC溶解バッファーを1：9の比で加えます（再懸濁した血液100μLのRBC溶解バッファー900μL）。 RTで5分間インキュベートする。遠心分離機（5分間、500×g）およびデカント。
- 2回目のRBC溶解バッファーインキュベーションを行います（室温で5分間）。以前と同じように遠心分離機にかけてください。
- 約1mLのPBS中の残りの細胞を洗浄する。以前と同じように遠心分離機にかけてください。
- ペレットを、標準的なフローサイトメトリー染色に適したPBSの容量に再懸濁する（これは、製造業者および個々のラボプロトコールに従って異なる）。 20マウス細胞（マウスCD45 +）およびヒト細胞（ヒトCD45 +）を同定するために、フローサイトメトリー用に検証された免疫表現型検査用抗体を使用する6,21 関心対象の細胞系統に特異的な追加のヒト白血球マーカーを含む。
注： "プールされたサンプル"を作成するには、各マウスサンプルから少量（5μL〜20μL）を取ることをお勧めします;無染色、生存率、およびアイソタイプコントロールサンプルに使用します。それぞれの実験条件に対して染色されていないアイソタイプコントロールを持つことがベストプラクティスです。
インビボサイトカイン活性の機能評価
- マウス安楽死および組織収穫
- 所定の実験時点でCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。
- 心臓穿刺によって血液を採取し、ステップ5.2.1〜5.2.2のように血漿を採取する。
注：他の組織の前に血液を採取するのは、死亡直後に凝固を開始するためです。 - ステップ5.2.2のように、マウス血液、アリコートおよび貯蔵血漿を処理する。
- 後で、安楽死時に得られた血漿中の外因性サイトカイン濃度を ELISAにより製造業者のプロトコールに従って評価する。 インビボでのマウス血漿中の外因性サイトカイン濃度を評価して比較する血液採取および安楽死の血漿サンプル（セクション5.3に記載）。
- 残りの血液サンプルにPBSを加えて、血漿量を置き換え、ステップ6.3.1および6.3.2に記載されているように処理する。直ちにフローサイトメトリーアッセイを実施するか、またはLN 2保存のために凍結培地に細胞を再懸濁する。
- PDXマウスから骨髄（BM）および脾臓を採取し、前述のように単細胞懸濁液を調製する。 22
- 1：1の希釈でメチレンブルー（溶解細胞膜およびRBCは生存細胞の無傷の核を残す）を有する3％酢酸を用い、血球計数器を用いて細胞を計数することにより、各PDXマウス組織サンプルの細胞数を得る。各動物の骨髄および脾臓サンプルの総細胞数を表にする。
- 細胞懸濁液（500xg、15分）を遠心分離し、上清をデカントする。直ちに骨髄細胞および/または脾臓細胞のフローサイトメトリーアッセイを実施するか、LN細胞の凍結培地に再懸濁する。サブ2ストレージ。
注：10個のBMアリコート（将来の生化学アッセイ用）および〜5個の脾臓アリコート（将来のPDX移植用）をマウス1匹につき固定する。 - インビボにおける機能的効果を同定するための免疫表現型解析
- 目的のサイトカインに応答する免疫表現型造血集団およびアイソタイプ対照抗体の第2のMM（ 図5および表の表）に対するフローサイトメトリー抗体の1つのマスターミックス（MM）を調製する。
- ステップ7.4で調製したPDX組織アリコート（37℃ビーズバス）を解凍する。
- 解凍された細胞をコニカルチューブに移し、少なくとも3倍量のPBSを加えることにより洗浄する。遠心分離（500×g、5分）し、上清を傾瀉する。
- 洗浄工程（7.5.3）を繰り返します。
- 無染色対照、生存率コントロール、およびアイソタイプ対照について、各PDXサンプルから約10μL〜20μLの細胞を採取することによりプールされたアリコートを作成する（6.4.6節参照）。あなた以外のすべてのサンプルを染色する固定可能な生存能力のある色素（死細胞マーカー）でインキュベートし、メーカーのプロトコールに従って洗浄する。
- 標準的なフローサイトメトリー染色プロトコールに従って、各PDX細胞サンプルを表現型決定MMで染色する。アイソタイプ-MMでプールされたアイソタイプ対照サンプルを同様に染色する。すべてのサンプルをインキュベートし、PBSで洗浄し、1％パラホルムアルデヒドで再懸濁してサンプルを固定する。
- フローサイトメトリーデータを収集し、目的の細胞集団に適したゲーティング戦略を用いてデータを分析する（ 図5 ）。典型的なゲーティングは次のとおりです。
- 破片を除くFSCおよびSSCゲートを描くことによって、無傷の細胞を定義する。
- 死細胞マーカー（これは「全生存細胞」）に対して陰性である細胞をゲーティングすることによって、生存細胞集団を同定する。
- 「全生存細胞」内のサブゲートを使用して、所望の免疫表現型を有する細胞ポピュレーションを定義する（図5参照）。
- 取得するフローサイトメトリー分析からの全生存細胞数内のサブセット細胞集団の頻度。 6,21
- 全生細胞（ステップ7.5.6.4で得られたもの）内のB細胞サブセットの頻度に、ステップ7.3で得られた組織あたりの生存細胞総数（％B細胞サブセットx "）を掛けて、各組織における標的細胞の数を計算する。血球計数細胞数」; 表1参照）
- 対照PDXマウスとサイトカイン発現（TSLP +）PDXマウスとの間の標的細胞集団の細胞数を比較して、外因性ヒトサイトカインのin vivo機能的効果を決定する（ 表1 ）。
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Representative Results
モデルの概要を図1に示します。サイトカイン産生（TSLP +間質）およびコントロールストロマが得られたら、それらを培養で増殖させる。マウスにストローマを注入する前に、間質細胞上清をELISAで評価してサイトカイン産生を確認し（ 図2 ）、ホスホフローサイトメトリー（Protocol＃3）を用いて間質によって産生されるサイトカインの活性を確認する。細胞を継代すると、コンフルエント間質細胞培養物（対照支質およびTSLP +間質）から上清が収集される。 ELISAを用いて、初期、中期および後期継代の間に少なくとも1回、上清中のTSLPの濃度をモニターする。対照間質由来の代表的なデータを図2Aに示す 。 TSLPの発現を示すストローマ細胞培養物（およびそれらから冷凍されたバイアル）は廃棄する必要があります。検出されないTSLPを有する対照培養物は、将来の使用のために拡大および凍結される。図2Bに示すように、低レベルのTSLP産生を示すTSLP +間質の培養物（およびそれらから冷凍されたバイアル）は廃棄される。サイトカインの安定した高レベル産生を示すTSLP +間質は、将来の実験に使用するための増殖および保存のために選択される。コントロールおよびTSLP +間質の複数の培養物からの上清中のTSLPの平均レベルを図2Cに示す 。
ヒトサイトカインを用いた対照PDXマウスの作製の実験的タイムラインを図3に示す 。ストローマ細胞培養を移植の3週間前に開始し、 インビトロでの ELISAアッセイを、培養上清中のTSLP産生を図2に記載のように実施する。マウス血漿中のインビボヒトTSLPを「改変ELISA forプロトコル＃4に記載されている「マウス血漿のマイクロボリューム」を参照のこと。ペリフェラ血漿と血漿を同時に採取し、「マウス末梢血におけるヒト細胞キメラの分析」のプロトコル＃6に記載されているようにアッセイする。対照間質を注射されたPDXは、一貫して、検出のための閾値以下である血漿ヒトTSLPレベルを示した（ 図4A ）。 TSLP +間質を注射されたPDXマウスにおけるTSLPの血漿レベルは、前の1〜2週間に注射されたTSLP +間質細胞の数に比例する。間質細胞の注射が中止されると、TSLPの血漿レベルが急速に低下する。 図4Bに見られるように、毎週0.5×10 6個の TSLP +間質（培養上清中の平均> 1,000pg / mLのTSLPを産生する）の週1回の注射により、生理学的レベルの下限近くの血漿TSLPレベルが得られた（約5-10pg / mL ）。 PDXマウスにおける5×10 6個の TSLP +間質の週1回の注射により、高生理学的レベル（〜35pg / mL）に達する血漿TSLPレベルが得られた
TSLPは、正常ヒトB細胞前駆体の産生を増加させることが示されている。したがって、TSLPのin vivo機能を評価するために、本発明者らは、 図5および表1に示されるように、造血幹細胞を移植された対照およびTSLP + PDXマウスにおける正常ヒトB細胞前駆体のイオン。 図5Aは、ヒトB系統細胞のサブセットを同定するために使用される免疫フェノタイピングのためのゲーティングフローサイトメトリーを示す。 1つのコントロールPDXと1つのTSLP + PDXの各サブセットのセル数を列挙するサンプル計算を表1に示します。図5Bに示すように、B系細胞は対照PDXと比較してTSLP +において有意に増加し、この増加は最も初期のB細胞前駆体（プロB細胞）で始まる。非B系統細胞の数は、対照とTSLP + PDXとの間で有意に異ならなかった（データ示さず）。このアッセイは、TSLP + PDX においてインビボで産生されたヒトTSLPが標的細胞集団に対してin vivo機能的効果を発揮することを確認する方法を提供する。
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図2： 間質上清中のTSLPサイトカイン濃度をモニターするELISA。 ELISAアッセイを使用して、以下の細胞継代の間に少なくとも1回、対照間質（対照ベクターで形質導入された）およびTSLP +間質（ヒトTSLPを発現するように形質導入された）から上清中のTSLP濃度を測定した：早期（継代1-5）、中継6-12）、および後期（継承13-20）。ここで用いたヒトTSLP ELISAアッセイの検出閾値は、1.9pg / mL（赤色の破線）である。 （ A ）対照間質は、最小限検出可能なヒトTSLP濃度を産生する;これらのレベルは、一般に、実験期間中のELISA検出閾値未満である。増加するTSLP濃度（> 15pg / mL）を示す培養物中の対照間質は、その培養物から凍結されたすべてのアリコートと共に廃棄される。 （ B ）ヒトTSLP産生は、differenTSLP +ストローマ（ n = 9）のバイアルを解凍し、培養期間全体を通して。サイトカイン産生の低下または不安定性を示すTSLP間質（TSLP <1,000 pg / mL）も廃棄されます。 （ C ）対照（緑）およびTSLP +（青）間質（平均および95％信頼区間）の平均TSLP濃度。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3： 外因性ヒトサイトカイン産生を有するPDXマウスを作製するための実験的タイムライン。 実験のインビトロおよびインビボ部分は同時に進行する。コントロールおよび+ TSLPストローマ細胞培養は、造血細胞移植の2〜3週間前に開始され、最初の細胞継代の前に最小3回の細胞継代を確実にする（atWk-1）を投与した。これは、間質細胞が健康で増殖性であり、適切なサイトカインレベルを産生することを確実にする。細胞を継代し、ストリーマ上清中のTSLP濃度（ 図2参照）を決定するためにELISAアッセイを使用する場合、上清アリコートを収集する。 1日目にヒト造血細胞移植の1日前に、0日目に動物に照射する.1週間目の採血の1週間後から2週間後に採血を開始する。この時点で、外因性ヒトサイトカイン濃度は、改変ELISAアッセイを用いてマウス血漿中で検出可能であるべきである（ 図4 ）。実験のエンドポイントはヒト細胞移植の5〜16週間後である。これは、マウス末梢血で検出されるヒト細胞キメラの量に依存する。正常な造血は、典型的には5〜7週目までに確立され、白血病細胞のキメラシスは細胞株と初代サンプル（3-16週）とで異なる。 PDX移植の成功と進行はまた、移植で注入されたヒト細胞の数に依存する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4： マウス血漿における生理学的ヒトTSLPサイトカイン濃度の達成。マウスに、形質導入された細胞の毎週の腹腔内注射（200μL）を受け、その血漿を収集して、経時的にマウスにおけるインビボでのヒトTSLP濃度（ELISAアッセイ）を評価する。 「 TSLP +低」（低TSLP間質用量）マウスは0.5×10 6個の TSLP +間質細胞を受け、「TSLP +高」（高TSLP間質用量）マウスは5×10 6個の対照間質細胞を受けた6つの TSLP +ストロマ細胞を毎週投与する。ヒトTSLP ELISAアッセイ検出閾値は1.9pg / mL（赤い破線）であり、TSLPのヒト生理学的範囲は約5〜35pg / mL（灰色の陰影）である。 （ A ）「対照」マウス血漿は、一貫してTSLPレベルが5pg / mL以下、またはELISA検出閾値未満である。 （ B ）「TSLP +低」マウス血漿は、TSLPの生理的レベルが低いことを示す; （ C ）「TSLP +高」マウス血漿は高い生理学的レベルを示す。 （ D ）各実験群の平均TSLP濃度（全てのマウスおよび時間点の平均±SEM）は、マウス血漿中に検出されたTSLPレベルが、受けた間質用量に比例することを示す;対照マウス血漿レベルはELISA検出閾値未満であり、「TSLP +高」血漿レベルは「TSLP +低」マウス血漿レベルより4倍高い。">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5： 正常なヒトB細胞集団のアッセイは 、PDXマウスにおける外因性ヒトTSLPの インビボでの 機能的効果を確認する。 PDXマウスを対照およびTSLP +間質で操作し、臍帯血から単離したヒトCD34 +細胞を移植した。フローサイトメトリーによる免疫表現型測定を使用して、コントロールおよびTSLP + PDXから採取した骨髄中のヒトB細胞前駆体のサブセットを以下のように同定した：採取した骨髄を解凍し、固定可能な生存性色素で染色し、ヒトCD45、CD19、CD34、 κおよびλ軽鎖、および表面IgDおよびIgM、または細胞内IgM（cμ）のいずれかである。 （ A ）総生菌数生存マーカーに基づいてゲートされた。連続的なプロットは、発達的に連続するB系統サブセット（TSLP + PDXのデータが示されている）を同定するための後続のゲートを示す。 （ B ）全生存細胞内の各サブセットの頻度をフローサイトメトリーソフトウェアにより決定し、各B細胞サブセット中の細胞数を計算した。 （表1参照）。対照（黒、 n = 3）およびTSLP +（青、 n = 5）PDXマウスの各B細胞サブセットの細胞数をグラフ化する。 （平均±SEM、* p <0.05、** p <0.01、**** p <0.0001）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| ヒト細胞集団 | Freq。トータルリビング細胞 | 生きている細胞数in BM | 集団内の＃細胞 |
| コントロールマウス | |||
| 全生存細胞 | 100.00％ | 39.5×10 6 | 39.5×10 6 |
| hCD45 + | 98.50％ | 39.5×10 6 | 38.9×10 6 |
| 合計CD19 + | 27.20％ | 39.5×10 6 | 10.7×10 6 |
| プロB | 24.20％ | 39.5×10 6 | 9.56×10 6 |
| プレB | 1.70％ | 39.5×10 6 | 0.68×10 6 |
| 未熟なB | 0.83％ | 39.5×10 6 | 0.33×10 6 |
| 成熟したB | 0.68％ | 39.5×10 6 | 0.27×10 6 |
| TSLP +マウス | |||
| 全生存細胞 | 100.00％ | 72.0×10 6 | 72.0 x 10 6 |
| hCD45 + | 99.30％ | 72.0×10 6 | 71.5×10 6 |
| 合計CD19 + | 65.10％ | 72.0×10 6 | 46.8×10 6 |
| プロB | 60.20％ | 72.0×10 6 | 43.3×10 6 |
| プレB | 2.70％ | 72.0×10 6 | 1.92×10 6 |
| 未熟なB | 1.60％ | 72.0×10 6 | 0.11×10 6 |
| 成熟したB | 0.40％ | 72.0×10 6 | 0.29×10 6 |
表1：PDX骨髄における正常ヒトB細胞サブセットの頻度およびカウント。全生存細胞内の各B細胞サブセットの頻度（％）をフローサイトメトリー分析（ゲーティング戦略については図5Aを参照）によって決定した。 1つのコントロールPDXマウス（5×10 6細胞/週を受けたコントロール間質注射）および1つのTSLP + PDXマウス（TSLP間質注射、5×10 6細胞/週を受けた）からの代表的な骨髄（BM）安楽死時に全生存BM細胞数を記録し、免疫表現型フローサイトメトリーを用いてサブセット頻度（％）を評価し、各B細胞サブセット集団のサイズを計算した（サブセット細胞カウント= "tot「生存細胞」「サブセット頻度」）。
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Discussion
この原稿は、外因性ヒトサイトカインを発現するようにPDXを工学するための、単純で、迅速で、比較的費用対効果の高い方法を記載している。ここに記載されている戦略は、ヒトサイトカインであるTSLPを発現するように形質導入されたストローマ細胞株の毎週腹腔内注射に基づく。本明細書に記載の方法を実施する前に、高レベルの目的のサイトカイン（TSLP）を発現するように操作されたストローマおよび同様に操作された対照間質が生成された。ここに提示されるプロトコールでは、間質を培養中で増殖させ、経時的に（または対照間質の場合にはサイトカイン産生がない場合）安定した高レベルのサイトカイン産生を提供する能力についてスクリーニングする。ストローマ生成サイトカインの活性を検証するためのアッセイを実施し、生理的ヒトTSLP（およびヒトTSLPを欠く対照マウス）を用いてPDXを産生するために間質細胞注入の実験的タイムラインを開発した。ヒトTSLPの血漿レベルをモニターするための手順およびサイトカイン応答性細胞集団に対するインビボでのその機能的効果を確認するための実験を行った。
ここに提示されたプロトコールで使用される間質細胞およびベクターを選択するには、いくつかの要素を考慮する必要があります。間質細胞系は、内在的に高レベルのサイトカインを産生すべきではなく、目的のサイトカインに応答すべきではない。ここでの研究のために、ヒト骨髄間質細胞系HS-27Aを選択した。なぜなら、低レベルのサイトカイン産生培養で強く増殖するからである。本明細書に記載の方法はまた、TSLP + PDXと同じ間質で操作されたが、TSLPの過剰発現はない「対照」PDXも含む。 TSLP +および対照PDXの結果を比較することにより、内在性間質細胞サイトカイン産生による影響を制御することができます。蛍光タンパク質または他の選択可能なマーカーを含むベクターによる間質細胞の形質導入は、細胞を単離するのに役立ち得るatは興味のあるサイトカインを過剰発現する可能性が高い。しかし、マウスのインビボ血漿サイトカインレベルは、間質細胞上清中のサイトカイン濃度、および、上皮細胞上の注入された間質の数と相関するため、間質細胞によって産生されるサイトカインのレベルを決定するためにサイトカイン上清をアッセイすることが不可欠である。 （ 図4 ）。
間質によって産生されるサイトカインの活性がPDX研究の前に確認されることが重要である。我々は、TSLPに応答する細胞においてTSLP刺激の下流でリン酸化された分子についてアッセイするためにリン酸化フローサイトメトリーを使用した。 TSLPは、JAK-STAT5およびPI3 / AKT / mTOR経路を活性化する。 MUTZ5およびMHH-CALL4白血病細胞株は、高レベルのTSLP受容体成分を発現し、TSLP刺激後の下流STAT5、AKTおよびリボソームタンパク質S6リン酸化を示す。 14ここでは、phopho-flow cytometryTSLP刺激の下流に誘導されるSTAT5（pSTAT5）のリン酸化を評価した。以前の研究では、TSLPにより刺激されたリン酸化事象、リン酸化AKT（pAKT）およびリン酸化リボソームタンパク質S6（pS6、mTORの下流）についてさらに評価した。結果は、pAKTアッセイがより感度が低く、pS6がpSTAT5アッセイより感度が高いことを示した。リン酸化アッセイを実施する場合、反応性細胞は、陽性対照としての飽和レベルの組換えヒトTSLPおよび陰性対照としての培地のみ（サイトカインなし）で培養されるべきである。対照間質由来の上清は、TSLPが対照間質によって産生されないことを（ELISAに加えて）検証する第2の手段として、TSLP +間質の側に沿ってアッセイすべきである。これは、内在性サイトカイン産生がTSLP +細胞のアッセイで観察されたリン酸化の原因でないことを保証するための対照としても役立つ。理想的には、サイトカイン産生ストロマサンプルから誘導されるリン酸化は、それは、上清中のサイトカイン濃度が飽和陽性対照中の濃度よりも低い場合にはより低くなる可能性があるが、組換えサイトカイン状態で観察することは困難である。 TSLP +間質についてELISAによって観察されたレベルと一致する組換えTSLPレベルを有する陽性対照は、良い選択肢である。
インビボでのサイトカイン活性の既知の機能的指標を同定することは困難であり得る。 インビボでの外因性ヒトサイトカインによって誘導されるリン酸化が組織収穫中に急速に失われる可能性があるため、リン酸化のアッセイは可能ではない可能性がある。 TSLPは、ヒトB細胞前駆体の産生を増加させることが示されているので、フローサイトメトリー免疫表現型解析を用いたヒトB細胞前駆体集団におけるインビボ増加をアッセイすることにより、TSLPのPDXにおける機能的効果を確認した。別の戦略は、サイトカイン誘導性遺伝子発現の変化および比較をアッセイすることであり得るサイトカイン発現PDXからコントロールPDXからの細胞へと収穫された細胞における発現。 6
PDXにおけるヒトサイトカイン発現の最終目標は、患者に存在するインビボ環境をより詳細にモデル化する前臨床モデルを生成することである。これは、対照PDXおよびサイトカイン発現（TSLP +）PDXから単離したヒト組織における全ゲノム発現を元の患者サンプルと比較することによって試験した。これらの研究は、患者サンプルにおける遺伝子発現が、対照よりもTSLP + PDX由来の白血病細胞に有意に近いことを示した。しかし、我々の研究はリンパ球形成に焦点を当てている。マウスで産生されるいくつかの骨髄性促進サイトカインは、それらのヒト受容体対応物を活性化しない。この問題に対処するヒトサイトカインノックインマウス（NSGSマウスなど）が存在する。実際、我々がここで述べるモデルの1つの価値は、NSGSマウスでより多くクローズするモデルを作成するために使用できるということですは、骨髄増殖性ヒトサイトカインに加えてTSLPを発現することにより、ヒトin vivo環境をモデル化する。他方、サイトカイン+/-系は、これらの骨髄性促進サイトカインのそれぞれについて本明細書に記載の方法を用いてNSGマウスにおいて生成され得る。このモデルは、骨髄球および/または骨髄性白血病におけるそれらの各々の正確なin vivo役割を研究するために使用され得る 。
生理学的レベルのヒトTSLPを産生する操作されたPDXは、古典的PDXよりも患者に存在するin vivo環境をより厳密に模倣する前臨床モデルを提供する。同様に操作された対照PDXマウスの作製も記載されている。 Togetherコントロールとサイトカイン産生PDXは、正常および悪性ヒトB細胞のインビボ産生におけるTSLPの役割を評価するために首尾よく使用されたヒトTSLP +/-モデル系を作製する。 4、6これモデルは、CRLF2の過剰発現をもたらす遺伝的変化を特徴とするB細胞急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）の特定の高リスク型の研究に非常に関連している。 CRLF2はTSLPサイトカインの受容体であり、したがってTSLP誘導性のCRLF2シグナル伝達は、CRLF2 + B-ALLの発癌および進行に寄与する可能性が高い。この疾患を研究するためにPDXを使用することは、PDXが患者の遺伝的背景に照らして白血病を研究することを可能にするため、特に重要です。疾患原因としての遺伝的景観は、CRLF2 + B-ALLに強く関与しており、これはヒスパニック/ラテンアメリカの子どもよりも5倍多い頻度で発生し、ダウン症候群患者のB-ALL症例の半数を占めています。ここに記載されているようなヒトTSLPを発現するPDXモデルは、CRLF2 + B-ALLの疾患メカニズムを理解し、正常な造血を理解するための重要なツールとなる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
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