Summary
מתואר כאן היא שיטה לייצור ציטוקינים אקסוגניים בעכברים xenograft (PDX) נגזר החולה באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של צינוקין transduced transromal שורה התא. שיטה זו מרחיבה את התועלת של PDX ומספקת את האפשרות עבור משלוח ציטוקינים אקסוגני חולף או מתמשכת במספר רב של מודלים PDX.
Abstract
עכברים שמקורם בחולה (PDX) שמקורם בחולה מיוצרים על ידי השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. מודלים אלה הם כלי חשוב לחקר המנגנונים של hematopoiesis נורמלי וממאיר והם תקן הזהב לזיהוי chemotherapies יעיל עבור ממאירות רבות. מודלים PDX אפשריים כי רבים של ציטוקינים העכבר גם לפעול על תאים אנושיים. עם זאת, זה לא המקרה עבור כל ציטוקינים, כולל רבים כי הם קריטיים לחקר hematopoiesis נורמלי וממאיר בתאים אנושיים. טכניקות כי מהנדסים עכברים לייצר ציטוקינים אנושיים (מהונדס ודפיקות- in מודלים) דורשים הוצאה משמעותית לפני התועלת של המודל הוכח. טכניקות אחרות הן עבודה אינטנסיבית (הזרקה של ציטוקינים רקומביננטי או lentivirus) ובמקרים מסוימים דורשים רמות גבוהות של מומחיות טכנית (הזרקת הידרודינמית של דנ"א). דוח זה מתאר שיטה פשוטה ליצירת עכברים PDX כי יש אקסוגני האדם cyTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של stroma כי כבר transduced כדי overexpress זה ציטוקינים. השימוש בשיטה זו מספק מקור vivo של ייצור ציטוקינים רציפה כי משיגה רמות פיזיולוגיות של ציטוקינים האדם במחזור העכבר. רמות פלזמה של ציטוקינים אנושיים יכולים להיות מגוונים על סמך מספר התאים סטרומה מוזרק, ייצור ציטוקינים יכול להיות יזם בכל נקודה בניסוי. שיטה זו כוללת גם עכברים שליטה שלילית ציטוקינים המיוצרים באופן דומה, אבל באמצעות הזרקה intraperitoneal של stroma transduced עם וקטור שליטה. יש לנו הוכיחו בעבר כי תאים לוקמיה שנקטפו TSLP- להביע PDX, לעומת שליטה PDX, התערוכה ביטוי ביטוי הגן יותר כמו המדגם המטופל המקורי. יחד ציטוקינים בייצור ו- cytokine שלילי עכברים PDX המיוצרים על ידי שיטה זו מספקים מודל המערכת שבה השתמשנו בהצלחה ללמוד אתתפקיד TSLP ב hematopoiesis רגיל וממאיר.
Introduction
המטופל נגזר xenografts (PDX) הם חזקים מודל vivo לחקר הייצור של תאים hematopoietic הממאירים נורמלי בסביבה יונקים "יליד". לרוב, PDX מיוצרים על ידי הזרקת או השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. הייצור של PDX באמצעות תאי גזע האדם hematopoietic רגיל מאפשר במחקרים vivo של דם אדם נורמלי ופיתוח תאים החיסון. PDX המיוצר מלוקמיה או תאי סרטן אחרים מאפשרים ללמוד מנגנונים oncogenic ולזהות טיפולים יעילים בהקשר של מגוון של נופים גנטיים ומוטציות הנוכחי באוכלוסייה האנושית. 1 כתוצאה מכך, PDX הם תקן הזהב הנוכחי עבור מחקר ביו-רפואי translational כדי לזהות טיפולים יעילים וכלי חשוב להבנת מנגנוני התקדמות סרטן. מודלים PDX הם כלי חיוני כדי לסייע במחקר לתוך מחלות פערים בריאותיים עקב ספציפיות נגעים גנטיים, או כל מחלה שבה הווריאציות של הנוף הגנטי של המטופל יכולות לתרום באופן משמעותי לאונקוגנזה ולתוצאות הטיפול.
עכבר האדם מודלים PDX אפשריים בגלל ציטוקינים רבים העכבר כראוי לחקות האנלוגים האנושיים שלהם הפעלת קולטנים ציטוקינים של תאים אנושיים בזמן שהם בתוך העכבר. לדוגמה, אינטרליוקין -7 (IL-7) מספק אות קריטי לפיתוח תאי B. 2 במקרה זה, עכבר IL-7 יש מספיק הומולוגיה עם IL-7 האנושי כי ציטוקין העכבר מגרה נתיבי איתות בבשר מבשר התא האנושי. 5 , 6 , אשר בין ציטוקינים אחרים (IL-3, גרנולוציטים-מקרופאג מושבה גורם מגרה (GM-CSF), גורם תא גזע (SCF) ,Ref 7 "חשוב לייצור תאים הומאופויטים נורמליים וממאירים, כאשר ציטוקינים של עכברים ושל בני אדם מציגים הומולוגיה נמוכה, הציטוקינים של העכבר אינם מפעילים את הקולטנים שלהם על תאים אנושיים.כדי להתגבר על מכשול זה, נעשה שימוש במספר אסטרטגיות כדי להביע את הביטוי של ציטוקינים אנושיים בעכברים PDX.זה כולל הזרקה של ציטוקינים אנושיים רקומביננטי, הזרקת הידרודינמית של דנ"א, ביטוי lentiviral, ביטוי מהונדס תחליף הגן knockin 7. דוח זה מתאר שיטה להנדסה PDX לייצר ציטוקינים אנושיים באמצעות stromal בתיווך משלוח ציטוקינים ( איור 1 ).
בשיטה הפגינו כאן, עכברים PDX מתוכננים להביע את הציטוקין האנושי, TSLP, או לשמש שולטת ציטוקינים שלילי. TSLP- להביע PDX מושגות על ידי זריקות intraperitoneal שבועי של תאים stromal כי כבר transduced להביע רמות גבוהות של TSLP האדם.ציטוקינים שלילי PDX "שליטה" עכברים הם מהונדסים באופן דומה; אם כי stroma שליטה transduced עם וקטור שליטה. שיטה זו משיגה רמות פיזיולוגיות נורמלי של TSLP האדם בעכברים PDX מוזרק עם stroma TSLP. לא TSLP לזיהוי הוא ציין בעכברים PDX קבלת stroma ציטוקינים שלילי. בחרנו את קו התא האנושי stromal HS-27A עבור המחקר שלנו כי הוא גדל בחוזקה בתרבות מראה רמה נמוכה מאוד של ייצור ציטוקינים כי אינו תומך התפשטות של תאים אב מבודד cocultures. 8 עבור הביטוי TSLP האנושי, stroma היו transduced עם הדור מתקדם עצמית- inactivating וקטור lentiviral נגזר עמוד שדרה שתואר בעבר, 9 וכולל את האלמנט cPPT / CTS ואת הפטיטיס וודצוק שלאחר אלמנט תמלילי שלאחר (WPRE) כדי להגדיל את הביטוי transgene. הגן TSLP האנושי נבנה לתוך וקטור זה תחת שליטה של גורם הארכה -1(EF-1) מקדם אלפא כדי להשיג ביטוי חזק, מכונן, לטווח ארוך.
ההנדסה של אדם זה ציטוקינים משופרת PDX מודל מורכב של 4 שלבים עיקריים. ראשית, transduced stransa מורחבות במבחנה ולהעריך על ידי אנזים מקושרים immunayorbent assay (ELISA) לייצור יציב, ברמה גבוהה ציטוקינים. שנית, פעילות של ציטוקינים אנושיים המיוצרים על ידי תאים סטרומה transduced (וחוסר פעילות ציטוקינים מ stroma שליטה) מאומת באמצעות cytometry זרימת phospho. תאים תאים ידועים להגיב לציטוקינים של עניין (במקרה זה, TSLP) מודגרת עם supernatant תא סטרומה assayed עבור זירזום המושרה ציטוקינים. שלישית, עכברים מוזרקים עם stroma האדם transduced ולאחר מכן פלזמה העכבר מוערך על ידי ELISA עבור רמות של ציטוקינים האדם על בסיס שבועי. הרביעי, תאים hematopoietic האדם מושתלים ואת ההשפעות תפקודית vivo של הציטוקין האנושי מוערכת על יעד ידוע ( משלוח של ציטוקינים אנושיים באמצעות תאים סטרומה מציע גם יתרונות וחסרונות בהשוואה לשיטות אחרות של אספקת / ייצור ציטוקינים אנושיים בעכברי PDX. לעומת הזרקה של ציטוקין אנושי רקומביננטי, מתן סטרומה מתווכת הוא בדרך כלל פחות יקר (העלות של תרבות התא סטרומה הוא פחות מאשר העלות של ציטוקין רקומביננטי) ופחות עבודה אינטנסיבי (הזרקת אחת בשבוע לעומת הזרקות מרובות בשבוע). הנושא של מחצית החיים ציטוקינים קצר הוא גם להקל מאז stroma לייצר ללא הרף את הציטוקינים אקסוגני. משלוח של ציטוקינים באמצעות הזרקה הידרודינמית של דנ"א עשוי להיות זול יותר מאשר משלוח באמצעות stroma. עם זאת, הוא חולף באופן דומה עשוי לדרוש יותר מיומנות טכנית מאשר הזרקת intraperitoneal שבועי פשוט נדרש עבור משלוח stroma בתיווך. ביטוי גנטי lentiviral העכבר עשוי לספק פחות traהשיטה המקובלת של משלוח ציטוקינים; עם זאת, בידינו רמות TSLP פיזי לא הושגו. בנוסף, שיטה זו היא עבודה אינטנסיבית, הדורשת ייצור רציף של וקטור lentiviral. עכברים מהונדס או לדפוק ב להציע יציבה לטווח ארוך ביטוי של ציטוקינים והוא יכול להיות מהונדסים עבור ביטוי רקמות ספציפיות, אשר יכול להיות יתרון. מצד שני, הביטוי הטרנסגני של הגן ציטוקינים האדם על רקע עכבר לקוי החיסונית הנדרשת עכברים PDX, מחייב השקעה עצומה של משאבים לפני הערך של המודל הוקם. יתר על כן, מודלים מהונדס אינם מאפשרים בדרך כלל את האפשרות של שינוי העיתוי של חניכה ציטוקינים או רמת הייצור ציטוקינים vivo . אלה יכולים להיות מושגת עם משלוח stroma בתיווך פשוט על ידי שינוי נקודת הזמן ליזום הזרקת תא סטרומה או מינון של תאים סטרומה מוזרק. התאים סטרומה בתיווך ציטוקין בתיווךOd מפורט כאן שימש לפתח PDX להערכת התפקיד של TSLP ב נורמלי התא האנושי B התפתחות 4 , 6 ו בסיכון גבוה B- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. שיטה זו מספקת שיטת חלופה לציטוקינים חלופיים לשימוש בהפקת מודלים דומים עם ציטוקינים אנושיים שאינם TSLP. מודל זה יכול גם להיות שימושי עבור יצירת נתונים ראשוניים שיכולים לעזור לקבוע אם הערך של ציטוקינים מהונדס ציטוקינים או ציטוקין לדפוק ב- PDX המודל יהיה ראוי להשקעה זמן וכסף משמעותי. 
איור 1: PDX דגם מתוכנן לייצר ציטוקינים אנושיים אקסוגניים בעכברים. ( 1A ) ניסוי עיצוב ולהשיג transduced תאים סטרומה האדם ( 1B ) השגת תאים אנושיים (תאי גזע hematopoietic, תאי לוקמיה, וכו ' ) כדי לייצר עכברים PDX (שנבע מטופל xenograft) עכברים. ( 2A ) להזריק סטרומה מהונדסים ( 2B ) להשתלות תאים אנושיים לתוך עכברים לקוי החיסון לפי לוח הזמנים הניסויי. ( 3A-B ) צג ריכוזי ציטוקינים ב supernatant stroma ואת פלזמה העכבר על ידי ELISA. ( 4 ) קציר תאים אנושיים ולהעריך את ההשפעות תפקודית vivo של ההווה ציטוקינים האדם PDX. בבקשה לחץ כאןכדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים שנערכו בהתאם ל - Loma Linda University של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) ו מוסדיים סקירה מועצת המנהלים (IRB) אושרה פרוטוקולים ועל פי כל הנחיות הפדרלי.
זהירות: PDX ורקמות אנושיות יש לטפל בהתאם לנהלי בטיחות כדי למנוע העברת פתוגנים הנגרמים על ידי הדם.
1. תרבות והרחבה של תאים סטרומקליים ציטוקינים transduced
הערה: בכל פעם stroma הם passaged, למסוק supernatant תרבות (aliquot 1 מ"ל) ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לכימות בעתיד של רמת ציטוקינים באמצעות assay ELISA.
- הכן בינוני R10 תרבות בינוני מקפיא כמתואר בלוח של חומרים.
- ליצור 10 , 11 או להשיג שליטה stroma (transduced עם וקטור ריק) ו ציטוקינים בייצור (TSLP +) stroma."6 חנות בחנקן נוזלי (LN 2 ) עד לשימוש.הפסק תאים סטרומה כמתואר 12 וצלחת אותם 5 מ"ל של המדיום R10 בצנרת נפרדת T-25 תרבות תאים.תרבות תאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זהו שלאחר ההפשרה "מעבר # 1".
- לאחר stroma הם confluent (24-48 h), תאים המעבר על ידי trypsinizing באמצעות 1 × טריפסין EDTA (0.25%) ו ציפוי מחדש של בקבוק T-150 תרבות. זה לאחר הפשרה "מעבר # 2".
- כאשר stroma להשיג confluency של T-150 צלוחיות (3-4 ימים מאוחר יותר), מעבר התאים על ידי trypsinizing. השתמש ההשעיה תא לצרכים ניסיוניים.
- הרחבת תאים למספר צלוחיות
- פיצול התאים שנקטפו בין שלוש T-150 צלוחיות ותרבות עד confluent. חזור על שלב זה אם יש צורך בהרחבת סטרומה. טיפוסית סטרומה אנושית (HS-27A) לספור תאים בבית המפגש בקבוק T-150 הוא ~ 5 x 10 6 .
- תא sלזעום
- מעבירים את ההשעיה תא שנקטפו צינור חרוטי צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות, decant supernatant ו resuspend התאים במדיום מקפיא. להקפיא ולאחסן LN 2 ~ 1.5 x 10 6 תאים לכל בקבוקון.
- עבור intra periototoneal זריקות stroma לתוך עכברים, המשך לשלב 4.1.
- הרחבת תאים למספר צלוחיות
2. מבחני ELISA לפקח על ייצור ציטוקינים במבחנה מ Transduced Stroma
- רכישה מסחרית זמין ELIA assay Kit לזהות את ציטוקינים של עניין.
- להפשיר supernatant תא סטרומה מן השליטה ציטוקינים בייצור (TSLP +) stroma שנקטפו בתחילת, באמצע ו מעברים מאוחר ( איור 2 ).
- קביעת ריכוז TSLP בדגימות supernatant באמצעות ערכת ELISA על פי הוראות היצרן. 13 לקמפל נתונים טורי אלה כדי לפקח על יציבות הייצור ציטוקינים במהלך cultur התא E ( איור 2A-B ).
- לזהות ולבטל stroma לייצר ציטוקינים עם ביטוי ציטוקינים מופחת או תת אופטימלי, כמו גם כל בקבוקונים המקביל האחסון ( איור 2A-B ).
- לזהות ולתחזק ציטוקינים בייצור ציטוקינים המפגינים ריכוז ציטוקינים ברמה יציבה. השתמש אלה המפשיר עבור ניסויים.
- השתמש בערכת ELISA כדי לפקח באופן שגרתי על stroma לאורך כל תקופת התרבות התא (לפחות פעם אחת במהלך מוקדם, באמצע ומאוחר שלאחר הפשרה מעברים) כדי להבטיח ייצור ציטוקינים יציב או, במקרה של stroma שליטה, היעדר ייצור ציטוקינים .
3. Phospho זרימת cytometry מבחני להעריך את הפעילות של ציטוקינים המיוצר על ידי Stroma
הערה: להעריך את supernatant מהסטרומה מהונדסים לפני הניסוי הראשון כדי לאמת את הפעילות הביולוגית הרלוונטית של ציטוקינים שנוצר stroma לניסוי הפרט.Ef "> 6 לאחר אישור הסטרומה המהונדסת, בדיקה נוספת אינה הכרחית אלא אם כן יוצגו סטרומה שיוצרו עם וקטור חדש.
- רכישת MUTZ5 ו / או MHH-CALL4 תאים לוקמיה תאים (תגובה TSLP), 14 ציטוקינים אנושיים רקומביננטי, ונוגדנים שאושרו לשימוש מבחני cytometry זרימת phospho לזהות מטרות זירזונה במורד המתאים.
- ההפשרה שנקטפו supernatant מ שליטה ציטוקינים להביע stroma.
- פלייט שורות תאים לוקמיה במדיום R20 (ראה טבלה של חומרים ) בריכוז של 0.2 x 10 6 תאים לכל היטב צלחת 96 רקמה תרבות טובה. צלחת 3 בארות לכל תנאי כדי לאפשר מבחני trilicate. לדגור על 2 שעות ב 37 ° C. הפעם מאפשר אובדן של זרחון כלשהו שהתרחש במהלך תנאי התרבות הקודמת.
הערה: 12 בארות לכל שורה התא מספק מבחני trilicate עבור כל תנאי הניסוי שמוצג בשלב 3.4. <Li> לאחר 2 שעות בתרבות, להעביר את התאים מכל היטב להפריד צינורות 4 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות, ב 4 ° C. למזוג את supernatant. - Re- להשעות את התאים μL 200 עבור כל אחד התנאים הניסוייים הבאים (ביצוע מבחני בשלושה עותקים): 1) שליטה שלילי התקשורת בלבד, 2) שליטה חיובית התקשורת עם ציטוקין רקומביננטי ב ריכוז ריכוז (ים) (TSLP ב 15 ng / ML, וכו ' ), 3) שליטה stroma supernatant מ stroma שליטה, ו 4) ציטוקינים- stroma- supernatant מ stroma ציטוקינים בייצור.
- דגירה התאים למשך שצוין על ידי ספציפי ספציפי phospho assay ( למשל 30 דקות עבור phospho-STAT5 ב MUTZ5 או MHH-CALL4 בתגובה TSLP).
- צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C ו decant supernatant.
- בצע phospho זרימת cytometry מכתים לכל פרוטוקול של היצרן ולאסוף נתונים cytometry זרימה. 15
- שער על תאים שלמים המבוססים על קדימה (FSC, מציין גודל התא) ואת הצד (SSC, מציין את רמת התאיות) פיזור האור.
- לקבוע את עוצמת פלורסנט חציון (MFI) של תאים שלמים במדגם זה. השווה את ממוצע MFI שהושג מן הערכים trilicate של supernatant תא stromal לזה של שולטת מדיה חיובית ושלילית.
4. הזרקה של ציטוקינים- Transduced Stroma לתוך עכברים
הערה: תרבות HS-27A stroma עבור מינימום של 3 שלאחר הפסק מעברים לפני הזרקתם לתוך עכברים כדי להבטיח תאים בריאים ייצור ציטוקינים נאותה.
- הכנת סטרומה
- מעבירים את ההשעיה תא stromal שנקטפו צינור חרוטי aliquot 10 μL לספירת hemocytometer; להשיג ספירת תאים חיים באמצעות כחול Trypan. 16 צנטריפוגה הנותרים CELl ההשעיה ב 500 xg במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant מן תאים גלולה בעדינות resuspend התאים בנפח הצורך של מלוחים סטרילי פוספט שנאגרו (PBS) עבור הזרקת העכבר (בהתאם למספר עכברים להזריק).
הערה ריכוז תאי סטרומה טיפוסי הזרקת העכבר: 0.5 x 10 6 -5 x 10 6 תאים לכל עכבר 200 μL PBS. - שמור על ההשעיה תא stromal ב 4 ° C (או על קרח) עד מיד לפני ההזרקה. ודא ההשעיה התא הוא לפחות בטמפרטורת החדר (RT) (~ 25 מעלות צלזיוס) עבור הזרקת עכברים.
- הזרקת תא סטרומה
- לחטא את מכסה המנוע ביו בטיחות, להרכיב חומרים עבור זריקות ולאחר מכן למקם את כלוב העכבר בפנים.
- בעדינות לערבב את ההשעיה התא על ידי היפוך לפני ציור 200 μL לתוך מזרק tuberculin.
- שימוש בטכניקות הזרקה סטנדרטיות תוך-פריטיות, 17לרסן את העכבר ולנהל את ההשעיה 200 תאים μL לתוך חלל הצפק. פרטים הוכיחו בעבר על ידי Machholz et al. 18
5. סידורי דם אוסף פלזמה ניטור עבור ציטוקינים האדם אקסוגני בעכברים
- איסוף דם דרך זנב זנב
- לחטא את מכסה המנוע biosafety ולהרכיב עכבר מסגר, מספריים וכלים אחרים / ציוד עבור ההליך.
- מניחים את העכבר מסננת ולאבטח את הצינור כדי למזער את תנועת העכבר.
- לחטא את הזנב ומספריים כירורגית עם אלכוהול איזופרופיל. החל קרם הרדמה מקומית על הזנב.
- באמצעות מספריים כירורגי חד מאוד לגזור על 0.5 - 1 מ"מ של קצה הזנב של העכבר. איסוף כ 80 μL של דם היקפי באמצעות צינורות נימי heparinized.
הערה: אם הדם ייאסף בשיטה זו יותר משישה tiMes, הסרת זנב צריך להיות שמרני ביחס לכמות הזנב הוסר. כפי snips התקדמות הזנב את הקוטר עולה, זה דימום מהר יותר, ריפוי לוקח יותר.
- הפרדת פלזמה
- מעבירים את הדם באמצעות מזרק נורה (לגרש אותו צינורות נימי) לתוך צינור מסומן K2 EDTA צינור; הפוך 20 פעמים כדי למנוע קרישה.
הערה: בדרך כלל קרישת דם מן הזנב הוא מהיר. עם זאת, אם דימום נמשכת יותר מ ~ 2 דקות להשתמש בעיפרון / אבקה סטפטי כדי לסייע בקרישה. - צנטריפוגה צינורות איסוף דם על פי הוראה של היצרן aliquot פלזמה לאחסון (-20 מעלות צלזיוס) עד מוכן assay ELISA.
- אם הנתונים עכבר האדם תאים chimerism יש צורך מן הדם העכבר, ולאחר מכן לטפל גלולה הנותרים כמתואר בשלב 6.3.1. אחרת, להשליך את הכדור גלולה התא.
- מעבירים את הדם באמצעות מזרק נורה (לגרש אותו צינורות נימי) לתוך צינור מסומן K2 EDTA צינור; הפוך 20 פעמים כדי למנוע קרישה.
- השתנה ELISA עבור micro-volאדים של פלזמה העכבר
הערה: ההליך ELISA של היצרן השתנה מ 100 נפח מדגם μL מומלץ ל 40 נפח μL כדי להתאים את הכרכים מיקרו שנאספו עכברים. זה לא ניתן להפעיל את in vivo העכבר דגימות פלזמה בשלושה עותקים עם אלה כרכים מוגבל. בסוף הניסוי ~ 500 μL של דם לאחר המוות הוא נאסף באמצעות לנקב לב. ריכוז ציטוקינים מוערך μL 100 של פלזמה המתת חסד משמשים כדי לאמת את μL 40 בנתונים vivo עבור כל עכבר.- להפשיר קפוא דגימות פלסמה העכבר.
- סדרתי לדלל את הסטנדרטים ELISA וצלחת אותם בשלושה עותקים μL 40 לכל טוב.
- הוסף 40 μL של כל מדגם פלזמה העכבר לצלחת ELISA.
הערה: אם מדגם העכבר הוא פחות מ 40 μL, ואז להביא את עוצמת הקול עד 40 μL עם חיץ ELISA. שיא זה נפח diluent ולהשתמש בו כדי לחשב גורם דילול עבור כל מדגם מדולל. מתיניתוח נתוני ELISA להכפיל את ריכוז מדגם מדולל על ידי גורם הדילול של המדגם כדי לקבוע את ריכוז ציטוקינים בפועל במדגם המקורי. - Assay להשלים ELISA על פי הוראות היצרן.
6. השתלת תאים המטופויטים לתוך עכברים
- הקרנה תת-קרקעית למח עצם מוח עצם להשתלה
הערה: אוניברסיטת לומה לינדה (LLU) משתמשת במקור קרינה Cobalt-60. בעלי חיים ממוקמים בתוך מאפרת פאי אשר ממוקם 80 ס"מ ממקור הקרינה בתחום 20 x 20 ס"מ עם 0.5 ס"מ שכבת לקסאן על גבי האיזון. זמן חשיפה מחושב כדי להשיג 225 cGy מינון מבוסס על הכיול האחרון של המקור (כרגע 2-3 דקות עבור מקור זה).- תת עכבר להקרין עכברים (סך קרינה הגוף מינון של 225 cGy מקסימלית עבור עכברים לקוי החיסון).
- השתלת תאים hematopoietic ~ 24 שעות מאוחר יותר באמצעות </ Em> הזרקת וריד הזנב תוך ורידי.
- השתלת תאים ההמטופויטים תוך ורידי
- הכנת מתלים התא האנושי להשתלה בנפח של 200 μL סטרילי PBS לכל עכבר: CD34 + תאי גזע hematopoietic (HSC): 1 x 10 5 עד 5 x 10 5 תאים לכל עכבר שורות תאים לוקמיה / דגימות המטופל: 1 x 10 6 5 x 10 6 תאים לכל עכבר.
- שמור תאים 4 ° C (הובלה על הקרח) עד מיד לפני ההשתלה. ודא התאים לפחות ב RT לפני ההשתלה.
- לחטא את מכסה המנוע ביו בטיחות ולהכין את מכסה המנוע עבור זריקות להשתלות.
- מניחים את העכבר בכלוב התחממות לפחות 5 דקות כדי לאפשר התרחבות של הוורידים הזנב.
- בעדינות לערבב את ההשעיה התא לצייר 200 μL לתוך מזרק tuberculin. בבטחה להגדיר את המחט בצד איפה זה יישאר סטרילי.
- מניחים את העכבר באיפוק ומחטאים את הזנב עם אלכוהול איזופרופיל/ Li>
- באמצעות טכניקות הזרקת תוך ורידי רגיל, 17 להזריק את ההשעיה התא האנושי לתוך וריד זנב העכבר.
הערה: הזרקת זנב זנב עשוי להימשך מספר ניסיונות, במיוחד עבור המטפל החיה טירון. Kovacscics ו Raper של JoVE וידאו 19 מספק הדגמה מפורטת של טכניקה זו חיה. - מעקב אחר התאוששות העכבר במשך 5 דקות ~. הקלט כל תופעות לוואי במהלך ההזרקה ( למשל תאים שנשפכו, דימום מרכזי, טראומה זנב מופרז).
- ניתוח של חיידקים התא האנושי בדם היקפי העכבר
- השג את הכדור גלולה התא שנותר צינור microtainer לאחר ההפרדה פלזמה (שלב 5.2.3).
- עבור תא דם אדום (RBC) תמוגה, resuspend את גלולה הדם הנותר בהיקף של PBS שווה פלזמה הוסר (כדי להחליף נפח פלזמה) ומערבבים היטב (מערבולת / פיפטה).
- העברת כל מדגם דם מושעה מחדש לצינור שכותרתו 4 מ"לולאחר מכן להוסיף חיץ תמוגה RBC לכל צינור ב 1: 9 יחס (900 חיץ μL RSC תמוגה עבור 100 μL מחדש מושעה דם). דגירה של 5 דקות ב RT. צנטריפוגה (5 דקות, 500 xg) ו decant.
- לבצע השני RBC תמוגה חיץ הדגירה (5 דקות ב RT). צנטריפוגה ו decant כמו קודם.
- לשטוף את התאים הנותרים ~ 1 מ"ל PBS. צנטריפוגה ו decant כמו קודם.
- Resuspend גלולה בנפח של PBS מתאים מכתים cytometry הזרימה הסטנדרטי (זה משתנה בהתאם ליצרן פרוטוקולי מעבדה בודדים). 20 השתמש נוגדנים immunophenotyping מאומת עבור זרימת- cyotmetery לזהות תאי עכבר (CD45 העכבר +) ותאי אדם (CD45 + + האנושי) 6 , 21 כמו גם סמנים נוספים ליקוציט אדם ספציפי לשושלת התא עניין.
הערה: מומלץ לקחת נפח קטן (5 μL -20 μL) מכל מדגם העכבר כדי ליצור "דגימות נקווה"; להשתמש עבור unstained, כדאיות, ו isotype דגימות שליטה. זה הכי טוב בפועל יש unstained ו isotype שולטת עבור כל תנאי הניסוי.
7. הערכה תפקודית של פעילות ציטוקינים Vivo
- עכבר המתת חסד ואת הקציר רקמות
- להרדים עכברים באמצעות CO 2 asphyxiation בנקודת זמן ניסיוני המיועד.
- קציר דם באמצעות לנקב לב ולאסוף פלזמה כמו צעדים 5.2.1-5.2.2.
הערה: לאסוף את הדם לפני רקמות אחרות כי זה מתחיל קרישה מיד לאחר המוות. - לעבד את הדם העכבר, aliquot פלזמה החנות כמו בשלב 5.2.2.
- בשלב מאוחר יותר, להעריך ריכוז ציטוקינים אקסוגניים בפלסמה המתקבל על המתת חסד באמצעות ELISA על פי פרוטוקול של היצרן. להעריך ולהשוות ריכוז ציטוקינים אקסוגניים פלזמה העכבר מן סדרתי in vivoאיסוף דם ודגימות פלסמה המתת חסד (המתואר בסעיף 5.3).
- הוסף PBS כדי הנותרים דגימת דם להחליף נפח פלזמה תהליך כמתואר השלבים 6.3.1 ו 6.3.2. בצע מבחני cytometry זרימה מיד תאים resuspend במדיום מקפיא לאחסון LN 2 .
- קציר מוח העצם (BM) ו הטחול מן העכברים PDX ולהכין השעיות תא בודד כפי שתואר לעיל. 22
- השגת ספירת תאים עבור כל מדגם רקמה העכבר PDX באמצעות חומצה אצטית 3% עם מתילן כחול (lyses תא קרום RBCs עוזב גרעינים שלמים של תאים חיים) ב 1: 1 דילול תאים לספור באמצעות hemocytometer. טבולה סה כ ספירת תאים עבור מוח העצם דגימות הטחול עבור כל בעל חיים.
- צנטריפוגה (500 xg, 15 דקות) השעיות תא ו decant supernatant. בצע בדיקות cytometery זרימה של מוח העצם ו / או טחול תאים מיד או resuspend במדיום מקפיא עבור LN <תת> 2 אחסון.
הערה: להקפיא 10 aliquots BM (עבור מבחני ביוכימיים עתידיים) ו 5 aliquots spleen (עבור השתלות PDX בעתיד) לכל עכבר. - Immunophenotyping לזהות אפקטים תפקודית vivo
- הכן אחד לערבב (MM) של נוגדנים cytometry זרימה לאוכלוסייה hematopoietic hemopopoietic אימונופוטיפ להגיב לציטוקין של עניין שנייה MM של נוגדנים לשלוט isotype ( איור 5 ו טבלה של חומרים).
- ההפשרה PDX רקמות aliquots (37 ° C חרוז אמבטיה) מוכן בשלב 7.4.
- שטפו את התאים מופשר על ידי העברתם צינור חרוטי והוסיף נפח 3x לפחות 3 של PBS. צנטריפוגה (500 xg, 5 דקות) ו decant supernatant.
- חזור על שלב הרחצה (7.5.3).
- יצירת aliquots מאוגדים על ידי לקיחת ~ 10 μL-20 תאים μL מדגם PDX כל שליטה, שליטה הכדאיות, ואת בקרות isotype (ראה שלב 6.4.6 הערה). הכתם כל דגימות, למעט uשליטה nstained, עם צבע הכדאיות fixable (סמן תאים מתים), דגירה לשטוף לפי פרוטוקול של היצרן.
- כתם כל מדגם תא PDX עם פנוטיפינג MM על פי פרוטוקול cytometry הזרימה סטנדרטי; כתם דומה הדגימה איסוטיפ משולב שליטה (ים) עם isotype- MM. לדגור את כל הדגימות, לשטוף עם PBS, ולתקן דגימות מחדש על ידי השעיית paraformaldehyde 1%.
- איסוף נתונים cytometry הזרימה ולנתח נתונים באמצעות אסטרטגיה gating המתאים האוכלוסייה התא (ים) של עניין ( איור 5 ). דוגמה טיפוסית היא כדלקמן:
- הגדרת תאים שלמים על ידי ציור FSC ו שער SSC כי אינו כולל פסולת.
- זיהוי האוכלוסייה החיים תאים על ידי gating על תאים שליליים עבור סמן התא המת (זה "תאים חיים סה"כ").
- השתמש תת השערים בתוך "תאים חיים סה"כ" כדי להגדיר את popultions התא עם אימונופוטיפ הרצוי (ראה איור 5).
- השג אתתדירות של אוכלוסיות תאים תת בתוך המספר הכולל של תא חי מניתוח cytometry זרימה. 6 , 21
- חישוב מספר התאים היעד בכל רקמה על ידי הכפלת התדירות של תת התא B, בתוך תאים חיים סה"כ (שהושגו בשלב 7.5.6.4) על ידי ספירת תאים החיים הכל לכל רקמה שהושגו בשלב 7.3 (תת% B תת משנה x " ספירת תאי המיאוציטומטר ", ראה טבלה 1 )
- השווה את ספירת תאים של אוכלוסיות תאים היעד בין שליטה PDX עכברים הבעת ציטוקינים (TSLP +) PDX עכברים כדי לקבוע ב vivo תפקודים אפקטיביים של הציטוקין האנושי אקסוגני ( טבלה 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה של המודל מוצג באיור 1 . לאחר ציטוקינים בייצור (TSLP + stroma) ושליטה stroma הושגו הם מורחבים בתרבות. לפני הזרקת stroma לתוך עכברים, supernatant תא סטרומה מוערכת על ידי ELISA כדי לאמת את ייצור ציטוקינים ( איור 2 ) ו cyphometry זרימת phospho (פרוטוקול # 3) משמש כדי לאמת את הפעילות של ציטוקינים המיוצר על ידי stroma. Supernatant נאסף מתרביות תאים stromal confluent (stroma שליטה TSROP + stroma) כאשר תאים passaged. ELISA משמש לפקח על ריכוז TSLP ב supernatant לפחות פעם אחת במהלך מוקדם, באמצע, ומאוחר קטעים. נתונים מייצגים stroma שליטה מוצגים באיור 2 א . בקרת תרבויות תאים סטרומה המציגים ביטוי TSLP (וכל בקבוקונים קפואים למטה מהם) צריך להיות מושלך. בקרת תרבויות עם TSLP בלתי ניתנות לגילוי מורחבות ומוקפאות לשימוש עתידי.כפי שמוצג בתרשים 2B תרשימים של TSLP + stroma מראה ברמה נמוכה ייצור TSLP (בקבוקונים קפואים למטה מהם) נמחקים. TSLP + stroma מראה יציבה, ייצור ברמה גבוהה של הציטוקינים נבחרים להרחבה ואחסון לשימוש בניסויים עתידיים. רמות ממוצעות של TSLP supernatant מתרבויות מרובות של שליטה TSLP + stroma מוצגים באיור 2C .
ציר הזמן ניסיוני לייצור עכברים PDX שליטה עם ציטוקינים האדם מוצג באיור 3 . תרבויות תאים סטרומה יזם 3 שבועות לפני ההשתלה assay ELISA של ייצור TSLP חוץ גופית ב supernatant תרבות מבוצעת כמתואר באיור 2. ב TSVP האדם vivo בפלסמה העכבר הוא פיקוח שבועי ( איור 4 ) באמצעות "ELISA שונה עבור מיקרו כרכים של פלזמה העכבר "המתואר בפרוטוקול מס '4. פריפריהL הדם נאסף במקביל עם פלזמה והוא assayed כמתואר בפרוטוקול מס '6 תחת "ניתוח של חיידקים התא האנושי בדם היקפי העכבר." PDX מוזרק עם שליטה stroma הראה באופן עקבי פלזמה TSLP רמות האדם כי הם מתחת לסף לזיהוי ( איור 4 א ). רמת הפלסמה של TSLP בעכברי PDX המוזרקים עם TSLP + stroma פרופורציונלית למספר התאים TSLP + stromal מוזרק במהלך השבועות 1 - 2 הקודמת. רמות הפלזמה של TSLP יורדות במהירות אם זריקות תאים סטרומליות מופסקות. 6 כפי שנראה בתרשים 4B , זריקות שבועיות של 0.5 x 10 6 TSLP + stroma (ייצור בממוצע> 1,000 pg / mL של TSLP בתרבית supernatant) נתן רמות TSLP פלזמה ליד הגבול התחתון של רמות פיזיולוגיות (~ 5-10 pg / mL ). הזרקת שבועית של 5 x 10 6 TSLP + stroma בעכברי PDX גרמה רמות TSLP פלזמה להגיע לרמות פיזיולוגיות גבוהות (~ 35 pg / mL) כפי שמוצג ב
TSLP הוכח כדי להגדיל את הייצור של מבשרי התא B נורמלי B. 23 לכן, כדי להעריך את התפקוד in vivo של TSLP השווה את המוצר יון של מבשר תאים B נורמלי האדם בשליטה ועכברים TSLP + PDX המושתלים בתאי גזע hematopoietic כפי שמוצג באיור 5 ובטבלה 1 . איור 5A מראה cytometry הזרימה gating עבור immunopheneotyping המשמשים לזהות תת קבוצות של תאים B שושלת יוחסין. חישובים לדוגמה עבור ספירת מספר התאים בכל תת אחת עבור PDX שליטה אחת TSLP + PDX מוצגים בטבלה 1 . כפי שמוצג בתרשים 5B, תאים B השושלת הם הגדילו באופן משמעותי TSLP + לעומת שליטה PDX ועלייה זו מתחילה עם מבשרי התא הראשונים B (תאים Pro-B). מספר תאים שאינם B שושלת לא היה שונה משמעותית בין שליטה TSLP + PDX (נתונים לא מוצג). Assay זה מספק דרך לאמת כי TSLP האדם מיוצר in vivo ב TSLP + PDX exerts ב vivo תפקודית אפקטים על אוכלוסיית תאים היעד.
Ure 2 "src =" / files / ftp_upload / 55384 / 55384fig2.jpg "/>
איור 2: ELISA כדי לפקח על TSLP ציטוקינים ריכוז Stroma Supernatant. מבחני ELISA שימשו למדידת ריכוזי TSLP ב supernatant מ stroma שליטה (transduced עם וקטור שליטה) ו TSLP + stroma (transduced להביע TSLP האדם) לפחות פעם אחת במהלך המעברים התא הבאים: מוקדם (מעבר 1-5), באמצע (מעברים 6-12), ומאוחר (מעברים 13-20). סף לזיהוי אסאי TSLP ELISA אנושי כאן הוא 1.9 pg / mL (קו מקווקו אדום). ( א ) בקרת stroma לייצר מינימלית לגילוי האדם TSLP ריכוזים; רמות אלה הן בדרך כלל מתחת לסף זיהוי ELISA למשך הניסוי. סטרומה שליטה בתרבות להראות ריכוזים TSLP גדל (> 15 pg / mL) נמחקים יחד עם aliquots כל קפואים מאותה תרבות. ( ב ) ייצור TSLP האדם משתנה בין תרבויות שנוצרו מ differenלא מפשיר בקבוקונים של TSLP + stroma ( n = 9) ובתקופת התרבות. TSLP stroma המציגים ירידה או לא יציב ייצור ציטוקינים (TSLP <1,000 pg / mL) נמחקים גם. ( ג ) ריכוזים TSLP ממוצע עבור שליטה (ירוק) ו TSLP + (כחול) stroma (אמצעי רווחי 95% ביטחון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ציר הזמן ניסיוני ליצירת עכברים PDX עם ייצור ציטוקינים האדם אקסוגני. במבחנה ו במנות vivo של הניסוי התקדמות במקביל. שליטה ו + TSLP תרבות התא stroma יזמה 2-3 שבועות לפני השתלת התא hematopoietic, אשר מבטיח מינימום של 3 מעברים תא לפני הראשון (בWK -1) של זריקות תא השבועי סטרומה. זה מבטיח כי התאים סטרומה הם בריאים, לשגשג והפקת רמות ציטוקינים נאותה. Aliquots Supernatant נאספים כאשר תאים passaged ומבחני ELISA משמשים לקבוע ריכוז TSLP (ראה איור 2 ) ב supernatant stroma. בעלי חיים הם מוקרנים ביום 0, יום אחד לפני השתלת תאים hematopoietic האדם ביום 1. איסוף דם שבועי מתחיל 1 עד 2 שבועות לאחר זריקות stroma הראשון. בשלב זה, ריכוז ציטוקינים האדם אקסוגני צריך להיות לזיהוי פלזמה העכבר באמצעות מבחני ELISA שונה ( איור 4 ). נקודת הניסוי של הניסוי היא 5-16 שבועות לאחר השתלת תאים אנושיים; זה תלוי בכמות של חיידקים התא האנושי זוהה בדם העכבר ההיקפי. Hematopoiesis רגיל הוא בדרך כלל מבוססת היטב על ידי שבוע 5-7, כימיה תאי לוקמיה משתנה בין שורות תאים דגימות ראשוניות (3-16 שבועות). הצלחה השתלת PDX והתקדמות תלויה גםעל מספר תאי האדם המוזרקים להשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הפיכת האדם TSLP ציטוקינים ריכוז ציטוטים פלזמה עכבר. עכברים מקבלים זריקות intraperitoneal שבועי (200 μL) של תאים transduced ואת פלסמה שלהם נאסף להעריך ריכוזי TSLP האדם (assay ELISA) ב vivo בעכברים לאורך זמן. עכברי "בקרה" קיבלו 5 x 10 6 תאי סטרומה מבוקרים, ואילו "TSLP + נמוך" (TSLP נמוך סטרומה) עכברים קיבלו 0.5 x 10 6 TSLP + תאים stroma, ו "TSLP + גבוה" (TSLP גבוה stroma מנה) עכברים קיבלו 5 x 10 6 TSLP + תאים סטרומה כל שבוע. אסלאם TSLP ELISA האנושי סף זיהוי הוא 1.9 pg / mL (קו מקווקו אדום) ואת טווח פיזיולוגי אנושי של TSLP הוא ~ 5 עד 35 pg / mL (הצללה אפורה). ( א ) "פלזמה" שליטה בעכבר באופן עקבי יש רמות TSLP <5 pg / mL או מתחת לסף גילוי ELISA. ( ב ) "TSLP + פלזמה נמוכה" העכבר מראה רמות פיזיולוגיות נמוכות של TSLP; בעוד ( C ) "TSLP + גבוה" פלזמה העכבר מראה רמות פיזיולוגיות גבוהות. ( D ) ריכוז TSLP ממוצע עבור כל קבוצה ניסיונית (ממוצע ± SEM של כל עכברים נקודות זמן) עולה כי רמות TSLP זוהה פלזמה העכבר פרופורציונלי מינון stroma קיבל; לשלוט על רמות פלזמה העכבר מתחת לסף ELISA זיהוי "TSLP + גבוה" רמות הפלזמה הם ארבעה קיפול גדול יותר "TSLP + נמוך" פלזמה רמות העכבר."> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: Assay של אדם רגיל תא אוכלוסיות תאים תא לבדוק אני n אפקטים ויו תפקודית של האדם TSLP אקסוגני ב PDX עכברים. PDX עכברים היו מהונדסים עם שליטה TSLP + stroma ו מושתלים עם CD34 + תאים אנושיים מבודדים דם טבורי דם. Immuno-phenotyping על ידי cytometry הזרימה שימש לזהות תת קבוצות של מבשרי התא B האדם במח העצם שנקטפו שליטה TSLP + PDX כדלקמן: קצירת מוח העצם, היה מופשר ומוכתמים עם צבע הכדאיות fixable, ומוכתמת cytometry זרימה כדי לזהות אנטי- האדם CD45, CD19, CD34, κ & λ שרשרת האור, או משטח IgD ו IgM או IgM תאיים (cμ). סך כל החייםLs היו נשלטים על בסיס סמן חיוניות. חלקות עוקבות מראות שערים עוקבים לזיהוי תת-קבוצות (B) של קבוצות משנה (נתונים מוצגים מתוך TSLP + PDX). ( ב ) תדירות של כל תת בתוך תאים חיים סה"כ נקבעה על ידי זרימת cytometry תוכנה ומספרים של תאים בכל משנה B התא חושבו. (ראה טבלה 1). ספירת תאים עבור כל תת תא B בשליטה (שחור, n = 3) ו TSLP + (כחול, n = 5) עכברים PDX הם graphed. (ממוצע ± SEM, p <0.05, ** p <0.01, **** p <0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| אוכלוסיית תאים אנושיים | Freq. מסך כל התאים החיים | ספירת תאים חיים in BM | # תאים באוכלוסייה |
| עכבר שליטה | |||
| סך הכל תאים חיים | 100.00% | 39.5 x 10 6 | 39.5 x 10 6 |
| HCD45 + | 98.50% | 39.5 x 10 6 | 38.9 x 10 6 |
| סך הכל CD19 + | 27.20% | 39.5 x 10 6 | 10.7 x 10 6 |
| Pro-B | 24.20% | 39.5 x 10 6 | 9.56 x 10 6 |
| טרום ב ' | 1.70% | 39.5 x 10 6 | 0.68 x 10 6 |
| בוגר לא בוגר | 0.83% | 39.5 x 10 6 | 0.33X 10 6 |
| בוגר ב | 0.68% | 39.5 x 10 6 | 0.27 x 10 6 |
| TSLP + עכבר | |||
| סך הכל תאים חיים | 100.00% | 72.0 x 10 6 | 72.0 x 10 6 |
| HCD45 + | 99.30% | 72.0 x 10 6 | 71.5 x 10 6 |
| סך הכל CD19 + | 65.10% | 72.0 x 10 6 | 46.8 x 10 6 |
| Pro-B | 60.20% | 72.0 x 10 6 | 43.3 x 10 6 |
| טרום ב ' | 2.70% | 72.0 x 10 6 | 1.92 x 10 6 |
| בוגר לא בוגר | 1.60% | 72.0 x 10 6 | 0.11 x 10 6 |
| בוגר ב | 0.40% | 72.0 x 10 6 | 0.29 x 10 6 |
טבלה 1: תדירות ו ספירות של תת רגיל B נייד תת קבוצות PDX מח עצם. התדירות (%) של כל תת תא B בתוך תאים חיים הכולל נקבע על ידי ניתוח cytometry זרימה (ראה איור 5A עבור gating אסטרטגיה). נציג מוח העצם (BM) נתונים של העכבר שליטה PDX אחד (קיבל זריקות סטרומה שליטה, 5 x 10 6 תאים בשבוע) ואחד TSLP + PDX העכבר (קיבל זריקות stLP TSLP, 5 x 10 6 תאים / שבוע). בסך הכל חי ספירות תאים BM נרשמו על המתת חסד ו cytometry זרימת החיסון phenotyping שימש להערכת תדירות המשנה (%) ולחשב את הגודל של כל קבוצה B תא האוכלוסייה (תת ספירה = = totאל חי תאים "x" תדירות המשנה ").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב היד מתאר שיטה פשוטה, מהירה, וחסכונית יחסית עבור הנדסת PDX להביע ציטוקינים אנושיים אקסוגניים. האסטרטגיה המתוארת כאן מבוססת על זריקות intraperitoneal שבועי של קו התא stromal transduced להביע את הציטוקין האנושי, TSLP. לפני ביצוע השיטות המתוארות כאן, stroma מהונדסים להביע רמות גבוהות של ציטוקינים של עניין (TSLP) ו סטרומה שליטה מהונדסים דומה נוצרו. בפרוטוקולים המוצגים כאן, stroma מורחבות התרבות והוקרן על היכולת לספק יציבה, ייצור ציטוקינים ברמה גבוהה לאורך זמן (או על היעדר ייצור ציטוקינים במקרה של שליטה stroma). מבחני כדי לאמת את הפעילות של ציטוקינים שנוצר stroma בוצעו צירי זמן ניסיוני הזרקת תא stromal פותחו לייצר PDX עם TSLP האדם הפיזיולוגי (ועכברים שליטה כי חוסר TSLP האדם). נהלים לניטור רמות פלזמה של האדם TSLP ועבור אימות שלה vivo אפקטים תפקודיים על אוכלוסיות תאים תגובת ציטוקינים בוצעו.
מספר גורמים צריך להיחשב בבחירת תאים סטרומה וקטורים אשר ישמשו בפרוטוקולים המוצגים כאן. שורות תאים סטרומליות לא אמורות לייצר אנדוגניות רמות גבוהות של ציטוקינים, ואינן מגיבות לציטוקינים המעניינים. עבור מחקרים כאן, את המוח האנושי מח עצם stromal line, HS-27A, נבחר כי זה גדל חזק בתרבות עם ייצור ציטוקינים ברמה נמוכה. 8 השיטה המתוארת כאן כוללת גם "שליטה" PDX מהונדסים עם stroma אותו כמו TSLP + PDX, אבל ללא overexpression של TSLP. השוואות של תוצאות TSLP + ובקרה PDX לאפשר לנו לשלוט על כל ההשפעות עקב ייצור אנדוגני סטוקין תא סטרומה. התמרה של תאים סטרומה עם וקטורים הכוללים חלבונים ניאון או סמנים לבחירה אחרים יכולים להיות מועילים לבידוד תאיםב סביר להניח overexpress ציטוקינים של עניין. עם זאת, חיוני assay cytokine supernatant כדי לקבוע את רמת ציטוקינים המיוצרים על ידי תאים stromal כי ב vivo פלזמה ציטוקינים רמות בעכברים בקורלציה עם ריכוז ציטוקינים ב supernatant תא סטרומה, 6 כמו גם את מספר stroma מוזרק על ( איור 4 ).
חשוב כי הפעילות של ציטוקין המיוצר על ידי stroma מאומת לפני מחקרים PDX. השתמשנו cytometry זרימת phospho כדי assay עבור מולקולות phosphorylated במורד הזרם של TSLP בתאים כי הם מגיבים TSLP. TSLP מפעיל את נתיבי JAK-STAT5 ו- PI3 / AKT / mTOR. MUTZ5 ו MHH-CALL4 תאים לוקמיה תאים להביע רמות גבוהות של הרכיבים TSLP קולטן ולהראות STAT5 במורד הזרם, AKT ו ריבוזומלי חלבון S6 זרחון בעקבות גירוי TSLP. 14 כאן השתמשנו cytometry phopho זרימהכדי להעריך זרחון של STAT5 (pSTAT5) המושרה במורד הזרם של גירוי TSLP. בעבודה קודמת הערכנו עבור אירועי זרחור נוספים של TSLP - phospho-AKT (pAKT) וחלבון פוספו ribosomal S6 (pS6, במורד הזרם של mTOR). תוצאות הראו כי assay pakT הוא פחות רגיש pS6 רגיש יותר assay pSTAT5. 6 כאשר בדיקות phospho מבוצעות, תאים תגובה צריך להיות מתורבת עם רמות רוויה של TSLP אנושי רקומביננטי כמו שליטה חיובית עם התקשורת בלבד (ללא ציטוקינים) כביקורת שלילית. Supernatant מ stroma שליטה צריך להיות assayed בצד כי מ TSLP + stroma כאמצעי השני של אימות (בנוסף ELISA) כי TSLP אינו מיוצר על ידי stroma שליטה. זה משמש גם כבטחון כדי להבטיח ייצור ציטוקינים אנדוגני אינו אחראי זרחן שנצפה מבחני TSLP + תאים. אידיאלי זירחון המושרה ציטוקינים בייצור stroma דגימות צריך להיות similAr כדי לצפות עם מצב ציטוקינים רקומביננטי, אם כי זה עשוי להיות נמוך יותר אם הריכוז של ציטוקינים supernatant הוא נמוך יותר מאשר בשליטה רוויה חיובית. שליטה חיובית עם רמות TSLP רקומביננטי התואמות את רמות שנצפו על ידי ELISA עבור TSLP + stroma הם חלופה טובה.
זיהוי מחוונים פונקציונליים ידועים של פעילות ציטוקינים vivo יכול להיות אתגר. מבחני זרחון לא יכול להיות אפשרי, כי זרחן הנגרמת על ידי ציטוקין האדם אקסוגני in vivo יכול להיות איבד במהירות במהלך הקציר הרקמות. מאז TSLP הוכח כדי להגדיל את הייצור של מבשרי התא B האדם, 23 את האפקט הפונקציונלי של TSLP ב PDX אומת על ידי assaying עבור מגביר vivo בבני אדם B מבשר האוכלוסייה באמצעות cytometry הזרימה immunophenotyping. אסטרטגיה חלופית יכולה להיות assaying עבור שינויים ספציפיים המושרה ציטוקינים בביטוי גנים השוואההביטוי ng בתאים שנקטפו ציטוקין להביע PDX לתאי PDX שליטה. 6
המטרה הסופית של ביטוי ציטוקינים אנושי ב- PDX היא ליצור מודל פרה-קליני שמודגם מקרוב יותר בסביבת ה- vivo הקיימת בחולים. זה נבדק על ידי השוואת ביטוי הגנום כולו ברקמות האדם מבודדים שליטה PDX ו מ ציטוקין להביע (TSLP +) PDX לדגימות המטופל המקורי. מחקרים אלה הראו כי ביטוי גנים בדגימות החולה הוא קרוב יותר קרוב לתאי לוקמיה מ TSLP + PDX מאשר בקרות. 6 עם זאת, המחקר שלנו התמקד lymphopoiesis. מספר ציטוקינים שמקבלים מיאלואידים המיוצרים בעכבר אינם מפעילים את עמיתיהם לקולטנים האנושיים. יש עכברים אנושיים ציטוקינים נוקין (עכברים NSGS ואחרים), כי כתובת זו בעיה. ואכן, ערך אחד של המודל אנו מתארים כאן היא כי ניתן להשתמש בו בעכברים NSGS כדי ליצור מודל זה יותר לסגורEly מודלים של האדם בסביבת vivo על ידי הבעת TSLP בנוסף ציטוקינים האדם המנילואידים. מצד שני, מערכת +/- ציטוקין יכול להיות שנוצר בעכברים NSG באמצעות השיטה המתוארת כאן עבור כל ציטוקינים אלה קידום מיילואידים. מודל זה עשוי לשמש כדי ללמוד את התפקיד המדויק של vivo של כל אחד מהם myelopoieis ו / או לוקמיה מיאלואידית.
הנדסה PDX המייצרים רמות פיזיולוגיות של האדם TSLP מספק מודל פרה קליני זה מקרוב יותר מחקה את הסביבה vivo הנוכחי בחולים מאשר PDX קלאסי. 4 הייצור של עכברים PDX שליטה כי הם מהונדסים באופן דומה, מתוארים גם. יחד שליטה ציטוקינים בייצור PDX ליצור TSLP +/- מודל מערכת אנושית שיש לנו בהצלחה להשתמש כדי להעריך את התפקיד של TSLP ב vivo הייצור של תאים B נורמליים וממאירים. 4, 6 זההמודל רלוונטי ביותר למחקרים על סוג מסוים של סיכון גבוה של B-cell Lymemia lymemia חריפה מסוג B (B-ALL) המאופיינת בשינויים גנטיים המביאים לידי ביטוי יתר של CRLF2. CRLF2 הוא קולטן לציטוקין TSLP ולכן TSLP-Induced CRLF2 איתות סביר תורם אונקוגנזה והתקדמות של CRLF2 + B-ALL. השימוש ב- PDX כדי לחקור מחלה זו הוא קריטי במיוחד משום ש- PDX מאפשר לנו ללמוד לוקמיה בהקשר של הנוף הגנטי של המטופל. הנוף הגנטי כתורם למחלות מעורב באופן משמעותי ב- CRLF2 + B-ALL, המתרחשת לעיתים קרובות פי חמישה אצל ילדים היספאנים / לטיניים מאחרים ומרכיב מחצית מכלל מקרי B-ALL בחולי תסמונת דאון. מודלים PDX להביע TSLP האדם כמו זה לתאר כאן יהיה כלי חשוב בזיהוי טיפולים והבנה מנגנוני המחלה של CRLF2 + B-ALL כמו גם להבנה hematopoiesis רגיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wet lab reagents | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL capacity, 25cm² culture area | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 600 mL capacity, 150 cm² culture area & vented cap | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serological pipettes | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL round-bottom polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL cryogenic vials, externally threaded | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipette tips | Fisher | 2707509 | |
| 200 μL pipette tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μL pipette tips | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Sterile Disposable Filter Units with SFCA Membrane, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without calicium and magnesium, 1× | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| "Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA in HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| “R10” cell culture medium, % of total volume (makes 565 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 88.5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamine, 0.99% (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.50% (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 µL) | MP | 190242 | |
| “R20” cell culture medium, % of total volume (makes 195 mL) | - | - | Lab Recipe |
| RPMI, 76.84% (150 mL) | see above | see above | |
| FBS, 20.49% (40 mL) | see above | see above | |
| 2mM L-glutamine, 1.02% (2 mL) | see above | see above | |
| 1 mM Na pyruvate, 1.02% (2 mL ) | see above | see above | |
| Penicillin-Streptomycin, 0.51% (1 mL) | see above | see above | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (0.1 M), 0.10% (200 µL) | see above | see above | |
| “Freezing medium”, % of total volume | - | - | Lab Recipe |
| “R10” medium, 45% | see "R10" recipe | - | |
| FBS, 20% | see above | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trehalose dihydrate, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A human stroma line | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 337 | |
| “NSG mice” NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, male or female, age 6 – 8 weeks | JAX Mice | # 005557 | |
| MUTZ-5 cell line, human B cell precursor leukemia | DSMZ | ACC 490 | |
| Recombinant Human TSLP protein | R&D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Flow cytomery antibodies (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternate name is IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Fixable viability dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ light chain FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ light chain FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Other materials & equipment | |||
| Animal Implantable Nano Transponder with Canula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA lidocaine anesthetic cream (obtain by presciption through animal care facility) | perscription | perscription | |
| BD ½ cc LO-DOSE U-100 Insulin Syringe 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes with K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Capillary Tubes (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Mouse Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Pistol Grip Implanter | Trovan | IM-300(1.25) | |
| µQuant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo flow cytometry analysis software | FlowJo, LLC | Version 10 | |
| *All antibodies are anti-human unless otherwise stated. |
References
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
