Summary
Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.
Introduction
mayayı tomurcuklanan araştırma yaşlanma güçlü bir model organizmadır. Bununla birlikte, mayada, geleneksel bir ömrü deneyi sadece emek yoğun değil, aynı zamanda, düşük verimlilik, 1, 2 olan mikrodiseksiyon dayanır. yaşlandıkça Ayrıca, geleneksel mikrodiseksiyon yaklaşım bekar bir anne hücrelerde çeşitli hücresel ve moleküler özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamaz. Mikro-akışkan cihazlarının gelişimi maya ömrü ölçmek için hem de ana hücreleri, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ömrü boyunca moleküler işaretçileri ve çeşitli hücre fenotipleri takip otomatik bir prosedür sağladı. Maya hücreleri, bir mikro-akışkan cihazın içine yüklendikten sonra, bunlar otomatik zaman tur kullanılarak mikroskop altında izlenebilenE görüntüleme. Işleme araçları görüntülenmesi sayesinde, çeşitli hücresel ve moleküler fenotipleri, 3 elde edilebilir 6 kullanılarak elde edilmesi zor veya imkansız olan birçok vb ömrü, boyut, floresan haberci, hücre morfolojisi, hücre döngüsü dinamiği, dahil olmak üzere, 8, geleneksel mikrodiseksiyon yöntemi. Mikroakışkan cihazlar birkaç yıl önce 3, 4, 6, 7 başarılı gelişme beri maya yaşlanma araştırmalarında önem kazanmıştır. Çeşitli gruplar sonradan daha erken tasarımları 5 varyasyonları yayınlanan ve birçok maya laboratuarları kendi çalışma için microfluidic cihazlar kullanmışlardır.
üstel büyümeyi geçiren bir hücre kültüründe, gözlem için mevcuttur yaşlı anne hücre sayısı miniscu olduğunule. Bu nedenle, ömrü ölçümler için mikro-akışkan cihazının genel tasarım prensibi anne hücreleri korumak için ve kızı hücreleri kaldırmaktır. Bu tür tasarımlar maya asimetrik hücre bölünmesini uğrar gerçeği kullanır. Cihaz irade kapanı büyük anne hücrelerinde yapı ve izin küçük kızı hücreleri uzakta yıkanacak. Bu makalede açıklanan mikro-akışkan çip tuzak ana hücrelere yumuşak polidimetilsiloksan (PDMS) ped (dikey sarkık sütun) (Şekil 1) kullanır. Benzer bir tasarıma sahip cihazlar daha önce 3, 4, 6, 7 bildirilmiştir. Bu protokol microfluidic cihazlar ve zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için optimize edilmiş basit bir hücre yükleme yöntemi üretmek için daha basit bir prosedür kullanır. mikroakışkan cihaz önemli parametrelerden biri tuzak ana hücrelere kullanılan PDMS pedleri genişliğidir. Bizim dihaz hayatları boyunca izlenebilir taze anne hücrelerinin önemli bir kısmı dahil olmak üzere her yastık altında daha anne hücreleri tutabilir geniş yastıkları kullanır. Hücreler nesiller veya tüm ömrü boyunca bir gözlem gereklidir için izlenmesi gereken zaman ömrü ölçümlerine ek olarak, bu protokol, tek bir hücre zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için kullanışlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikon Gofret Kalıp İmalat
NOT: Işık maskesi AutoCAD yazılımı ile tasarlandı ve ticari bir firma tarafından üretilmektedir. Bu tasarım farklı desenler (üç kat içerir Ek İçerik 1 ). Birinci, ikinci ve üçüncü tabakaların yükseklikleri sırasıyla yaklaşık 4 um, 10 um ve 50 um olan. Silikon gofret kalıp yumuşak litografi 9, 10 kullanılarak photomask oluşturuldu.
- 10 dk su buharı buharlaşması için 200 ° C'da bir silikon gofret pişiriniz. Spin kat negatif fotorezist SU-8 silikon gofret üzerine.
Not: Spin kat SU-8 3005, 30 ilk bir tabaka oluşturmak için 5000 rpm'de, SU-8 2010 3000 rpm'de 30 ikinci bir tabaka oluşturmak için, ve SU-8 3025 2,000 rpm'de 30 saniye üretmek için üçüncü tabaka. - t önce kaplanmış gofret Yumuşak fırındaDesen transferini diye. Hizalayın ve bir maske hizalama kullanarak "doğrudan temas" modunda gofret maruz.
Not: Yumuşak fırında birinci tabaka, 95 ° C'de 2 dakika, ikinci tabaka 95 ° C 'de 3 dakika, ve üçüncü tabaka için 95 ° C' de 15 dakika süre ile çok ince bisküvi. 100 mJ / Birinci tabaka için cm2, 130 mJ / ikinci katman için cm2 ve 200 mJ / üçüncü katmanın için cm2'de maruz doz kullanın. - maruziyet sonrasında gofreti sonrası pişir ve SU-8 geliştirici kullanarak geliştirmek. N2 silah ve sert fırında 30 dakika 200 ° C 'de çok ince bisküvi ile gofret kurutun.
Not: silikon gofret kalıp model tarafı yukarı bakacak şekilde, File bandı kullanılarak 15 cm çaplı plastik Petri kabına sabitlenmiştir. Genellikle, çok sayıda mikro-akışkan kartları aynı zamanda imal edilmesini sağlar aynı kalıp, birçok aynı çip yapıları koydu. Her bir kalıp mikroakışkan fiş imal etmek için pek çok kez yeniden kullanılabilmektedir.
2. mikroakışkanÇip Fabrikasyon
- Bir denge üzerinde temiz bir tartı tekne yerleştirin ve dengeyi daralayın. tartmak tekne içine PDMS tabanının 50 g dökün.
- tartı teknesinde PDMS kürleme maddesi, 5 g ekleyin (ağırlık / PDMS tabanına 1:10 oranında ağırlık).
NOT: Bu hacim, kalıp ile bir 15 cm çaplı bir Petri tabağına dayanır. Farklı büyüklükte bir petri kabı kullanarak, eğer reaktif miktarını ayarlayın. - PDMS tabanı ve tek kullanımlık bir pipet ile sertleştirme ajanı karıştırılır. tartım kabı kenarından başlayıp yavaş yavaş içeri doğru hareket eder. küçük kabarcıklar karışım boyunca meydana kadar birkaç dakika süreyle iyice karıştırılır; Karışımın tam PDMS polimerizasyonu için esastır.
- yavaş Petri kabı içine dökün; Karışım, tam olarak silikon gofret kalıp kapsamalıdır.
- 10 dakika PDMS karışımından tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum içinde Petri tabağına yerleştirin. kabarcıklar karışımın yüzeyinde kalır ise, onları dışarı üflemek için bir pipet kullanın.
- silikon inkübeyaklaşık 2 saat süreyle 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS ile gofret kalıbı.
- Yavaşça gofret kalıp yapımı için herhangi bir zarar vermeden, silikon gofret kalıp kapalı polimerize PDMS tabaka soyun. Seçenek olarak ise, bir tek kenarlı endüstriyel jilet kullanılarak desen etrafında en az 5 mm aralık ile silikon gofret kalıp şirketinden PDMS kesme; hafifçe gofret kalıp kapalı PDMS katmanı soyun.
- model tarafı yukarı bakacak şekilde tezgah PDMS tabaka yerleştirin. Dikkatle yapı hasarı önlemek için her bir çip kenarından uygun bir devamlılığının bir tek kenar endüstriyel jilet ile tek tek çip kesip.
- yukarı bakacak şekilde model tarafı, her bir kanal tarafına düz bir şekilde giriş ve çıkış çevrelerine boyunca delikler bir zımba kalem (0.75 mm İD) kullanın.
NOT: Bu delikler ortamın akışı için yol oluşturun. Nedenle, çevrelerinde geçmesi ve PDMS tabakasının içinden tüm yol yumruk için çok önemlidir. Emin oldelikten PDMS sütunları kaldırın. - deliğe tekrar delme kalem iğne sokarak her delinmiş delik edin. İğne herhangi bir blokaj bulunmamaktadır belirten diğer taraftan dışarı gelebilir emin olun. Desen yüzeye bant uygulama yavaşça toz parçacıklarını temizlemek için bant soyulabilir. bu adımı en az üç kez tekrarlayın. sterilizasyonu korumak için PDMS üzerinde viski bant temiz bir parça bırakın.
- PDMS'den karşı tarafında bu işlemi tekrarlayın ve yanı üzerine bant son dilimini bırakın.
- 0,13-0,17 mm kalınlığında, 24 mm x 30 mm kapak camı hazırlayın. yüzey sterilize etmek için toz sökücü ile cam üzerinde% 70 etanol püskürtme ve kurutma; buna ek olarak, cam otoklavlanmış su ile yıkandı ve toz sökücü ile kurutulabilir.
- Plastik bir plakaya kapak cam ve PDMS aktarın. PDMS viski bandını çıkarın ve yukarı bakacak desen tarafını yerleştirin. Aktarım sırasında desen yüzeye sahip herhangi bir temastan kaçının.
- Dikkatle hidrofilik yüzeyler (plazma işlemi sırasında karşılaştığı yüzeyler), bağlantı, kapak camı üzerine PDMS yerleştirin. PDMS ve kapak cam arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- en az 2 saat boyunca 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS çip inkübe edin.
Not: Eksik mikro sıvılaştırma deney sırasında mikroskop üzerine sızıntıya neden olabilir. Bu nedenle, biraz cımbız ile kenarlarından PDMS kaldırarak PDMS ve kapak camı arasındaki bağı kontrol edilmesi önemlidir. Yavaşça başarılı bağı belirten kapak camı ayırmak gerektiğini PDMS kaldırarak.
3. Deney hazırlığı
- % 70 etanol çözeltisi ayrıca PDMS çip hazırlanmasından önce 1 gün içinde giriş ve çıkış boruları daldırın.
- tüpleri yıkamak için otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. şırınga üzerindeki tüp takmayı ve su ile tüp ateş basması her tüp yıkayın.
- etanol kalıntısını temizlemek için, yıkama adımı en az 3 kez tekrarlayın.
NOT: İlk defa cihaz yapma, özellikle yedekleme cips var olmasını sağlamak için adım 2'de tek seferde birden cips olun.
- 3.000 x g'de 5 dakika boyunca iki adet 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ml hazırlanan maya örneği (OD600 0.6-0.8) devri 1 ve santrifüj.
- Her bir tüpten yüzer çoğunluğu çıkarın ve 0.5 ml örnek oluşturmak üzere geri kalan birleştirir.
NOT: şırıngaya örnek emme kaçının.
NOT: ömrü ölçümleri için, görüntüler 40x amacı ile bir optik mikroskop ile her 15 dakikada alındı. flüoresan raportör analizi için, görüntüler 60X petrol amacı ile bir floresan mikroskobu ile bir kez, her 15 dakikada bir alındı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerden sonra, hücreler ve birçok hücresel ve moleküler fenotipleri yaşam süreleri kaydedilmiş zaman atlamalı görüntüleri elde edilebilir. her bir hücreden ekstre edilebilir, farklı bir dizi özellik olduğundan, analiz ilk adım, pozisyonları ve hücre sınırları ve izlenen çeşitli olayların zamanlama dahil olmak üzere hücreleri ve olayları, açıklama şekildedir tomurcuklanan olaylar olarak. Bu ek açıklamalar daha kolay gelecekte farklı özelliklere hücrelerin aynı setine dönmek ve analiz etmek için yapacaktır. Gibi ImageJ 11 ve ilgili eklentileri, görüntü analizi yazılımını kullanarak, fenotiplerin listesi daha sonra hücrelerin kayıt açıklamaları kullanarak resim verilerinden elde edilebilir.
mikroakışkan cihazı ile ölçülen fenotipleri birkaç örnek aşağıda verilmiştir. maya ömrü fenotipiHer hapsolmuş ana hücre tarafından üretilen tomurcukları sayısının sayılması ve Kaplan-Meier tahmin ile tahmin edilerek elde edilebilir. Başlangıçta mikroakışkan cihazlar içinde sıkışıp hücreler bilinmeyen yaştan bulunmaktadır. Bu bilinmeyen yaş gelen ömrü ölçümlerinin verevi en aza indirmek için, daha önceki yöntemler ömrü 4, 7 kalibre Yakalanan hücreleri üzerinde tomurcuk izleri ortalama sayısı kullanılır. Ancak, tomurcuk yara ölçümleri hücrelerin ilave boyanma gerektiren ve önyargı sadece dolaylı bir tahmin sağlayabilir. Bu protokolü kullanarak, cihaz sık zaten tuzağa hücrelerden kapalı budded taze kızı hücrelerini hapseder. Bu hücreler daha sonra anne hücrelerine dönüşür. Bu tür hücreler bizim mansap görüntü analiz yazılımı (Film 1) kullanılarak tespit edilebilir. Bunlar taze anne hücreleri daha doğru bir ömrü ölçümü sağlar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, taze ana hücrelerin ömrü eğrileri iştigal edildibilinmeyen yaş hücrelerin olanlarla kırmızı. Bu deneyde, taze anne hücrelerinin ortalama ömrü (medyan ömrü farkı yaklaşık 2 kuşak) biraz daha uzundu.
Tomurcukları, Şekil 3'te gösterildiği gibi, iki ardışık tomurcuklanan olaylar arasındaki zaman aralığı olarak diğer ilginç fenotip, sayısına ek olarak, görüntüleme verileri 3, 7, 8 elde edilebilir. Hücreler daha yavaş bir kaç başlangıç buddings aşağıdaki hızlı tomurcuklanma dönemine girdi. tomurcuklanma bu yaş hücrelerin sağlıksız durumunu belirten yaşamlarının sonuna doğru dramatik yavaşladı. Hücre döngüsü dinamikleri genç ve yaşlı hücrelerin hücresel durumuna dair çok faydalı bilgiler içerir ve telomeraz mutantlar 12 karakterize etmek, örneğin, kullanılmıştır. Önemli olan, bu cihaz olabiliryaşlanma sürecinin bir sürücü olabilir moleküler markörlerin takibi için izin ömrü (Şekil 4) boyunca floresan sinyalleri ölçmek için kullanılır.
Şekil 1: mikro-akışkan cihazının tasarımının şematik bir. Cihaz paralel olarak çalışabilir 6 bağımsız fonksiyonel modülden oluşmaktadır. Her bir modül, iki yan kanallara bağlı bir ana kanal yapılmıştır. Her bir yan kanal 113 sarkık sütun bulunmaktadır. Ek bir köprü, iki yan kanallar ile ana kanal bağlamak için orta ilave edilir. Daha küçük kızı hücreleri uzakta akışı ile yıkanır ise anne hücreleri pensile sütunlar altında sıkışıp vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Taze anne hücreleri bilinmeyen öyküsü olan hücrelerden daha uzun yaşar. bilinmeyen tarihinin hücrelere karşı taze anne hücrenin kopyalanma ömrü SD medya, 30 derece (hücreler deney başlangıcından itibaren sıkışıp). Ortalama olarak, taze anne hücreleri yaklaşık 2 kuşak uzun yaşar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: yaş hücre olarak aralıkları değişiklik tomurcuklanan uzunluğu. buddings arasındaki zaman dilimlerinde olarak ölçülen tomurcuklanma aralıkları renk kodlu, hücreler kendi çoğaltma ömrü tarafından emredildi edildi ve taze anne hücreleri Eylül edildibilinmeyen tarihin hücrelerinden arated. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: bir mikro akışkan cihazı kullanılarak Isı Şoku Faktör 1 (HSF1) aktivitesini ölçer. Hsf1-aktivite raportör HSE yukarı 13 ile sakat CYC1 promotöre kaynaşık, yeşil floresan proteini (GFP) ile inşa edilmiştir. Floresan görüntüleri her 30 dakikada alındı. GFP yoğunluğu daha sonra bir özel MATLAB 14 kullanılarak belirlenmiştir. her bir hücre için veri noktaları bağlı ve bir renkli hat ile gösterilir. Bu deneyde, soy bir gece boyunca 30 ° C'de% 2 glikoz (ağırlık / hacim) ile SD ortamı içinde büyütülmüştür; bu daha sonra geri kazanımı için aynı ortam ile seyreltildi. sonrasında,% 0.05 glukoz (ağırlık / hacim) ile SD ortamı floresans ölçüm sırasında mikro akışkan çip hücrelerin büyümesi için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: Taze anne hücrelerinin bir örneği bütün ömrü boyunca cihazın içinde hapsolmak. Film bir tuzağa hücreden doğan bir taze anne hücreyi gösterir. Filmin başında kırmızı ok taze anne hücre ve ilk tomurcuklanma konumunu işaretler. Bu anne hücresi onun bütün ömrü boyunca mikroakışkan cihaz sıkışıp oldu. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDMS cihazı taze yapılmış olması gerekmektedir. Aksi takdirde, cihaz içine tüpler sokulması neden olduğu hava kabarcıkları uzaklaştırmak için zor olacaktır. Adım 3.4 hücrelerini yoğunlaşarak hücre yükleme verimliliğini artırmak için önemlidir. Deneyin verimini arttırmak için aynı PDMS çip üzerinde 4 ila 6 modül bağımsız olarak çalışan pompalar genellikle eş zamanlı olarak 4 ila 6 farklı deneyler (farklı tür ya da ortam bileşimler) gerçekleştirmek için kullanılan bağlı.
(Mikrodiseksiyon kullanır), geleneksel maya replikatif yaşlanma deneyi ile karşılaştırıldığında, burada sunulan mikro-akışkan yöntemini daha az zahmetli ve zaman alıcıdır. Ayrıca, mikro-akışkan aygıt, hücre boyutu, hücre döngüsü dinamiği, hücre morfolojisi ve çeşitli moleküler markörler dahil olmak üzere çeşitli hücre ya da moleküler parametreler, ayrıntılı ölçümü için izin verir. Bu mikro akışkan yöntem istinat tarafından yüksek çözünürlüklü mikroskopi izlemeyi uzun vadeli hücresini eldekızı hücreleri olarak PDMS mikro yastıkları altında anne hücreleri otomatik olarak temizlendi.
Bu cihaz, Huberts ve diğerleri gibi benzer temel yapıya sahip, tuzak ana hücre 4 yumuşak PDMS mikro pedleri kullanır. eserinde 7'de tarif. Cihaz tasarımı ve deneysel protokollerde farklılıklar vardır. Bu cihaz daha geniş PDMS yastığı, bazı yeni doğmuş yavru hücrelerin tuzak ve (Şekil 2 ve 3, Film 1) analiz edilebilir. Bu tür hücreleri belirlemek için, tomurcuklanan olmadan akıp kızı hücrelerini görmezden zaten hapsolmuş ana hücrelerinden aşılı yavru hücreler, açıklamalı. Ortalama her PDMS ped başına yaklaşık 2 taze anne hücre aldılar. 2, yaklaşık üçte biri bütün ömrü boyunca cihazın tutuldu aralarında: bilinmeyen tarihinin hücrelere bu taze anne hücrelerinin oranı yaklaşık 1 oldu. Bu hücreler, daha doğru bir ömrü ölçümü, bir izind mümkün anne ve kızı hücreleri arasındaki korelasyon analiz yapmak. Bu cihazda, daha derin bir ana kanal, gözlemin yapıldığı iki sığ yan kanallar bağlanır; Bu tasarım büyük hava kabarcıkları tarafından engellenmiş yan kanalların olasılığını azaltmak için yardımcı olur. mikroakışkan yonga üretimi için, bu protokol, aynı zamanda, sadece bir başarı oranı artar plasma ve fırında pişirme kullanılarak PDMS ve cam kapak bağlanması için basit bir yöntem kullanır.
Bu protokol ile, mikro-akışkan cihaz vahşi tip haploid maya suşları (örneğin, BY4741 veya BY4742) için deneyin başlangıcında sağlam tuzak PDMS pedi başına en az bir hücre (ortalama 3-5 hücre) edebilmektedir. Hücrelerin yaklaşık% 30 onların bütün ömrü boyunca muhafaza edilebilir. Bu PDMS cihazın performansının sarkık sütunlar ve cam ve maya hücrelerinin boyutu arasındaki boşluk büyüklüğüne bağlı olduğu kayda değerdir. Yabani tip haploit maya suşları için,boşluk için uygun olan boyutu 3.5-4.5 um. Bu aralığın, keskin yükleme verimliliği ve hücre tutma oranı düşüş dışında. Bu nedenle, daha büyük veya daha küçük bir hücre boyutu 7 maya suşları için yeni cihazlar aşama 1 'de yapılan birinci tabakanın yüksekliği değiştirerek imal edilmelidir.
Özet olarak, bu makalede açıklanan cihaz ve protokol değil maya yaşlanma çalışmaları için uygundur, aynı zamanda anne hücrelerinin izleme ve nesillerdir veya ömrü boyunca moleküler belirteçlerin kontrol edilmesi gereken diğer denemeler için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Pure Ethanol, Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster™ | VWR | 16650-027 | |
| 5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip) | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028) | Component Supply Company | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | Component Supply Company | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
