Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Summary

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Introduction

Gist is een krachtige modelorganisme bij veroudering onderzoek. Echter, een gebruikelijke levensduur assay gist voert microdissectie, die niet alleen arbeidsintensief maar ook lage doorzet ^{1, 2.} Bovendien is de traditionele microdissectie aanpak voorziet niet in een gedetailleerde weergave van verschillende cellulaire en moleculaire kenmerken van de alleenstaande moeder cellen als ze ouder worden. De ontwikkeling van microfluïdische apparaten is een geautomatiseerd systeem voor gist levensduur te meten en om moleculaire merkers en verscheidene cellulaire fenotypes volgen gedurende de levensduur van de moedercellen ^{3, 4, 5, 6, 7, 8} ingeschakeld. Na gistcellen in een microfluïdische inrichting zijn geladen, kunnen zij worden gevolgd onder een microscoop met automatische tijdsafhankelijkee beeldvorming. Met behulp van beeldvorming bewerkgereedschappen kunnen verschillende cellulaire en moleculaire fenotypes worden geëxtraheerd ^{3, 6, 8,} zoals levensduur, formaat, fluorescente reporter, celmorfologie, cel cyclus dynamica, etc., waarvan vele zijn moeilijk of onmogelijk te verkrijgen met behulp de traditionele microdissectie methode. Microfluïdische apparaten hebben opgedaan bekendheid in gist veroudering onderzoek sinds hun succesvolle ontwikkeling van een paar jaar geleden ^{3, 4, 6, 7.} Verschillende groepen zijn vervolgens gepubliceerd op variaties van de eerdere ontwerpen ^5, en veel gist labs hebben microfluïdische apparaten gebruikt voor hun studie.

In een celcultuur exponentiële groei ondergaan, het aantal bejaarde moeder cellen die voor observatie beschikbaar zijn, is miniscule. Daarom is het algemene ontwerpprincipe van de microfluïdische inrichting voor levensduur metingen te moedercellen behouden en dochtercellen te verwijderen. Een dergelijk ontwerp maakt gebruik van het feit dat gist ondergaat asymmetrische celdeling. De structuren in de inrichting wil houden groter moedercellen en laten kleinere dochtercellen weg te wassen. De microfluïdische chip in dit artikel wordt een zachte polydimethylsiloxaan (PDMS) pad (verticaal hangend kolommen) te controleren moedercellen (figuur 1). Inrichtingen van vergelijkbaar type zijn eerder ^{3, 4, 6, 7} gemeld. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudiger procedure microfluïdische inrichtingen en een eenvoudige cel-laadmethode die is geoptimaliseerd voor de time-lapse imaging experimenten fabriceren. Een van de belangrijkste parameters in de microfluïdische inrichting is de breedte van de PDMS kussens gebruikt te controleren moedercellen. onze device gebruikt breder pads die meer moeder cellen onder elke pad kan houden, met inbegrip van een aanzienlijk deel van de verse moeder cellen die gedurende hun levensduur kunnen gevolgd worden. Naast levensduur metingen Dit protocol is bruikbaar voor enkele cel time-lapse imaging experimenten wanneer de cellen moeten worden bijgehouden voor vele generaties of bij een waarneming gedurende de gehele levensduur noodzakelijk.

Protocol

1. Silicon Wafer Mold Fabrication

LET OP: Het fotomasker is ontworpen met AutoCAD-software en vervaardigd door een commerciële onderneming. Dit ontwerp bevat drie lagen van verschillende patronen ( aanvullend bestand 1 ). De hoogten van de eerste, tweede en derde lagen zijn ongeveer 4 urn, 10 urn en 50 urn respectievelijk. De siliciumwafel matrijs is samengesteld uit het fotomasker met behulp van zachte lithografie ^{9, 10.}

1. Bak een siliciumwafel bij 200 ° C gedurende 10 minuten om de waterdamp verdampt. Spin-coat negatieve fotolak SU-8 op de siliciumwafel.
   OPMERKING: Spin coat SU-8 3005 bij 5000 rpm gedurende 30 s op de eerste laag te genereren, SU-8 2010 bij 3000 rpm gedurende 30 s op de tweede laag genereren en SU-8 3025 bij 2000 rpm gedurende 30 s op het genereren derde laag.
2. Soft-bak de beklede wafel vóór thij patroon overdracht. Uitlijnen en bloot de wafer "direct contact" modus met een masker aligner.
   OPMERKING: Zachte bakken de wafer gedurende 2 minuten bij 95 ° C voor de eerste laag, 3 min bij 95 ° C voor de tweede laag, en 15 min bij 95 ° C voor de derde laag. Met de belichtingsdosis van 100 mJ / ^cm2 gedurende de eerste laag 130 mJ / cm ² voor de tweede laag, en 200 mJ / ^cm2 voor de derde laag.
3. Na blootstelling, post-bak de wafer en te ontwikkelen met behulp van SU-8 ontwikkelaar. Drogen van de wafel via een _N2 pistool en hard bakken de wafel op 200 ° C gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: De siliciumwafel mal is bevestigd aan een 15 cm diameter plastic Petri schaal met plakband, de patroon naar boven. Meestal zetten we verschillende identieke chipstructuren op dezelfde mal, waardoor meerdere microfluïdische chips te vervaardigen tegelijk. Elke vorm kan worden hergebruikt vele malen microfluïdumchips fabriceren.

2. Microfluidischechip Fabrication

1. Plaats een schone wegen boot op een evenwicht scheurde de balans. Giet 50 g van PDMS base in de wegen boot.
2. Voeg 5 g PDMS hardingsmiddel aan de gewichtboot (w / w-verhouding van 1:10 tot het PDMS base).
   Opmerking: Dit deel is gebaseerd op een 15 cm diameter Petrischaal met de mal. Pas de hoeveelheid reagens bij gebruik van een petrischaal van een ander formaat.
3. Roer de PDMS base en het hardingsmiddel met een wegwerpbare pipet. Start vanaf de rand van het gewicht van de boot en langzaam naar binnen te verplaatsen. Roer grondig gedurende enkele minuten tot kleine belletjes gehele mengsel; doormenging is essentieel voor PDMS polymerisatie.
4. Giet het mengsel langzaam in de petrischaal; het mengsel moet volledig bedekken de siliciumwafel matrijs.
5. Plaats de petrischaal in een vacuüm gedurende 10 minuten om alle luchtbellen uit het mengsel te verwijderen PDMS. Indien bellen op het oppervlak van het mengsel blijven Gebruik een pipet om ze te blazen.
6. Incubeer het siliciumwafer mal met PDMS in een oven bij 75 ° C gedurende ongeveer 2 uur.
7. Haal voorzichtig de laag gepolymeriseerd PDMS van de siliciumwafel matrijs, om beschadiging aan de constructie van de wafel matrijs. Alternatief snijd de PDMS rechtstreeks van de siliciumwafel matrijs minimaal 5 mm marge rond het patroon met een enkele industriële edge scheermes; zachtjes schil de PDMS-laag van de wafel matrijs.
8. Plaats de PDMS-laag op de bank met het patroon naar boven. Knip de individuele chip met één zijde industriële scheermesje vasthouden van een adequate marge van de rand van elke afzonderlijke chip constructie te voorkomen.
9. Met het patroon naar boven, gebruikt een stempel pen (0,75 mm ID) perforeert recht door de inlaat en uitlaat cirkels aan elke zijde van de kanalen.
   LET OP: Deze gaten maken het pad voor de stroom van medium. Daarom is het van cruciaal belang om te gaan door de cirkels en punch helemaal door het PDMS laag. Zorg ervoor datVerwijder de PDMS kolommen uit het gat.
10. Controleer elke gaatje door het invoegen van de punch pen naald weer in het gat. Zorg ervoor dat de naald kan komen van de andere kant, wat aangeeft dat er geen blokkade. Toepassing tape op het patroonoppervlak vervolgens voorzichtig afpellen de band stofdeeltjes reinigen. Herhaal deze stap ten minste drie keer. Laat een schone stukje plakband op de PDMS aan sterilisatie te handhaven.
11. Herhaal deze procedure aan de andere zijde van de PDMS en laat het laatste stukje tape op ook.
12. Bereid een 24 mm x 30 mm dekglas met een dikte van 0,13-0,17 mm. Spray 70% ethanol op het glas en droog met stofverwijderaar het oppervlak te steriliseren; daarnaast kan het glas worden gewassen met geautoclaveerd water en gedroogd met stofverwijderaar.
13. Breng de dekglaasje en PDMS een kunststofplaat. Verwijder het plakband van de PDMS en plaats het patroon naar boven. Vermijd elk contact met het patroon oppervlak tijdens de overdracht.
14. Plaats het PDMS op het afdekglas, verbinden zowel hydrofiele vlakken (de vlakken die zich geconfronteerd tijdens de plasmabehandeling). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de PDMS en het deksel glas.
15. Incubeer de PDMS chip in een oven bij 75 ° C gedurende ten minste 2 uur.
    OPMERKING: deficiënte microfluïdische kan vloeistoflekkage veroorzaken op de microscoop tijdens het experiment. Daarom is het belangrijk om de hechting tussen de PDMS en dekglas controleren door iets optillen van de PDMS van de randen met een pincet. Voorzichtig op te tillen het PDMS moet het niet afgescheiden van het dekglas, wat wijst op een geslaagde verbinding.

3. Voorbereiding op de Experiment

1. Dompel de input en output buizen in 70% ethanoloplossing afzonderlijk 1 dag vóór PDMS chip voorbereiding.
2. Vul een 5 ml spuit met geautoclaveerd water om de buizen te wassen. Wassen elke buis door het aansluiten van de buis van de spuit en het spoelen van de buis met water.
3. Herhaal de wasstap minstens 3 keer met ethanol residu reinigen.

Onderzoek de PDMS kanalen onder een optische microscoop met een 10x objectief te zorgen dat de consistent is en intact. Stabiliseren van de PDMS chip op de microscoop platform via plakband.
OPMERKING: Maak meerdere chips op een bepaald moment in stap 2 om ervoor te zorgen dat er een back-up chips, vooral als het maken van het apparaat voor de eerste keer.

Vul een 5 ml spuit met geautoclaveerd water. Bevestig de spuit om een ​​injectiepomp en steek de bijbehorende input en output buizen. Stel de wassnelheid 750 ul / uur om de chip te spoelen gedurende 10 minuten. De luchtbellen aan de aftakkingskanalenmoet tijdens deze periode worden weggewassen; blijven er dan nog bellen, handmatig de snelheid aan te passen om de bubbels te elimineren.

Gist monster voorbereiding.

1. Breng 1 ml gist bereide monster _(OD600 0,6-0,8) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer 5 min bij 3000 x g.
2. Verwijder het merendeel van de supernatant van elke buis en voeg de rest een 0,5 mL monster te vormen.

Pauzeren injectiespuitpomp en verwijder de invoerbuizen van de PDMS chip.

Handmatig achteruit de injectiespuitpomp met een kleine luchtbel zuigen (1-2 cm lang) in elke invoerbuis. Ga verder te zuigen in de gist monster; de luchtbel zal de sample grens te laten zien en aan te geven hoeveel monster is getrokken.
OPMERKING: Vermijd het opzuigen van het monster in de spuit.

Plaats de invoerbuis terug in de PDMS chip en de pomp te herstarten om de cellen bij een snelheid van 750 ul / h geladen.

Laat de spuitpomp gedurende 10 minuten den en onderzoekt de celbelasting progressie onder de microscoop; een succesvolle laden zal val cellen onder meer dan 60% van de op te schorten pijler.

Overschakelen naar voedingsoplossing en de snelheid tot 400 ul / h voor celkweek passen.

Selecteer observatie posities voor de microscoop.
OPMERKING: Bij levensduur metingen beelden werden eens 15 min door een optische microscoop met een 40x objectief. Voor de fluorescente reporter analyse werden beelden eens 15 min door een fluorescentiemicroscoop met een 60x olie doelstelling.

Representative Results

Na de experimenten, kan de levensduur van de cellen en vele moleculaire en cellulaire fenotypes worden geëxtraheerd uit de opgenomen time-lapse beelden. Aangezien er een aantal verschillende functies die kunnen worden gewonnen uit elke cel, de eerste stap van de analyse is om de cellen en gebeurtenissen, zoals de positie en de grenzen van de cellen en het tijdstip van verschillende gebeurtenissen die worden bijgehouden aantekeningen, zoals als het ontluiken events. Deze annotaties zal het gemakkelijker maken om terug te keren naar dezelfde set cellen en analyseren van verschillende functies in de toekomst. Via beeldanalyse software zoals ImageJ ¹¹ en de bijbehorende plugins, kan een lijst van fenotypen vervolgens geëxtraheerd uit de beeldgegevens met de geregistreerde annotaties van de cellen.

Hieronder volgen enkele voorbeelden van fenotypen gemeten met de microfluïdische apparaat. De levensduur fenotype van gistkunnen worden verkregen door het tellen van het aantal kiemen door elk ingevangen moedercel en het schatten van de Kaplan-Meier schatter. De cellen in eerste instantie gevangen in de microfluïdische apparaten zijn van onbekende leeftijden. Om de voorspanning van levensduur metingen afkomstig van deze onbekende leeftijden minimaliseren eerdere werkwijzen gebruikt het gemiddelde aantal knoppen littekens op de gevangen cellen om de levensduur ^{4, 7} kalibreren. Echter, knop litteken metingen vereisen de extra kleuring van cellen en geven slechts een indirecte schatting van de bias. Met dit protocol, de inrichting vallen vaak nieuwe dochtercellen die uit ging bloeien van reeds ingevangen cellen. Deze cellen zetten dan in moeder cellen. Dergelijke cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van onze stroomafwaartse beeldanalysesoftware (Film 1). Deze verse moeder cellen zorgen voor een meer accurate levensduur meting. Zoals getoond in figuur 2, de levensduur krommen verse moedercellen werden bedrijrood met die van de cellen van onbekende leeftijd. In dit experiment, de gemiddelde levensduur van de verse moeder cellen was iets langer (ongeveer 2 generaties verschil in mediane levensduur).

Naast het aantal kiemen, andere interessante fenotypes, zoals het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende ontluikende gebeurtenissen, zoals getoond in figuur 3, kan worden gewonnen uit de beeldgegevens ^{3, 7, 8.} Cellen ging een periode van snellere ontluikende volgen van een paar langzamere aanvankelijke oculaties. De ontluikende vertraagd dramatisch aan het einde van hun levensduur, met vermelding van de ongezonde toestand van deze oude cellen. De celcyclus dynamiek bevat zeer nuttige informatie over de cellulaire toestand van de jonge en oude cellen en is gebruikt, bijvoorbeeld om telomerase mutanten ¹² karakteriseren. Belangrijker is dat dit apparaatgebruikt om fluorescentiesignalen gehele levensduur (figuur 4) te meten, waardoor het volgen van moleculaire merkers die de bestuurder van het verouderingsproces zijn.

Figuur 1: een schema van het ontwerp van de microfluïdische apparaat. De inrichting bestaat uit 6 onafhankelijke functionele modules die parallel. Elke module bestaat uit een hoofdkanaal aangesloten op twee zijkanalen. Elk zijkanaal heeft 113 pensile kolommen. Bijkomend brug is toegevoegd in het midden om het hoofdkanaal met de beide zijgeleiders sluiten. Moedercellen worden gevangen onder de pensile kolommen, terwijl de kleinere dochtercellen verwijderd door de stroom wordt gewassen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Fresh moeder cellen langer leven dan cellen met onbekende geschiedenis. De replicatieve levensduur van verse moeder cellen versus cellen van onbekende geschiedenis (cellen gevangen vanaf het begin van het experiment) in SD-media, 30 graden. Gemiddeld verse moeder cellen wonen ongeveer 2 generaties langer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: De lengte van ontluikende intervallen veranderingen cel leeftijd. Ontluikende intervallen gemeten als tijdframes tussen oculaties werden kleurcodering cellen werden gerangschikt volgens hun replicatie levensduur en verse moedercellen werden septemberarated uit cellen van onbekende geschiedenis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Het meten van de activiteit van heat shock factor 1 (HSF1) met een microfluïdische apparaat. De reporter HSF1-activiteit geconstrueerd door een groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd aan een kreupele CYC1 promoter stroomopwaarts HSE ^13. Fluorescentie beelden werden genomen om de 30 min. GFP-intensiteit werd vervolgens gekwantificeerd met behulp van een aangepaste MATLAB code ^14. Gegevens punten voor elke enkele cel zijn aangesloten en aangeduid met een gekleurde lijn. In dit experiment werd de stam gekweekt in SD-medium met 2% glucose (gew / vol) bij 30 ° C overnacht; Het werd vervolgens verdund met hetzelfde medium gedurende herstel. Nadien,SD-medium met 0,05% glucose (gew / vol) werd gebruikt om cellen te kweken in de microfluïdische chip tijdens de fluorescentiemeting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1: Een voorbeeld van verse moeder cellen wordt opgesloten binnen de inrichting voor de hele levensduur. De film toont een frisse moeder cel geboren uit een gevangen cel. De rode pijl aan het begin van de film markeert de positie van de verse moeder cel en zijn eerste ontluikende. Deze moeder cel werd opgesloten in de microfluïdische apparaat voor zijn gehele levensduur. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

De PDMS apparaat moet vers worden gemaakt. Anders zullen de luchtbellen veroorzaakt door het inbrengen van buizen in de inrichting moeilijk te verwijderen. Stap 3.4 is belangrijk voor de celbelasting efficiëntie door het concentreren van de cellen. Om het debiet van het experiment te verhogen, 4-6 modules op dezelfde PDMS chip verbonden met autonoom werkende pompen worden gewoonlijk gebruikt voor het uitvoeren 4-6 verschillende experimenten (verschillende stammen of mediacomposities) tegelijk.

Vergeleken met de gebruikelijke gist replicatieve veroudering test (die microdissectie gebruikt), de microfluïdische hier gepresenteerde methode is minder omslachtig en tijdrovend. Bovendien is de microfluïdische inrichting maakt de gedetailleerde kwantificering van verscheidene cellulaire of moleculaire parameters, zoals celafmeting, celcyclus dynamica, celmorfologie en verschillende moleculaire markers. Deze microfluïdische werkwijze bereikt langdurige cel monitoring met de hoge-resolutie microscopie door het behoudmoedercellen onder PDMS micro-elektroden zoals dochtercellen worden automatisch gespoeld.

Dit apparaat maakt gebruik van zachte PDMS micro-elektroden te controleren moedercellen ^4, waarbij de basisstructuur overeenstemmen doordat Huberts et al. beschreef in zijn werk ^7. Er zijn een aantal verschillen in inrichtingsontwerp en experimentele protocollen. De bredere PDMS kussen in deze inrichting voorziet in een aantal pasgeboren dochtercellen worden gevangen en geanalyseerd (Figuren 2 en 3, Film 1). Om dergelijke cellen te identificeren, we geannoteerde de dochter cellen gebloeid had van al gevangen moeder cellen, het negeren van de dochter cellen die weggespoeld zonder dop. Gemiddeld kregen we ongeveer 2 verse moeder cellen per PDMS pad. De verhouding van deze nieuwe moedercellen de cellen van onbekende geschiedenis ongeveer 1: 2, waaronder ongeveer eenderde in de inrichting werden gedurende de gehele levensduur. Deze cellen maken een nauwkeuriger meting een levensduurd maken het mogelijk om correlaties tussen moeder en dochter cellen te analyseren. In deze inrichting wordt een diepere hoofdkanaal aangesloten op twee zijkanalen ondiepere waar de waarnemingen gedaan; dit ontwerp helpt om de kans dat de zijkanalen wordt geblokkeerd door grote luchtbellen te verminderen. Voor microfluïdische chip productie Dit protocol maakt ook een eenvoudige methode om de PDMS en afdekglas hechten, onder gebruik van plasmablootstelling en oven bakken, waarbij het succespercentage stijgt.

Dit protocol, het microfluïdische apparaat kan robuust ten minste één cel (3-5 cellen gemiddeld) per PDMS blok val aan het begin van het experiment wildtype haploïde giststammen (dwz BY4741 of BY4742). Ongeveer 30% van de cellen kunnen gedurende hun gehele levensduur worden gehandhaafd. Het is vermeldenswaard dat de prestaties van de PDMS apparaat hangt af van de grootte van de opening tussen de pensile kolommen en het glas en de grootte van de gistcellen. Voor wildtype haploïde giststammen, hetgeschikte afmeting voor de opening is 3,5-4,5 urn. Buiten dit bereik, het laden efficiency en het behoud cell rate daling fors. Derhalve moeten nieuwe inrichtingen voor giststammen met grotere of kleinere celgrootte ⁷ worden vervaardigd door wijziging van de hoogte van de eerste laag in stap 1.

Samenvattend, de inrichting en het protocol beschreven in dit artikel zijn niet alleen geschikt voor gist veroudering studies maar ook toepasbaar op andere experimenten die het volgen van moedercellen en monitoring van moleculaire merkers voor vele generaties of gehele levensduur vereist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Pure Ethanol, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip)	Becton, Dickinson and Company	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)	Component Supply Company	SWTT-22
Needle Assortment	Component Supply Company	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	Fisher Scientific	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B