Introduction
実験用マウスのための新しい洗練戦略の開発は、実験動物科学1の3Rにの履行（交換、縮小、および洗練）に寄与する困難な作業です。洗練の分野での改善はさらに実験的な目的のために使用される動物の数百万人の幸福に貢献することができます。したがって、集中的な研究は、フィールドで必要とされます。これはまた、欧州連合の指令63分の2010の定義された目的です。指令63分の2010 / EUは、実験動物の寿命の経験を強化する必要があることを指摘し、（条3.7）2」の事業所は、慣れや訓練の動物に適したプログラム、手順およびプロジェクトの長さを設定しなければならない」ということ。
彼らは維持し、実験のために飼育されている間に、実験動物は、多くのストレスの多い状況を体験することができます。労働者間の通常、相互作用atoryマウスおよび責任者はかなり限られています。したがって、信頼関係が発展することはできません。これは、動物3、4、5、6の動作と生理、したがって、健康に有害である処理に反応して増大した不安とストレスを誘発することができます。また、日常的に、一般的な取り扱いなどの実験手順を行って拘束し、血液または組織のサンプリングは、このようなストレスホルモンや行動7、8などの異なるパラメータを測定することによって調べることができるストレス応答を引き起こす可能性があります。処理プログラムを効率的に実験用げっ歯類9、10、11に研究者に向けて不安を減少させることができることが示されています。したがって、動物を「改善することができるの処理プログラム条件とは、動物福祉5にかなり貢献できます。
本研究の目的は、特定の処理プログラムとしてマウス用の正の強化トレーニングを導入することです。正の強化トレーニングは研究者に動物の行動を形作るための手段を提供しますオペラント条件付けの一形態です。動物は、所望の動作を行う場合には、正の刺激（ここでは、食物報酬）が続きます。その意図は、動物がそれぞれの行動に報酬をリンクすることです。クリッカートレーニングは、クリッカーの音」をクリックして「調整二次補強材を使用して、正の強化トレーニングの形で、特定の動作12を強化することが証明されました。
具体的には、クリック音は、行動と今後の報酬13との間の 「時間ブリッジ」として機能します。動物は、所望を行う際トレーナーは正確にクリックします動作は、任意の時間なしで14を遅らせ、その後、食品の報酬を提示します。これは、より高い頻度で実行されます報わ挙動を、強化しています。クリッカートレーニングは広くコンパニオンアニマルと一緒に使用され、それが成功したヒト以外の霊長類13、15、16で実装された実験動物学、にその方法をしました。オペラント条件付けパラダイムで攻撃したときにマウスが迅速むしろ学ぶように、第二補強材の導入は、彼らの認知能力5、17、18、19を無理しないでください。
マウスの維持にクリッカートレーニングを導入することにより、我々は、認知濃縮を体験してマウスを有効にします。認知濃縮のデザインは、SOLVに彼らの認知スキルを使用するマウスを有効にする必要がありますその環境20、21の制御を取得する電子の問題と。異なる種とのいくつかの研究では、キャプティブ動物22の福祉に対する認知濃縮のプラスの影響を証明する23、24。正常に環境問題に対処する動物の能力を強化することは、それらのウェルビーイング25、26に貢献しています。
動物が彼らの一生の間にストレスの低レベルを経験する場合は、それらの生物医学研究で発生するストレス要因に直面したときに有害な対処戦略を開発することが少ない傾向があります。したがって、認知濃縮の一貫性のある実装は、被験者の表現型の均一化に寄与することができます。それが必要な被験者の数を減らすことができ、これは、還元の3R原則に貢献します統計的要件27を満たすことができます。
簡単に実験用マウスを維持する日課に統合することができます信頼性の高いプロトコルを開発することによって、我々は、実質的に福祉の生涯の経験を向上させることができます。
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Protocol
倫理声明：マウスおよび実験手順の取り扱いは、国内、欧州、および動物のケアのための施設のガイドラインに従って行いました。
注：このプロトコルは、週末（土曜日と日曜日）に休憩して、介入の5日間（月曜〜金曜）が含まれています。プロトコルは、容易に特定のニーズを満たすように構成することができます。
1.第二補強材として適した報酬の決定
注：このような食品安全基準を満たしている真空パック食品または動物飼料として、食品の報酬を使用してください。例えば、ナッツ、チョコレート、グミ、またはドライフルーツの種類が適切です。
- ホームケージ（ 図1）に異なる食品の報酬（0.5センチメートル3個）の持つ小さなペトリ皿を挿入します。
- 10分後、残り物を確認してください。
- すべての報酬が10分後に食べられる場合嗜好を推定することができるまでの期間を短くします。
- 日に4と5（ 例えば、Thursdayおよび金曜日）、報酬にケージにすべてのマウスのふりを確立するために、ホームケージに好ま（「勝者」の少量）の報酬を追加します。
- マウスは、マウスのトンネルに慣らされていない場合は、（週末にかけて、少なくとも2日間のトレーニングを開始する前に、 例えば）をケージにトンネルを追加。
- （水曜日に例えば、月曜日）3日連続での1.4 -を繰り返して、1.2を繰り返します。
2.クリッカートレーニング
- 各トレーニングセッションのための準備
注：マウスはこのプロトコルでリフトアップする必要があるたびに、静かで穏やかな方法でそれを持ち上げます。それを持ち上げるために、マウスの下に手を入れてください。最初の数回の間に、マウスが攪拌されることがありますが、馴化工程は、数日後に終了します。このステップは困難を作成する場合、28 "開いた手ですくう"のためのプロトコルを参照することが有用です。- 寝具材料とケージを準備します。
- トラ静かな場所に訓練されたマウスのケージnsfer。
- 報酬を準備し、タイマーと準備クリッカー/ターゲット・スティックの組み合わせを持っています。
注：マウスは取り扱いに慣れさせ、すでに実験者との信頼関係を持っている場合は、マウスは手で供給することができます。それ以外の場合は、マウスは実験者からの距離を保つことができるようにスティックや鉗子へのご褒美を添付してください。 - 今トレーニングエリアとしてホームケージからすべてのオブジェクトを削除します（ 等 例えば、マウスの家、巣、建材、。）。
- 準備されたケージにケージの仲間を転送します。
- すべてのトレーニングセッションのために適用される一般的なルール
注：以下の一般的な規則はすべてのセッションに適用し、プロトコル全体に再び言及されることはありません。- 5分間の各マウスを訓練します。 30-sの代替トレーニングおよび15-sのブレーク期間。
- マウスはもはや秒より報酬にかじるみましょうありません。そして、ケージの外に（報酬付き）スティックを取ります。
- やりがいの以下のパターンを実行します。
1 - 行動の10公演：たびに報酬を与えます。
11 - 行動の21性能：毎秒時間に報います。
上の行動の22パフォーマンスから：すべてのサード時間に報います。 - トレーニングの4分後、目的の動作の次のパフォーマンスは、大当たりの報酬によって補強されています。マウスは以前よりも3倍長い食品の報酬でかじるすることを可能にします。
- トレーニングセッション1日目：「食品の報酬で二次補強のリンク」
- 5分、プレススタートにタイマーを設定し、ホームケージにマウストンネルを追加します。
注：マウスの生得的な接触走性を活用し、次の壁（ 図2）にトンネルを配置します。最初のいくつかのセッションでは、これがトンネルに入るマウスの確率を向上させます。 - マウスはトンネルを検査するまで待ちます。すぐ覚書としてeはクリックして、トンネルの終わりに報酬を提示し、トンネルに入ります。
- トンネルに座っている間、報酬上のマウスフィードをしてみましょう。
- マウスがトンネルに座っている間に15秒間連続してクリックしてください。
- すぐにマウスがトンネルを出るとき、3.2に戻ってください。
- 5分、プレススタートにタイマーを設定し、ホームケージにマウストンネルを追加します。
- トレーニングセッション日2から5： "トンネルを経由して実行」
- 5分、プレススタートにタイマーを設定し、ホームケージにマウストンネルを追加します。
- すぐにマウスがトンネルに入ると、クリックして、トンネルの終わりに報酬を提示します。
- 限りマウスがトンネル内にあるように、クリックして、すぐに同じように報酬を提示します。
- 次の30秒ごとにこれを繰り返し、その後、ケージの外にトンネルを取るために15秒間一時停止します。
- 再びトンネルを追加して、マウスがトンネルに再び入るとき、すぐ]をクリックします。
- トンネルの終わりに報酬を提示します。
- マウスは最大1秒かじるすることができます。 報酬を奪います。
- すぐにマウス自体が再入力トンネルを始めると、トンネルの終わりの前の報酬（ 図3）を提示。
- トレーニングセッションの週2：「ターゲット・スティックに続いて "
- 5分、プレススタートにタイマーを設定し、ケージ内のターゲット棒の端に地球を配置します。
- すぐにマウスは世界中の関心を示すように、次の地球儀（ 図4、図 5）に報酬をクリックして提示します。
- それは、その鼻と地球に触れた後にのみ、マウスを報います。
- マウスが報酬に実行されたアクションをリンクした場合、トレーニングセッション（ 図6）の間に地球の位置を変更します。
- この最後の課題に対応するために、マウスを待ちます。
- ケージに地球を配置します。
- マウスが地球に触れる直前に、ゆっくりと慎重に1センチメートルによって地球の位置を変更します。 クリックして、マウスが距離を越えて地球を触れた場合に報酬を与えます。
- マウスは確実に次のまで、この手順を繰り返します。
- ゆっくりとマウスが交差しなければならない距離を伸ばします。
- トレーニングセッションの週3：「実験者の手にターゲットスティックに続いて "
- クリッカー/ターゲットスティックの組み合わせともう一方の手で報酬を保持しながら訓練ケージに片手を置きます。
- 5分、プレススタートにタイマーを設定し、次のハンドにこだわるターゲットの終わりに地球を配置します。
- すぐにマウスは世界中の関心を示すように、クリックして、地球の隣の報酬を提示します。
- すぐにマウスがこの挑戦を満たしているとして、手にいくつかのステップ近い地球を移動します。
- 手のひらに地球を配置します。クリックして、マウスは手のひら（ 図7）の上に座っている間に報います。
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Representative Results
最初にも最も重要なステップの一つは、適切な食品の報酬の決意でした。したがって、マウスは、ペトリ皿（ 図1）にナッツ、糖溶液、マーマレード、チョコレートの種類の異なる種類を提供しました。我々の経験では、マウスは、ホワイトチョコレートのための明らかな選好を示しました。したがって、我々はすべてのそれ以上のトレーニングプロセスのためにホワイトチョコレートを使用しました。
実際のトレーニングは、各性別の12 BALB / cの近交系マウスのコホートで実施されました。全てのマウスは、トレーニングに非常に興味を持っていました。トレーニングの成功を評価するために、我々は目的の動作の適切な性能をチェック：（ 図4）「目標スティック以下」。訓練を受けたマウス-すべての雌マウスと雄マウス-続くターゲットスティックの83％の大部分（ 図8）。雌マウスは、高を表示しましたえー、一般的に訓練のためのモチベーションとトレーニングセッションを通して、より高い周波数のそれぞれの動作を行いました。雄マウスは、わずか50回、5分ごとにこの動作を表示するのに対し、研修の4日間を完了した後、雌マウスは、5分ごとに64回の平均値と目標スティックを行いました。 5分では、「手のひらに次の"タスクは、雌マウスと雄マウス（ 図9）で35倍に平均55回で実施しました。
訓練は、訓練を受けたマウスの幸福にプラスの効果があったかどうかを確認するために、我々は訓練を完了した後の操作に対する耐性を評価しました。したがって、マウスはsinglehandedly拘束した一方で、我々は不安関連行動を分析した（ すなわち、首筋や片手で尾の付け根把握）15秒間を。自発的な排尿、排便や発声を記録しました。訓練されていないが、優しく扱わギンザケ雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスのRTは、対照群としての役割を果たしました。訓練を受けたマウスは、訓練を受けていないマウスよりも不安関連行動の有意に低い周波数を表示しました。 （ 図10）。モリス水迷路試験を行いながら処理に連結された発声を記録する場合、同様の結果が得られた（ 図11および12 図 ）。訓練を受けたマウスは、訓練を受けていないマウス（ 図11）と有意に減少したマウスをきゅっとあたりキュッキュの総数よりも大幅に少ないsqueaked。この問題をさらに評価するために、我々は、モリス水迷路試験中に浮遊挙動を分析しました。モリス水迷路試験中に浮遊動作はマウスが泳いされるのではなく、単に表面に浮いている期間として記載されています。このうつ関連のフローティング動作が大幅に訓練を受けたグループ（ 図12）に低下することが判明しました。
可能性のある報酬の 1 プレゼンテーション図 。報酬のプレゼンテーションのための6つの位置は、ペトリ皿にマークされています。
図2。 マウストンネルの位置。トンネルに入るマウスの確率を高めるために、トンネルは、ケージ壁の隣に配置されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 報酬を提示します。 TUの終わり外の報酬を提示するための適切な位置nnelが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
4.トレーニングの成功図。訓練されながら訓練を受けたマウスは、ターゲットスティックに従います。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. やりがい。マウスは、トレーニングセッション中に、次の目標スティックに報われます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6は、トレーニングの第2週におけるターゲットスティックポジションを交互に。トレーニングスティックの位置は、この模式図に示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
7. トレーニングの成功図 。マウスは、トレーナーの手にターゲットスティックを踏襲しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8. トレーニングプロトコルの成功。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスのコホートは、訓練を受けました。トレーニングセッションの週2の終わりまでに：「ターゲット・スティックに続いて、「すべての雌マウスと雄マウスの83％が正常に挑戦を克服しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
トレーニングの1週間後にそれぞれの行動の9繰返し図。雌雄各飼育したマウスにおける 12 BALB / Cのコホートは、訓練を受けました。 3「目標スティックに続いて "：トレーニングセッションの週2の最後の日には「手にターゲットスティックに続いて"、それぞれの動作の繰り返しは、5分間のトレーニングセッション中にカウントしました。両方の週では、雌マウスdisplayed雄マウスよりも有意に高い頻度で強化行動（「ターゲットスティック」：63.92±3.72、P = 0.0300; "また"：54.92±4.01、P = 0.0069）。強化された行動の頻度が大幅に週2から3週間に雌マウスでは変化しませんでした。しかし、雄マウスは（：;：35.92±5; P = 0.0408 "また" 50.42±4.48 "Targetはスティック」）週3週2から繰り返しの有意な減少を示しました。マン - ホイットニーU検定を行いました。データの結果は、平均±SEMとして表した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
首筋ホールディングを契機に、図10に表示され行動。各sの12 BALB / cの近交系マウスのコホート元は、クリッカートレーニングプロトコル以下の訓練を受けました。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスの訓練を受けていないが、優しく扱わコホートを対照群として役立ちました。マウスはsinglehandedly拘束した（ すなわち、首筋や片手で尾の付け根把握）15秒間を。自発的な排尿、排便、および発声を記録しました。訓練を受けたの表示動作と対照群との間に深い差がありました。訓練を受けたマウスは、訓練を受けていないマウスよりも有意に低い周波数ですべての行動を示しました。 （「排尿」：P <0.001; "排便"：P <0.001; "発声"：P <0.001）。マン - ホイットニーU検定を行いました。カラムは、試験したすべてのマウスの百分率として表されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55415 / 55415fig11.jpg" />
図11は、モリス水迷路試験中にビヘイビアを表示します。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスのコホートは、クリッカートレーニングプロトコル以下の訓練を受けました。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスの訓練を受けていないが、優しく扱わコホートを対照群として役立ちました。モリス水迷路試験は、トレーニングの第3週後に全てのマウスを用いて行きました。取り扱いにリンクされているフローティング動作と発声を記録しました。フローティング動作が訓練を受けたマウス（P <0.001）で有意に少なく発生しました。さらに、訓練を受けたの発声と対照群の深遠な差がありました。訓練されていない対照群（P <0.001）のマウスよりも取り扱う際に訓練を受けたマウスは、有意に少ないsqueaked。マン - ホイットニーU検定を行いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスあたりキュッキュの図12.有病率。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスのコホートは、クリッカートレーニングプロトコル以下の訓練を受けました。雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスの訓練を受けていないが、優しく扱わコホートを対照群として役立ちました。モリス水迷路試験は、トレーニングの第3週後に全てのマウスを用いて行きました。マウスの取り扱いに連結された発声を記録しました。訓練を受けていないマウスは、より頻繁に訓練を受けたマウスよりも有意にsqueaked。訓練を受けていないマウスは発声1.167±0.7倍と訓練を受けていないマウス4.071±0.83倍を示しました。ウェルチの補正で対応のないt検定を行いました。データの結果は、平均±SEMとして表した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <キープtogether.withinページ= "1">：FO Pクラス= "jove_content"
13.さらに、アプリケーションの図。マウスを別のケージから橋を渡るために、ターゲットスティックを次のされています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
雌雄各12匹のBALB / cの近交系マウスのコホートとのクリッカートレーニングプロトコルの効果的な実施が複雑であることが判明しました。これまでの研究では、いくつかの種でクリッカートレーニングの有効性を確認している、と我々はマウスにこれを拡張しました。マウスは実験動物の中で最も低い開発哺乳動物であるように、その能力は、しばしば過小評価されています。したがって、データの最も驚くべき態様は、トレーニングの成功は、ほぼすべてのマウスを用いて達成することができることです。
このプロトコル内の1つの重要なステップが表示された行動と強化の間の接続を確立するために非常に重要である第二の補強、のタイミングです。マウスは非常に撹拌されるように、周りに疾走している間、正確な性能をマークするためにわずかに困難です。多くの経験のトレーナーは、高速トレーニングの成功を達成することができるされています。私たちも、経験のない列車で、マウスは非常に迅速に学んだことを観察しましたERS。少しでもミスがクリッカートレーニングプロトコルの過程で補償することができました。エラーの一般的な原因は、間違った行動やクリックした後、食物報酬の関心の欠如を強化含まれています。
制御不能な要因は、各マウスの個々の文字です。この研究は、同じ条件下で、近交系マウスを用いて行っ生まれ育ったが、それらは異なるさまざまなキャラクターを開発しています。以前の研究と私たち自身の経験的データのため、我々は、これがさまざまな味、食欲の異なる表現と異なる探査挙動29、30が含まれていることを知っています。最初の重要なステップは、適切な食品の報酬を見つけることでした。マウスは、ナッツ、糖液、マーマレード、チョコレートの異なる種類の異なる種類を提供されました。本研究では、マウスの場合は、ホワイトチョコレートは、最も適切な報酬であることが判明しました。このプロトコルの成功は相互に依存します訓練中のマウスのEST。何か他のものは、より多くの関心を喚起した場合、トレーニングはその限界に達しました。トレーニングセッションを満たすためにケージに加え、より多くの機器は、より少ないマウスが訓練に参加しました。周囲にあるすべての注目度抜群のアイテムの除去は、（穴掘りからマウスを防ぐためにケージに寝具材料の少量でもを残して、例えば ）が不可欠です。時にはマウスは、数分のための新しい環境にhabituating後の訓練にもっと関心を得ることができます。
円満9、10、11処理したときジェントル取扱プロトコルは、すでにマウスの幸福を利益のために決定されています。本研究の結果は近い人間と動物の関係が治療にマウス寛容に寄与することを示しています。操作の下では、訓練された動物は、より少ない不安関連行動（ 私を表示しました.E。、排尿、排便、および発声）31。モリス水迷路試験では、訓練を受けていないが、優しく扱わマウスが浮遊挙動の有意に高い有病率を表明しました。訓練を受けたマウスは、このうつ病関連行動32の少ない表示しました。陽性の結果が増大による訓練を受けたマウスではよくあることにあったと主張することができました。
この研究の限界は、近交系マウスの唯一の株が研究されたということです。マウスの異なる系統間の高い動作の違い、追加の近交系、ならびに近交系株に、29を調査する必要があります。さらなる研究では、マウスのような全体の行動バッテリー、生理学的データ（ 例えば、コルチコステロンレベル）などの福祉、または脳の発達に関する訓練の影響に関する補足情報は、収集する必要があります。
クリッカートレーニングのさらなる用途は、私を支援することができnは動物施設における保健衛生状況の改善。クリッカートレーニングプロトコルを適用することにより、我々は、ターゲットスティックに従うことを、別の（ 図13）に1ケージから橋を渡るために、マウスを教えることに成功しました。この技術が完成されている場合は、手動ケージ変更が不要となります。また、マウスはおそらく自主的に測定機器（ 例えば、スケールまたは行動の領域）上に歩くように訓練することができました。動物との直接接触は、もはや必要ではないので、これは、anthropozoonotic疾病伝播に対する信頼性の高い保護を提供することができます。
それは彼らのメンタルヘルス33に寄与するように正の強化トレーニングは非常に、キャプティブ動物のために推奨されます。マウスは幸福の高レベルが発生した場合、彼らはいくつかの個別に異なる対処戦略を表示します。前作に示すようにクリッカートレーニングは、したがって、の3Rへの注目すべき貢献をすることヴァリアーの減少マウスの性は統計的要件27を満たすために必要な動物の数の減少にリードを表現型。本研究では、マウスでのクリッカートレーニングは強く異なる種34と以前の研究で観察されたヒト-マウスの相互作用と一致した結果の減少恐怖と相関することを実証しました。それは、認知濃縮考えられるようにクリッカートレーニングは、さらに可能性を秘めています。それは保管とマウスの生物医学研究を洗練として実験動物施設における正の強化トレーニングの幅広い実装では、3Rの原則に貴重な貢献をすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lid for open housing | Tecniplast | GM500LID117 | |
| SealSAfe Plus top for open housing | Tecniplast | GM500400SU | |
| Type II long, filter top cages | Tecniplast | GM500PFSPC | |
| Aspen bedding material | Lab & Vet Service GmbH | H0234-300 | Environmental enrichment |
| Red polycarbonate Mouse House | Tecniplast | ACRE011 | Environmental enrichment |
| Tissue papers | Tork, SCA Hygiene Products GmbH | 290179 | Environmental enrichment |
| Food - ssniff M-H Extrudat | ssniff | V1126-000 | ad libitum |
| Target Stick with Clicker | Trixie | 2282 | |
| PVC Tube (Tunnels) | Thyssen Krupp | RTPVCU04003005 | |
| White Chocolate/ white chocolate cream | Company doesn't matter, preferable organic quality | ||
| Forceps | FineScienceTools | e.g. 11150-10 | Or any other tool to fixate chocolate |
| Prism Version 6.0 for Windows | GraphPad Software |
References
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