Summary
这里，我们提出了快速肌纤维的分析，其允许改进的染色质量，并且由此自动获取和使用免费的软件ImageJ的纤维群体中量化的协议。
Abstract
肌纤维群体的定量提供了更深入的了解疾病，创伤和对骨骼肌的组合物的各种其它影响的效果。各种费时的方法，传统上被用于研究纤维群体中的很多研究领域。然而，最近开发了一种基于肌球蛋白重链蛋白表达免疫组织化学方法提供了一种快速的替代在一个单一的段，以确定多种纤维类型。这里，我们提出了改进的染色品质快速，可靠和可重现的协议，允许自动采集整个横截面和纤维群体与ImageJ的自动定量。为了这个目的，嵌入式骨骼肌被切割成横截面，使用肌球蛋白重链的抗体与次级荧光抗体和DAPI对细胞核染色染色。整个横截面，然后使用滑动扫描器以获得高分辨率的复合自动扫描整个标本的照片。纤维群体分析随后以定量使用ImageJ的自动化宏慢，中间和快纤维。我们以前曾表明，该方法能够可靠地识别纤维群体的程度的±4％。此外，这种方法降低了用户间的变异性和时间每分析显著使用开源平台ImageJ的。
Introduction
骨骼肌组合物发生期间生理过程，如老化1，2，3的运动，4，5，6，7，或病理生理过程，例如疾病8，9，10或11的创伤深刻的变化。因此，对这些过程的结构效应研究浓缩几个字段了解的功能变化。之一的确定肌肉功能的关键方面是肌纤维的组合物。肌纤维表达不同的肌球蛋白重链（MHC）蛋白，并由此分为低，中，或快纤维7，12，13 >，14，15，16，17。生理学上，肌肉具有不同的肌肉纤维的组合物取决于其在体内的功能。使用肌纤维打字，纤维群可以被量化，以确定适配到生理或病理生理过程7,17。在历史上，已经应用了许多耗时的方法肌纤维类型之间进行区分。为了这个目的，肌纤维或者通过在不同pH水平或肌肉酶活性肌球蛋白ATP的反应性的分类。由于不同的纤维品质不能在单个部分进行评估，要求多个横截面，以确定所有肌纤维和允许手动量化14，16，17，= “外部参照”> 18，19，20，21，22。与此相反，最近的出版物中使用免疫组织化学（IHC）抗肌球蛋白重链蛋白在单个截面迅速染色多种纤维类型。基于此过程的优点，现在被认为是在肌纤维群体分析19，23，24中的黄金标准。利用改进的IHC染色方案，我们最近能够证明全自动采集整个肌肉横截面和随后的自动肌纤维定量使用开源平台的ImageJ是可行的。比手动量化，我们的程序提供在时间（手动的约10％分析）每个载玻片需要而被准确一个显著减少到±4％25
这种方法的总体目标是使用开放源码平台来描述一种快速，可靠，方便用户独立于整个大鼠肌肉引导到自动肌纤维定量。此外，我们描述了将允许其用于其他标本，如小鼠或人的肌肉潜在的修改。
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Protocol
包括动物个体所有程序均符合实验动物管理的原则进行所建议的FELASA 26。由维也纳医科大学与奥地利财政部研究和科学机构审查委员会之前的研究获得批准（BMWF：德国联邦附耳Wissenschaft与研究部，参考号码：BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3B / 2014）。
1.肌肉收获
注：在之前发表的孟等人。 27，请中详细介绍肌肉标本的正确冻结。
- 获得整个肌肉或足够的组织动物安乐死后，立即获取整个横截面。
- 从麻醉或安乐死的大鼠删除整个肌肉。删除所有的结缔组织，并与周围的镊子和剪刀的肌腱。为一个nesthesia或安乐死，遵循FELASA 28的国际准则。
- 使用校准的精度称重秤肌肉。这种快人一步使肌肉样品之间的比较分析，尤其是介入手术之后。
- 放肌肉到容器中，完全用OCT化合物填充，根据肌肉的尺寸具有大约1mm的安全余量各方（ 例如 ，由铝箔制成）。
- 冻结它在大约2分钟使用液氮预冷却的异戊烷。异戊烷必须开始在容器的底部，显示白色晶体。
注意：此步骤是用于保存肌肉的正确的体系结构至关重要，从而允许正确的染色和纤维分析27。 - 商店样品保守OCT为在-80℃下至少24个小时。样品可以，但是，储存在-80℃数月甚至数年，如果CORRE ctly冷却。
- 切从肌肉的中部10μm的横截面在使用低温切片机-20℃。如果在10微米的切割是不可行的，增加的2微米的步骤厚度最多为20μm。足够尖锐切割刀片是用于此步骤是必不可少的。
- 通过近似的幻灯片的横截面施加部分，以粘合剂的幻灯片。横截面会自动粘到胶粘剂幻灯片。染色前一夜保存在-20°C的幻灯片。
2.染色
注：可大量对肌球蛋白重链蛋白的抗体;然而，高质量的抗体可用于自动采集和分析至关重要。对于稀释和参照抗体， 见表1。 对于电子表格文件来计算正确的稀释和看需要解决量的数目，见source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental文件1。
- 解冻并空气干燥该冷冻的肌肉切片用于染色过程前10分钟。
- 洗涤用磷酸盐缓冲盐水（PBS）+ 0.05％的Triton X 10分钟，然后5分钟小心滑动。海卫已经显示出显著提高染色质量。有关进一步的细节讨论。
- 让切片风干2分钟，使用疏水性笔（以最小化抗体的所需量），并允许额外的干燥15分钟概述在每个载玻片上单独的横截面。
- 用PBS +阻止所有幻灯片0.05％的Triton X含有10％山羊血清在室温下1个小时（PBST）。
- 所有稀释的初级抗体（ 表1）在PBS + 0.05％的Triton X含（PBST）10％山羊血清的鸡尾酒。应用前充分混合。曲拉通X是整个横截面的相等染色必不可少的。计算大约30微升每截面初级抗体混合物。
- 对于步骤2.7-2.13确保光线足够的保护。暗淡的房间的灯和覆盖染色托盘提供足够的保护。此外，用流体填充染色托盘底部染色期间提供潮湿的环境和防止干燥。
- 在室温下在潮湿染色托盘申请初级抗体（ 表1）的鸡尾酒到载玻片1个小时。
- 用PBS + 0.05％的Triton X洗涤载玻片10分钟，然后用新的PBST 5分钟。
- 稀释的二抗在PBS + 0.05％的Triton X（PBST）+ 10％山羊血清的鸡尾酒。计算每截面初级抗体混合物的30μL。
- 应用二次抗体混合物于载玻片1个小时。
- 用PBS洗涤载玻片+ 0.05％的Triton X（PBST）中10分钟，并用另外5分钟新PBST。
- 施加DAPI核染色试剂盒（优选读取使用的解决方案）FOR 15 min或根据制造商的说明书进行染色细胞核。
- 洗涤简要用PBS + 0.05滑动％的Triton X（PBST）中1分钟。随后，让幻灯片风干简单。
- 应用荧光封固剂和盖玻片。储存于4℃下避光和24-48小时内最佳地执行成像。
3.显微镜
- 载片成幻灯片扫描仪。最多12个滑动取决于滑动扫描器是可行的。
- 启动一个新项目。预览设置DAPI通道和2.5X透镜。对于详细的分析使用DAPI，GFP，FITC和Cy5通道和20X物镜。自动对焦是整个在DAPI通道项目的收购。
- 使用每个通道下面的颜色：蓝DAPI，FITC：绿，德克萨斯红：红，cy5：黄色。
- 创建使用DAPI通道每张幻灯片的预览。为了这个目的，适用于第一个标本手动对焦，并用它在整个预览分析获得每标本的预览图像。
- 概述每个横截面应包括用于详细获取过程。不要画轮廓接近试样边缘，以保证所关注的整个区域的标题。
- 设置曝光时间为每个通道。在大多数情况下，不同的信道的曝光参数是用于所有的横截面是相同的。
- 运行自动图像采集。检查正确的收购为视图的第一个字段，以防止不正确采集的自动化过程的早期阶段。
- 如果需要的话，使用桌面镜像软件建立远程控制。这允许图像采集过程的远程监视通过经由任何网络或因特网连接的载玻片扫描仪的计算机屏幕镜像到另一台计算机。虽然，不能修改对物理设置进行关于使用幻灯片，图像采集软件的虚拟环境允许监控图像的正确对焦或曝光时间。此外，估计何时能完成，可以定期检查。
- 图像采集完成后，通过如果纤维结构，单独的纤维和各种纤维类型是可区分的手动控制控制所有图像的正确自动对焦。
- 重新获得正确聚焦图像领域的观点或感兴趣点面结合单一领域。对于单一领域再次取得，标志着整个项目区或图像，并用手动对焦重新获得的区域。在大多数情况下，在不同的聚焦水平的附加图像细节导致不正确聚焦的图像
- 对于应包括在最终的分析每个横截面，分别导出每个信道（不含DAPI）作为JPEG文件。命名并根据命名德州红，FITC和Cy5文件夹中的暴露渠道文件进行排序。
4.自动纤维分析
帐篷“>注意：宏可以从以下网页获得：https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- 预览每个图像使用分析前的常规图像编辑软件，并检查其染色纤维和背景之间足够的对比度。如果需要，调整对比度和亮度，以增加的差异，使用亮度和对比度调整命令。
- 打开ImageJ的或斐济。使用命令打开宏“ - 宏 - 插件编辑。”这显示了宏的源代码，并允许的参数快速适应。如果必要的话，对于在宏的源代码中的每个信道改变文件夹的目录。
注：对于肌纤维的分析值是基于对大鼠二头肌和蚓状肌，其它种类或肌肉可能需要不同的值。 - 使用“运行”命令来启动宏。该文件夹的所有图像现在被装载到宏观，并在连续的顺序进行量化。结果是笑WN在一个新窗口。此步骤可能需要从几秒到几个小时，取决于被分析的数据量。
- 导出结果窗口的电子表格文件。识别值正计数的Cy5（慢），FITC（中间）和德克萨斯红（快速）纤维和总结为总纤维数。
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Representative Results
整个大鼠肌肉的横切片进行免疫组织化学使用来识别MHC I，IIA和IIB的肌肉纤维迅速染色。使用荧光显微镜载玻片扫描仪，整个横切片然后自动获得用于自动肌纤维分析用ImageJ的。该过程的概念是基于对于肌肉纤维的定量提供一种简单的，可靠的和时间有效的工作流程。
该过程的工作流程（ 图1）与肌肉样品的正确的去除和冷冻开始，如在以前的教程由Meng 等人先前所描述的。 27。这是足够的染色质量至关重要。在接下来的步骤中，将肌肉样品切成并染色使用的初级抗体抗肌球蛋白重链的蛋白质类I，IIA和IIB和适当的次级荧光抗体。为了获得最佳的ST癌宁质量，制造商推荐的浓度为第二抗体加倍和Triton X用于抗体鸡尾酒提供甚至染色质量。肌纤维的免疫荧光染色快轻微交叉反应，并且可以在约5小时，在我们的设置最多26张幻灯片的批次来完成。所得的图像表现出阳性纤维和周围组织和不同的纤维类型之间的强的区别（ 图2）之间的高对比度。接着，使用滑动扫描器，它允许整个肌肉的横截面的自动扫描进行图像采集。在这里，多达12个载玻片自动扫描，例如，过夜。由此，在高细节的分辨率，它允许单个纤维形态（ 图2）的检查所创建的横截面的概览图像。
在最后的步骤，从个人通道of各自横截面被导出用于使用专门设计的宏ImageJ的肌纤维群体的定量。自动分析需要约5-10分钟为3,000-6,000纤维间含有大鼠二头肌的横截面，而手动分析时间大约60分钟25。自动分析，对计算的工作站和文件大小的功率强烈依赖。如前所示，宏能够检测与比手动分析（ 图3）的±4％的准确度相对于肌纤维群体。总绝对计数是更高比手动分析，但是，相对于计数保持一个±4％的范围内类似的，如先前所示。
图1：肌纤维定量协议的工作流程。首先，肌肉样品从所获得的动物和冷冻正确（见朱庇特的视频孟等人。27）。然后切肌肉的横截面，并进行免疫染色。获得使用用于整个详细的横截面图像的幻灯片扫描器染色的横截面的图像。运行的ImageJ定量宏肌纤维种群分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：大鼠二头肌截面。脏污大鼠二头肌横截面的概述：横截面示出了在中红，绿和快速MHC IIB纤维黄色，中间MHC IIA纤维缓慢MHC I纤维。 请点击此处查看大VERSI在这个数字的。
图3：肌纤维分析在图2中分析肌肉MHC I的，MHC IIA和IIB MHC纤维大鼠断面结果 。 上图：通过手动或自动计数肌纤维的绝对计数。中间：手动量化后的肌肉纤维群体的相对部分。底部：后绝对量化肌肉纤维群体的相对部分。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1：MHC纤维的免疫组织化学染色。初级和次级抗体，包括用于在S稀释的描述泰宁程序。 （从Bergmeister 等改性。25）
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Discussion
在这里，我们展示了一个广泛接受的方法来研究，并自动以时间有效的方式通过免疫组化定量鼠的横截面的肌纤维群。的再现性，我们提出通过步骤描述和在本研究中未描述的其它物种的应用的潜在修改的详细步骤。此外，我们还讨论了程序的优势，前提条件最佳的功能和它的局限性。
目前，许多的染色方法存在以识别肌纤维群体，并已用于肌肉纤维17的手动或半自动定量描述了许多方法。然而，没有协议存在，结合两者和描述的标准化方法，以可靠地染色肌纤维群体和自动获取和量化肌肉纤维，使用免费提供的分析软件。基于以前的出版物“> 24，图 29，我们优化现有肌球蛋白重链免疫组织化学染色程序在鼠肌截面纤维群体的自动分析，由此，我们最近发现，相比于手动分析整个横截面的自动分析是可行的，可靠的，并更时间有效的27，另外，该方法是用户无关从而减少人为误差并且从而提供客观的比较，例如不同的处理组之间。
全协议基于用于自动量化过程中提供整个横截面的详细和高品质的图像。 ImageJ的作为开源软件提供了许多功能强大且简单的命令，其配置在宏允许肌纤维鉴定。然而，内或横截面需要之间质量差异被最小化，以实现可靠的结果。我们已识别D中是实现所要求的质量所必需的一些关键步骤。这包括使用最佳初级抗体。同样地，使用提供不同的荧光信号适当的二级抗体是必不可少的，并且我们一倍浓度的改进的信号质量。此外，我们观察到一个更高，更均匀染色质量的抗体混合物使用的Triton X的。重要的是，这是不是与使用吐温，而不是观察。与次优染色质量的图像进行手动调节为更好的对比度，使图像自动采集。在收购过程最重要的是自动对焦系统的正常功能。为了这个目的，我们使用了DAPI试剂盒染色卫星细胞，这对于自动聚焦系统提供了可靠的标志物细胞的细胞核。
对于ImageJ的量化过程中，最佳值是通过比较手动到自动的结果和连续的细-TU确定参数25的宁：阈值和分析颗粒。将所得的值分别为足以二头肌和蚓状肌和因此潜在的其他大鼠的肌肉。此外，Bloemberg 等。 24表明，染色是适用于其它物种，例如人类或小鼠。因此，整个协议理论上可以适用于其它物种中使用，但将，但是，需要识别必要的参数。相关的命令被突出显示在源代码中。
该过程的其它可能的修饰包括滑动扫描器的设置。在我们的设置中，我们使用了幻灯片扫描系统，具有2.5倍镜头预览和20X镜头，实际收购。而改变透镜的预览过程将在质量或速度方面提供无显著益处，获取也可以使用10X透镜以增大速度（和CON进行sequently降低分辨率），或代替40X透镜为增加分辨率，并因此获取时间。 如图2所示，增加分辨率是最有可能不需要老鼠肌肉，但可考虑其它物种。适于在此设置其它修饰染色MHC-IIX纤维或层粘连蛋白以可视化的肌肉的细胞外基质。这些修改，但是，需要改变用于两个附加反射器获取的设置（例如Cy7的）和修改的ImageJ宏以包括附加用正确的参数的脚本代码的分析。
该技术的一个限制是绝对纤维计数显显著较高相比，在以前的分析手册计数，虽然相对计数保持类似25。这很可能是不充分的分离和纤维的如此重复定量的结果。这种效应是在没有得到充分的染色或显示其他类型的工件的纤维多存在。不过，相对于光纤数，因此纤维群体的数量保持高度精确。相比于量化的横截面的一个定义的子部分的常见的做法， 例如 ，40％，我们认为通过使用ImageJ的整个横截面的，其分析是作为异种肌纤维的结构的结果更准确的（ 图2） 。该过程的一个潜在的局限性是要用于自动获取整个横截面的昂贵滑动扫描器，这是不一般可用的要求。另一种方法是获得的观点单场和由宏单独量化每个。
总之，我们认为这个协议是广泛接受，并允许使用全肌肉横截面的快速和可靠的量化免费提供的分析软件。因此，所引入的过程提供了肌纤维形态的分析作出有益的贡献。
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Acknowledgments
这项研究是由基督教多普勒研究基金会的支持。我们愿在奥地利维也纳医科大学从核心设施成像感谢萨宾·劳施在整个项目的支持。初级抗体通过菲诺，S.发展，从发展研究杂交瘤细胞银行获得，由美国国立卫生研究院的NICHD创建和维护在爱荷华，生物系，爱荷华市，IA大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
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