Summary
Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.
Abstract
A quantificação de populações de fibra muscular proporciona um conhecimento mais profundo dos efeitos da doença, trauma, e várias outras influências sobre a composição do músculo esquelético. Vários métodos demorados têm sido tradicionalmente usados para estudar as populações de fibra, em muitos campos da investigação. No entanto, recentemente desenvolvido métodos imuno-histoquímicos com base na expressão da proteína de cadeia pesada de miosina fornecer uma alternativa rápida para identificar vários tipos de fibra em uma única secção. Aqui, nós apresentamos um protocolo rápido, fiável e reprodutível para a melhoria da qualidade de coloração, permitindo a aquisição automática de secções transversais integrais e quantificação automática de populações de fibras com ImageJ. Para esta finalidade, os músculos esqueléticos incorporadas são cortados em secções transversais, coradas utilizando anticorpos da cadeia pesada de miosina com anticorpos fluorescentes secundárias e DAPI para coloração de núcleos de células. secções transversais inteiras são depois digitalizados automaticamente utilizando um scanner de slides para obter compósitos de alta resoluçãoimagens de todo o espécime. análises de população fibra são subsequentemente realizada para quantificar fibras lentas, intermediários e rápido usando um macro automatizado para ImageJ. Foi anteriormente demonstrado que este método pode identificar populações de fibras de forma fiável a um grau de ± 4%. Além disso, este método reduz a variabilidade inter-utilizador e tempo por análises usando significativamente o ImageJ plataforma aberta fonte.
Introduction
Composição músculo esquelético sofre alterações profundas durante processos fisiológicos tais como o envelhecimento de 1, 2, exercício 3, 4, 5, 6, 7, ou processos patofisiológicos, tais como a doença de 8, 9, 10 ou 11 trauma. Assim, vários campos de concentrado de pesquisa sobre os efeitos estruturais destes processos para compreender as mudanças funcionais. Um dos aspectos fundamentais que determinam a função do músculo, é a composição de fibras musculares. As fibras musculares expressar diferentes proteínas de cadeia pesada de miosina (MHC) e são assim classificados em fibras lentas, intermediários, ou rápidos 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, os músculos têm composições de fibras musculares diferentes, dependendo da sua função no corpo. Utilizando fibra muscular digitação, populações de fibras pode ser quantificado para identificar adaptação aos processos fisiológicos ou fisiopatológicos 7, 17. Historicamente, um número de métodos demorados foram aplicadas para diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para esta finalidade, as fibras musculares foram classificadas tanto por reactividade de ATPase miosina, a vários níveis de pH ou a actividade da enzima muscular. Como diferentes qualidades de fibras não podia ser avaliada num único ponto, múltiplas secções transversais foram necessários para identificar todas as fibras musculares e permitir manual de quantificação 14, 16, 17,= "refex"> 18, 19, 20, 21, 22. Em contraste, publicações recentes utilizados imuno-histoquímica (IHQ) contra a proteína de cadeia pesada de miosina para corar rapidamente vários tipos de fibra em um único secções transversais. Com base nas vantagens do presente processo, considera-se agora o padrão de ouro na análise da população das fibras musculares 19, 23, 24. Usando melhoradas protocolos de coloração IHC, que foram recentemente capaz de mostrar que a aquisição automática de secções transversais músculo integrais e subsequente quantificação da fibra muscular automática é possível utilizar o ImageJ plataforma aberta fonte. Em comparação com o manual de quantificação, o nosso processo proporciona-se um decréscimo significativo no tempo (cerca de 10% de Manual analisa) necessária por lina ao mesmo tempo que uma precisão de ± 4% 25
O objectivo global do presente método é o de descrever uma guia rápida, de confiança, independente pelo utilizador para quantificação automática da fibra muscular no músculo de rato inteiro utilizando uma plataforma de fonte aberta. Além disso, descreve-se potenciais modificações que permitem a sua utilização para outros espécimes tais como ratinhos ou músculos humanos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos, incluindo indivíduos animais foram realizadas em conformidade com os princípios de cuidados com animais de laboratório, como recomendado pelo FELASA 26. A aprovação foi obtida antes do estudo pelo conselho de revisão institucional da Universidade Médica de Viena eo Ministério austríaco de Investigação e Ciência (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, número de referência: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3-B / 2014).
1. Muscle Colheita
NOTA: A publicação anterior por Meng et al. 27 está disponível descrevendo o congelamento correcta de amostras de músculo em grande detalhe.
- Obter músculos inteiros ou tecido suficiente para adquirir secções inteiras imediatamente após a eutanásia dos animais.
- Retire o músculo inteiro de um rato anestesiado ou sacrificados. Remover todo o tecido conjuntivo e tendões que cercam o músculo com uma pinça e tesouras. Para umnesthesia ou a eutanásia, siga as diretrizes internacionais de FELASA 28.
- Pesar muscular usando uma balança de precisão calibrado. Este passo rápido permite análises comparativos entre amostras musculares, especialmente depois de procedimentos de intervenção.
- Coloque muscular dentro de um vaso, completamente preenchido com o composto OCT, de acordo com o tamanho do músculo com uma margem de segurança de cerca de 1 mm a todos os lados (por exemplo, feito de folha de alumínio).
- Congelá-lo em cerca de 2 minutos pré-arrefecido isopentano usando azoto líquido. O isopentano deve começar a mostrar cristais brancos na parte inferior do recipiente.
NOTA: Este passo é essencial para preservar a arquitectura correcta do músculo e, assim, permite que a coloração correcta e analisa fibra 27. - Armazenar as amostras conservadas em OCT durante pelo menos 24 h a -80 ° C. As amostras podem, no entanto, ser armazenadas a -80 ° C durante vários meses ou mesmo anos, se corre ctly arrefecida.
- Cortar 10 seces transversais da porção média do músculo a -20 ° C utilizando um Criótomo. Se o corte a 10? M não é viável, aumentar a espessura em intervalos de 2 um até um máximo de 20 um. Suficientemente lâminas de corte afiadas são essenciais para esta etapa.
- Aplicar as seções para lâminas adesivas, aproximando os slides para as seções transversais. As secções transversais vão ficar automaticamente para os slides adesivas. Armazenar as lâminas a -20 ° C durante a noite antes da coloração.
2. coloração
NOTA: Um grande número de anticorpos contra proteínas de cadeia pesada de miosina estão disponíveis; No entanto, os anticorpos de alta qualidade são essenciais para aquisição e análise automatizada. Para diluições e de referência a anticorpos, ver Tabela 1. Para um arquivo de planilha para calcular as diluições corretas e ver o número de quantidades de solução necessários, consultesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental arquivo 1.
- Descongelar e ar-secar as secções musculares congeladas durante 10 min antes do processo de coloração.
- Lave as lâminas cuidadosamente com solução salina tamponada de fosfato (PBS) + 0,05% de Triton X durante 10 min e, em seguida, durante 5 min. Triton foi mostrado para melhorar a qualidade de coloração de forma significativa. Veja a discussão para mais detalhes.
- Deixe secções de ar seco, durante 2 min e delinear secções transversais individuais em cada lâmina utilizando uma caneta hidrófobo (para minimizar a quantidade necessária de anticorpo) e permitir a secagem adicional durante 15 min.
- Bloquear todas as lâminas com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contendo soro de cabra a 10% durante 1 h à temperatura ambiente.
- Dilui-se todos os anticorpos primários (Tabela 1) num cocktail de PBS + Triton X (PBST) contendo soro de cabra a 0,05% a 10%. Misturar suficientemente antes da aplicação. Triton X é essencial para igual coloração da totalidade das secções transversais. Calcularcerca de 30 mL de cocktail de anticorpo primário por secção transversal.
- Para obter etapas 2.7-2.13 garantir uma protecção suficiente da luz. luzes da sala se apagaram e bandejas para corar cobertos fornecer proteção adequada. Além disso, encher o tabuleiro de coloração com o fluido na parte inferior para fornecer um ambiente húmido durante a coloração e evitar a secagem.
- Aplicar o anticorpo primário (Tabela 1) cocktails para as lâminas durante 1 h num tabuleiro de coloração húmido em temperatura ambiente.
- Lavagem das lâminas com PBS + 0,05% de Triton X durante 10 min e, em seguida, com novo PBST, durante 5 min.
- Diluir anticorpos secundários num cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + soro de cabra a 10%. Calcular 30 pL de cocktail de anticorpo primário por secção transversal.
- Aplicar cocktail anticorpo secundário para as lâminas por 1 h.
- Lavagem das lâminas com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 10 min e com novo PBST durante mais 5 min.
- Aplicar um kit de coloração nuclear DAPI (de preferência soluções lidos de usar) for 15 min ou de acordo com as instruções do fabricante para corar os núcleos das células.
- Lavagem das lâminas brevemente com PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 1 min. Depois disso, vamos lâminas brevemente ar seco.
- Aplique meio de montagem fluorescente e lamelas. Armazenar a 4 ° C protegida da luz e realizar imagem optimamente dentro de 24-48 h.
3. Microscopia
- Carga desliza para dentro do scanner de slides. Um máximo de 12 slides é viável dependendo do scanner de slides.
- Inicie um novo projeto. Para visualização definir o canal DAPI ea lente 2,5X. Para a análise detalhada utilizar canais DAPI, GFP, FITC e Cy5 e o objetivo 20X. Autofocus é adquirido ao longo do projeto no canal DAPI.
- Use as seguintes cores para cada canal: -blue DAPI, FITC: verde, vermelho Texas: vermelho, Cy5: amarelo.
- Criar visualizações de cada lâmina utilizando o canal DAPI. Para este fim, aplique foco manual na primeira amostra e usá-lo durante toda a pré-visualizaçãoanálise para adquirir imagens de visualização de cada espécime.
- Delinear cada seção transversal que deve ser incluído para o processo de aquisição detalhado. Não desenhar esboços perto das bordas do espécime, para garantir a legenda de toda a área de interesse.
- Definir os tempos de exposição para cada canal. Na maioria dos casos, os parâmetros de exposição dos diferentes canais são idênticos para todas as seções transversais.
- Executar aquisição de imagem automática. Verifique aquisição correta para o primeiro campo de pontos de vista, para impedir a aquisição incorretos no início do processo automatizado.
- Se necessário, estabelecer um controle remoto com um programa de espelhamento desktop. Isso permite que o monitoramento remoto do processo de aquisição de imagem por espelhar a tela do computador do scanner de slides para um computador diferente através de qualquer rede ou ligação à Internet. Embora, nenhuma mudança pode ser feita para a configuração física sobre os slides usados, o ambiente virtual do software de aquisição de imagem permite monitorar a foco ou a exposição horários corretos das imagens. Além disso, o tempo estimado para a conclusão pode ser verificada regularmente.
- Depois de se completar a aquisição da imagem, controlar a focagem automática correcta de todas as imagens por meio do controle manualmente se a arquitectura da fibra, as fibras individuais e os vários tipos de fibra são distinguíveis.
- Readquirir incorretamente focada áreas de imagem para os campos de vista único ou áreas inteiras de interesse. Para reaquisição de áreas individuais, marcar áreas ou imagens ao longo de todo o projeto e readquirir áreas com foco manual. Na maioria dos casos, um detalhe de imagem adicional em um nível de foco diferente leva às imagens focadas incorretamente
- Para cada seção transversal que deve ser incluído nas análises finais, exportar cada canal (excluindo DAPI) separadamente como arquivos JPEG. Nome e classificar arquivos de acordo com os canais expostos em pastas nomeadas Texas Red, FITC e Cy5.
4. Análise Automated Fiber
tenda "> NOTA: A macro pode ser obtido na página web seguinte: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- Prévia cada imagem utilizando um software de edição de imagem convencional antes de análises e verificar a existência de contraste suficiente entre as fibras coradas e fundo. Se necessário, ajustar o contraste e o brilho para melhorar a diferença, usando os comandos de ajustamento de brilho e contraste.
- Abrir ImageJ ou Fiji. Abra a macro usando o comando "Plugins - Macros - Editar". Isso mostra o código-fonte macros e permite a adaptação rápida dos parâmetros. Se necessário, mude o diretório pasta para cada canal no código-fonte da macro.
NOTA: Os valores para as análises de fibras musculares são baseados em bíceps rato e músculos lumbricais, outras espécies ou músculos podem requerer diferentes valores. - Use o comando "Executar" para iniciar a macro. Todas as imagens da pasta são agora carregados no macro e quantificadas por ordem consecutiva. Os resultados são shown em uma nova janela. Este passo pode levar de segundos a várias horas, dependendo da quantidade de dados a serem analisados.
- Exportar a janela de resultados como um arquivo de planilha. Identificar valores para Cy5 contadas positivamente (lenta), FITC (intermediário) e fibras de Texas Red (rápido) e resumir-se para o número total de fibras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
secções transversais de músculo de rato inteiro foram coradas rapidamente usando imuno-histoquímica para identificar MHC I, IIA e IIB fibras musculares. Utilizando um scanner de slides de microscópio fluorescente, secções transversais inteiras foram então adquirida automaticamente por fibra muscular automatizado analisa com ImageJ. O conceito do procedimento baseia-se no fornecimento de um fluxo de trabalho simples, fiável e eficiente tempo para a quantificação de fibras musculares.
O fluxo de trabalho do processo (figura 1) começa com a remoção correcta e de congelação de amostras do músculo, como descrito anteriormente em um tutorial anterior por Meng et al. 27. Isto é essencial para a qualidade coloração adequada. No passo seguinte, as amostras de músculo são cortadas e coradas com anticorpos primários contra miosina pesada classe proteínas de cadeia I, IIA e IIB e anticorpos fluorescentes secundárias adequadas. Para um óptimo raining qualidade, as concentrações recomendadas pelo fabricante para os anticorpos secundários foram duplicou e Triton X usado para as misturas de anticorpos para proporcionar ainda a qualidade da coloração. A coloração de imunofluorescência das fibras musculares é rápido com menor reactividade cruzada e pode ser realizada em cerca de 5 h para os lotes de até 26 desliza em nossa configuração. Imagens resultantes mostraram elevado contraste entre as fibras positivas e tecido circundante e um forte distinção entre diferentes tipos de fibras (Figura 2). Em seguida, a aquisição de imagens é realizada usando um scanner de slides que permite a verificação automática de secções músculo inteiro. Aqui, até 12 lâminas são digitalizados automaticamente, por exemplo, durante a noite. Por este meio, as imagens de informações gerais sobre as secções transversais são criados em detalhe elevado com uma resolução que permite a inspecção da morfologia das fibras simples (Figura 2).
Na etapa final, o canais individuaisf cada secção transversal são exportados para quantificação de populações de fibras do músculo utilizando um macro especificamente concebido para ImageJ. A análise automática demora aproximadamente 5-10 min para uma secção transversal bíceps de rato contendo entre 3,000-6,000 fibras, enquanto que as análises manuais levou aproximadamente 60 minutos 25. análises automáticas dependem fortemente poder do tamanho do arquivo e estação de trabalho de computação. Como mostrado anteriormente, a macro é capaz de detectar as populações de fibra muscular em relação com uma precisão de ± 4% em comparação com a análise manual (Figura 3). contagens absolutas globais são mais elevados em comparação com o manual análises, no entanto, as contagens relativas permaneceu semelhante dentro de um intervalo de ± 4%, como mostrado anteriormente.
Figura 1: Fluxo de trabalho da fibra muscular Quantificação protocolo. Primeiro, amostras de músculo são obtidos a partir daanimais e congelado correctamente (ver vídeo JoVE por Meng et ai. 27). Em seguida, retira secções transversais musculares e conduzir coloração imunológica. Adquirir imagens de secções transversais manchados usando um scanner de slides de imagens detalhadas secções transversais inteiras. Executar a macro para quantificação ImageJ para análises população das fibras musculares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Corte Transversal Rato músculo bíceps. Visão geral de uma secção transversal do músculo bíceps rato manchado: O corte transversal mostra fibras lentas MHC I em amarelo, intermediários fibras MHC IIA em fibras verdes e rápidas MHC IIB em vermelho. Por favor clique aqui para ver uma versi maioreson desta figura.
Figura 3: Análise das fibras musculares resulta da secção transversal do rato na Figura 2. As análises de músculo MHC I, fibras de MHC de IIA e IIB do MHC. Top: As contagens absolutas de fibras musculares por contagem manual ou automática. Meio: porções relativas de fibras musculares populações após quantificação manual. Parte inferior: porções relativas de fibras musculares após populações quantificao absoluta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: A coloração imuno-histoquímica de Fibras de MHC. Descrição de anticorpos primários e secundários, incluindo diluições utilizadas para os sprocedimento tenção. (Modificado de Bergmeister et ai. 25)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, demonstramos uma metodologia amplamente acessível para estudar e quantificar as populações de fibras de músculo de rato de secções transversais através de imuno-histoquímica de uma maneira eficiente o tempo automaticamente. Para a reprodutibilidade, apresentamos um detalhado passo descrição passo e modificações potenciais para aplicações em outras espécies não descritas neste estudo. Além disso, são discutidas as vantagens do procedimento, pré-requisitos para a função óptima e suas limitações.
Actualmente, um número de métodos de coloração existem para identificar populações de fibras musculares e um número de métodos têm sido descritos para a quantificação manual ou semi-automática de fibras musculares 17. No entanto, não existem protocolos que combinam ambas, e descrevem uma abordagem normalizada a manchar de forma fiável populações de fibra muscular e automaticamente adquirir e quantificar fibras musculares, utilizando livremente disponível software analisa. Com base em publicações anteriores"> 24, 29, que otimizada procedimentos de coloração imuno-histoquímica de cadeia pesada de miosina existente para análises automáticas de populações de fibras em secções transversais de músculo de murino. Deste modo, nós recentemente demonstraram que a análise automatizada de seces transversais inteiras é viável e fiável em comparação com as análises manuais, e mais eficientes em termos de tempo 27. Além disso, o método é, assim, reduzindo o erro humano e proporcionando assim uma comparação objectiva como por exemplo entre os diferentes grupos de tratamento independente do utilizador.
O protocolo inteiro é baseado no fornecimento de imagens detalhadas e de alta qualidade de seces transversais inteiras para o processo de quantificação automatizado. ImageJ como um software de código aberto proporciona um número de comandos poderosos mas simples, dispostos em que uma macro permitir a identificação da fibra muscular. No entanto, as diferenças de qualidade dentro ou entre necessidade secção transversal para ser minimizada para alcançar resultados fiáveis. Temos identifiéd alguns passos críticos que são essenciais para alcançar a qualidade exigida. Isto inclui o uso de anticorpos primários óptimas. Da mesma forma, a utilização de anticorpos secundários apropriados que fornecem sinais fluorescentes distintos era essencial, e que duplicou concentrações, para a melhoria da qualidade de sinal. Além disso, observou-se uma qualidade mais elevada e mais uniforme de coloração com o uso de Triton X nas misturas de anticorpos. Importante, este não foi observada com o uso de Tween em vez disso. Imagens com qualidade coloração suboptimal foram ajustadas manualmente para melhor contraste para permitir a aquisição de imagens automática. O mais importante para o processo de aquisição foi o correcto funcionamento do sistema de focagem automática. Para este fim, utilizou-se um kit de DAPI para corar os núcleos de células de células de satélite, o que proporcionou um marco de confiança para o sistema de focagem automática.
Para o processo de quantificação ImageJ, valores óptimos foram determinados pela comparação manual para resultados automatizados e consecutiva fino-TUNing dos parâmetros 25: Limiar e analisar as partículas. Os valores resultantes foram suficientes para bíceps e músculos lumbricais e, portanto, potencialmente outros músculos de rato. Além disso, Bloemberg et al. 24 mostraram que a coloração é aplicável para as outras espécies, tais como seres humanos ou ratinhos. Por conseguinte, todo o protocolo pode, teoricamente, ser adaptado para o uso em outras espécies, mas que, no entanto, requerem a identificação dos parâmetros necessários. Os comandos relevantes são destacadas no código fonte.
Outras possíveis modificações do procedimento incluem a configuração do scanner de slides. Em nossa configuração, foi utilizado um sistema de scanner de slides, com uma lente de 2.5X para a visualização e lente de 20X para a aquisição real. Considerando trocar a lente para o processo de pré-visualização irá fornecer nenhum benefício significativo em termos de qualidade ou a velocidade, a aquisição também pode ser conduzida usando uma lente de 10X para aumentar a velocidade (e consequently diminuir a resolução) ou em vez de uma lente de 40X para aumentar a resolução e, consequentemente, tempo de aquisição. Como é mostrado na Figura 2, aumentando a resolução é não ser necessário para o músculo de rato, mas pode ser considerado para a outras espécies. Outras modificações que são adequados nesta configuração são de coloração para fibras de MHC-IIX ou laminina para visualizar matriz extracelular do músculo. Essas modificações, no entanto, necessário alterar a configuração de aquisição para dois refletores adicionais (por exemplo Cy7) e modificar a macro ImageJ para incluir análises adicionais com os parâmetros corretos para o código de script.
Uma limitação desta técnica é que as contagens absolutas de fibra foi significativamente mais elevada em comparação com a contagem manual numa análise anterior, embora as contagens relativas permaneceu semelhante 25. Este é provavelmente o resultado de separação inadequada e quantificação assim repetida de fibras. este efeitoestá mais presente nas fibras que estão inadequadamente manchado ou mostram outros tipos de artefactos. No entanto, o número de contagens de fibras relativos e assim as populações de fibra permaneceram altamente preciso. Em comparação com a prática comum de quantificação de uma sub-porção definida de uma secção transversal, por exemplo 40%, acreditamos que as análises de toda a secção transversal pelo ImageJ são mais precisos como resultado da arquitectura de fibra muscular heterogénea (Figura 2) . Uma potencial limitação do procedimento é a exigência de utilização de scanners de slides caros para aquisição automatizada de seção transversal inteira, que não são geralmente disponíveis. Uma abordagem alternativa é adquirir único campo de pontos de vista e quantificar cada um individualmente pela macro.
Em conclusão, acreditamos que este protocolo é amplamente acessível e permite a quantificação rápida e confiável de seções transversais musculares inteira usando livremente disponível analisa software. Portanto, o procedimento introduzidofornece um contributo útil para as análises de morfologia da fibra muscular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Christian Doppler Research. Nós gostaríamos de agradecer Sabine Rauscher do Mecanismo de imagem Núcleo da Universidade Médica de Viena, na Áustria para o apoio ao longo do projeto. Os anticorpos primários foram desenvolvidos por Schiaffino, S., obtido a partir do Developmental Studies Hybridoma Bank, criado pelo NICHD da NIH e mantida a The University of Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C.
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J.
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J.
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
