Summary
Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.
Abstract
Kwantificatie van spiervezel populaties verschaft meer inzicht in de gevolgen van de ziekte, trauma en verschillende andere invloeden op skeletspier samenstelling. Diverse tijdrovende methoden zijn van oudsher gebruikt om vezelpopulaties studeren op vele terreinen van het onderzoek. Echter, recent immunohistochemische methoden op basis van myosine zware keten eiwitexpressie ontwikkeld te snel alternatief voor meerdere vezeltypes is uit een enkele sectie. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare en reproduceerbare protocol voor betere kleuring kwaliteit, waardoor automatisch ophalen van hele dwarsdoorsneden en automatische kwantificatie van vezelpopulaties met ImageJ. Hiertoe zijn ingebed skeletspieren gesneden dwarsdoorsneden, gekleurd met myosine zware ketens kunnen antilichamen met fluorescente secundaire antilichamen en DAPI kleuring van celkernen. Hele dwarsdoorsneden automatisch gescand met diascanner hoge resolutie composiet te verkrijgenfoto's van het gehele monster. Vezels populatie analyses worden vervolgens uitgevoerd om langzame, intermediaire en snelle vezels behulp van een geautomatiseerde macro voor ImageJ kwantificeren. We hebben eerder aangetoond dat deze methode vezelpopulaties betrouwbare wijze identificeren mate van ± 4%. Daarnaast is deze methode minder inter-user variabiliteit en tijd per analyses aanzienlijk van de open source platform ImageJ.
Introduction
Skeletspier samenstelling ondergaat diepgaande veranderingen in fysiologische processen zoals veroudering 1, 2, oefening 3, 4, 5, 6, 7 of pathofysiologische processen zoals de ziekte van 8, 9, 10 of 11 trauma. Vandaar dat een aantal onderzoeksgebieden concentreren op de structurele effecten van deze processen naar functionele veranderingen te begrijpen. Een van de belangrijkste aspecten van het bepalen van de spierfunctie is de samenstelling van de spiervezels. Spiervezels express zware keten (MHC) eiwitten verschillende myosine en worden daardoor geclassificeerd in langzame, tussengelegen of snelle vezels 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fysiologisch spieren verschillende spiervezels samenstelling afhankelijk van hun functie in het lichaam. Gebruik spiervezels typen, kan vezelpopulaties worden gekwantificeerd aanpassing identificatie van fysiologische of pathofysiologische processen 7, 17. Historisch gezien een aantal tijdrovende methoden toegepast om onderscheid te maken tussen types spiervezels. Hiertoe werden spiervezels geclassificeerd hetzij reactiviteit van myosine ATPase bij verschillende pH-niveaus of spier enzymactiviteit. Aangezien verschillende vezelkwaliteiten niet een enkel kon worden vastgesteld, werden meerdere doorsneden nodig om alle spiervezels te identificeren en toe handmatig kwantificering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Daarentegen recente publicaties gebruikt immunohistochemie (IHC) tegen myosine zware keten eiwit snel vlek meerdere soorten vezels in één dwarsdoorsneden. Op basis van de voordelen van deze procedure, wordt nu beschouwd als de gouden standaard in de spiervezels populatie-analyse 19, 23, 24. Middels verbeterde IHC kleuringsprotocollen, waren we recent aantonen dat de volledig automatische verwerving van volledige spieren dwarsdoorsneden en daaropvolgende automatische spiervezels kwantificering mogelijk van de open source platform ImageJ. Vergeleken met handmatige kwantificering onze procedure een significant kortere periode (circa 10% van handmatige analyses) nodig per slede terwijl nauwkeurigheid van ± 4% 25
Het algemene doel van deze werkwijze is een snelle, betrouwbare, gebruikersonafhankelijke lijst automatisch spiervezel te kwantificeren geheel rat spieren beschrijven het gebruik van een open source platform. Daarnaast beschrijven we mogelijke modificaties dat het gebruik van andere monsters zoals muizen of menselijke spieren zou toelaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van dierlijke proefpersonen uitgevoerd in overeenstemming met de principes van proefdier zorg zoals aanbevolen door FELASA 26. Goedkeuring werd voorafgaand aan het onderzoek, verkregen door de institutionele review board van de Medische Universiteit van Wenen en het Oostenrijkse ministerie van Onderzoek en Wetenschap (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, referentienummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).
1. Muscle Harvest
LET OP: Een eerdere publicatie van Meng et al. 27 is verkrijgbaar beschrijft welk bevriezing van spieren specimens in detail.
- Verkrijgen gehele spieren of onvoldoende weefsel gehele dwarsdoorsnede direct na euthanasie van de dieren te verkrijgen.
- Compleet verwijderen spierweefsel of een geanesthetiseerde rat geëuthanaseerd. Verwijderen bindweefsel en pezen rondom de spier met een tang en schaar. Voor eennesthesia of euthanasie, volgt de internationale richtlijnen van FELASA 28.
- Weeg spier met behulp van een gekalibreerde precisieweegschaal. Deze snelle stap kunt vergelijkende analyses tussen spier monsters, vooral na interventionele procedures.
- Spier zet in een vat geheel gevuld met OCT-verbinding, volgens de grootte van de spier met een veiligheidsmarge van ongeveer 1 mm om alle kanten (bijvoorbeeld van aluminiumfolie).
- Bevriezen bij ongeveer 2 minuten vooraf gekoelde isopentaan behulp van vloeibare stikstof. De isopentaan moet beginnen om witte kristallen te tonen aan de bodem van de houder.
Opmerking: Deze stap is essentieel voor het behoud van de juiste architectuur van de spier waardoor aldus de juiste kleuren en vezels analyses 27. - WINKEL monsters geconserveerd in oktober gedurende ten minste 24 uur bij -80 ° C. Monsters kunnen echter worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende verscheidene maanden of zelfs jaren, als corre ctly gekoeld.
- 10 urn gesneden dwarsdoorsneden van het middendeel van de spier bij -20 ° C met een cryotoom. Als snijden bij 10 urn niet haalbaar, verhoging van de dikte in stappen van 2 urn tot maximaal 20 pm. Voldoende scherpe messen zijn van essentieel belang voor deze stap.
- Breng de secties kleefstof dia's door de onderlinge aanpassing van de dia's om de doorsneden. De doorsneden automatisch vasthouden aan de lijm dia. Bewaar de dia's bij -20 ° C gedurende de nacht vóór kleuring.
2. kleuring
OPMERKING: Een groot aantal antilichamen tegen myosine zware keten eiwitten zijn; echter hoogwaardige antilichamen zijn essentieel voor automatische registratie en verwerking. Voor verdunningen en verwijzing naar antilichamen, zie tabel 1. Voor rekenbladbestand de juiste verdunningen berekenen en bekijk het aantal benodigde hoeveelheid oplossing, ziesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental File 1.
- Ontdooien en lucht-drogen ingevroren spiersecties gedurende 10 min vóór de kleuringsprocedure.
- Wassen glijdt voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,05% Triton X gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Triton is aangetoond dat de kleuring kwaliteit aanzienlijk te verbeteren. Zie de bespreking voor meer informatie.
- Laat secties lucht drogen gedurende 2 min en bevatten de afzonderlijke dwarsdoorsneden elke dia via een hydrofoob pen (de vereiste hoeveelheid antilichaam minimaliseren) en wordt hem een extra drogen gedurende 15 min.
- Blokkeer alle objectglaasjes met PBS + 0,05% Triton X (PBST) bevattende 10% geitenserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verdunnen alle primaire antilichamen (Tabel 1) in een cocktail van PBS + 0,05% Triton X (PBST) bevattende 10% geitenserum. Meng voldoende voor gebruik. Triton X is essentieel voor gelijke kleuring van het gehele dwarsdoorsneden. Berekenenongeveer 30 ui primair antilichaam cocktail per doorsnede.
- Voor stappen 2,7-2,13 zorgen voor voldoende bescherming tegen licht. Verduisterde kamer verlichting en bedekt vlekken trays adequate bescherming bieden. Bovendien vult de kleuring bak met vloeistof onder een vochtige omgeving te bieden tijdens kleuring en uitdroogt.
- Toepassen primair antilichaam (Tabel 1) cocktails tot de objectglaasjes gedurende 1 uur in een vochtige vlekken dienblad op kamertemperatuur.
- Was dia's met PBS + 0,05% Triton X gedurende 10 minuten en daarna met nieuwe PBST gedurende 5 minuten.
- Verdunnen secundaire antilichamen in een cocktail van PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% geitenserum. Bereken 30 ul van primair antilichaam cocktail per doorsnede.
- Breng secundair antilichaam cocktail om de dia's gedurende 1 uur.
- Was dia's met PBS + 0,05% Triton X (PBST) gedurende 10 min en nieuwe PBST gedurende nog 5 min.
- Breng een DAPI kleuring van kernen kit (voorkeur lezen te gebruiken oplossingen) for 15 min of volgens de instructies van de fabrikant om celkernen vlek.
- Wassen glijdt kort in PBS + 0,05% Triton X (PBST) gedurende 1 minuut. Daarna laat dia's kort aan de lucht drogen.
- Breng fluorescerende montage medium en dekglaasjes. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht en voeren imaging optimaal binnen 24-48 uur.
3. Microscopie
- Load dia's in slide scanner. Maximaal 12 slides haalbaar afhankelijk van de diascanner.
- Start een nieuw project. Voor voorbeeld stellen de DAPI kanaal en 2.5X lens. Voor een gedetailleerde analyse gebruiken DAPI, GFP, FITC en Cy5-kanalen en 20X objectief. Autofocus is gedurende het hele project in de DAPI kanaal verworven.
- Gebruik de volgende kleuren voor elk kanaal: DAPI -blauw, FITC: groen, Texas Rood: rood, Cy5: geel.
- Voorbeelden maken elk glaasje met de DAPI kanaal. Voor dit doel toe te passen handmatige scherpstelling op het eerste monster en deze gedurende de voorvertoninganalyse om een voorbeeld foto's van ieder exemplaar te verwerven.
- Outline elke dwarsdoorsnede die moeten worden opgenomen ter nadere acquisitieproces. Draw niet schetst dicht bij de randen van het monster, om de titel van het gehele gebied van belang te waarborgen.
- Stel blootstellingstijden voor elk kanaal. Meestal blootstellingsparameters van de verschillende kanalen zijn identiek voor alle doorsneden.
- Run automatische beeld acquisitie. Controleer de juiste aanwinst voor het eerste veld van standpunten, om onjuiste overname in het begin van het geautomatiseerde proces te voorkomen.
- Indien nodig is, moet de afstandsbediening gebruik van desktop-mirroring software. Hierdoor kan de bewaking op afstand van de beeldopname proces weerspiegelen het computerscherm van de diascanner op een andere computer via een netwerk of internet. Hoewel, er geen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de fysieke installatie met betrekking tot de gebruikte slides, de virtuele omgeving van het beeld acquisitie software maakt het mogelijk het toezicht op de juiste scherpstelling en belichting tijden van de beelden. Bovendien kan de geschatte tijd voor voltooiing regelmatig worden gecontroleerd.
- Na voltooiing van de beeldopname, de controle van de correcte autofocus van alle afbeeldingen handmatig besturen indien de vezel architectuur, afzonderlijke vezels en de verschillende vezeltypen te onderscheiden.
- Re-verwerven verkeerd gericht beeld gebieden voor enkele gezichtsvelden of hele gebieden van belang. Voor de herovering van enkele gebieden, markeren gebieden of beelden in het hele project opnieuw te verwerven gebieden met een handmatige scherpstelling. In de meeste gevallen een extra afbeelding detail in een andere focus niveau leidt tot de ten onrechte scherpe beelden
- Voor elke doorsnede die moeten worden opgenomen in de uiteindelijke analyse, exporteert elk kanaal (exclusief DAPI) afzonderlijk jpeg-bestanden. Naam en bestanden sorteren op basis van de blootgestelde kanalen in mappen met de naam Texas Red, FITC en Cy5.
4. Geautomatiseerde vezelanalyse
tent "> NB: De macro kan worden verkregen uit de volgende webpagina: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- Voorbeeld elk beeld met een gebruikelijke beeldbewerking software voor analyse en letten op voldoende contrast tussen vezels gekleurd en achtergrond. Indien nodig de contrast en de helderheid van het verschil vergroten behulp helderheids- en contrastregeling commando.
- Open ImageJ of Fiji. Open de macro met de opdracht "Plugins - Macro's -. Edit" Dit toont de macro's broncode en zorgt voor een snelle aanpassing van parameters. Verander indien nodig de map directory voor elk kanaal in de broncode van de macro.
OPMERKING: Waarden voor spiervezel analyses zijn gebaseerd op ratten biceps en lumbricale spieren, of andere soorten spieren kunnen verschillende waarden vereisen. - Gebruik de opdracht "run" om de macro te starten. Alle beelden van de map worden nu geladen in de macro en gekwantificeerd in een opeenvolgende volgorde. De resultaten zijn shown in een nieuw venster. Deze stap kan van seconden tot enkele uren, afhankelijk van de hoeveelheid data te analyseren.
- Exporteer het raam resultaten als een spreadsheet-bestand. Identificeert instellingen voor het positief geteld Cy5 (langzaam), FITC (tussenproduct) en Texas Red (snel) vezels en samenvatten van totaal aantal vezels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele rattenspier doorsneden werden gekleurd met immunohistochemie snel identificeren MHC I, IIA en IIB spiervezels. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop diascanner, werden gehele doorsneden automatisch verkregen geautomatiseerde spiervezels analyses ImageJ. Het concept van de procedure is gebaseerd op een eenvoudige, betrouwbare en tijdbesparende workflow voor het kwantificeren van spiervezels.
Werkstroom van de procedure (figuur 1) begint met de juiste verwijdering en invriezen van spiermonsters, zoals eerder beschreven in een vorige training beschreven door Meng et al. 27. Dit is essentieel voor een goede kleuring kwaliteit. Daarna worden de spiermonsters gesneden en gekleurd met primaire antilichamen tegen myosine zware keten eiwitten I, IIA en IIB en geschikte secundaire fluorescente antilichamen. Voor optimale staining kwaliteit, aanbevolen concentraties van de fabrikant voor de secundaire antilichamen werden verdubbeld en Triton X voor het antilichaam cocktails zelfs kleuring kwaliteit. De immunofluorescentiekleuring van spiervezels is snel met kleine cross-reactiviteit en kan worden bereikt in ongeveer 5 uur voor batches van maximaal 26 dia's in onze opstelling. Resulterende beelden toonden een hoog contrast tussen positieve vezels en het omringende weefsel en een sterke onderscheid tussen verschillende vezelsoorten (figuur 2). Vervolgens wordt beeldverwerving uitgevoerd met een slide scanner die automatisch scannen van gehele spier dwarsdoorsneden mogelijk. Hier worden maximaal 12 slides automatisch gescand, bijvoorbeeld overnacht. Hierbij overzichtsbeelden de dwarsdoorsneden worden gemaakt in detail met een resolutie die inspectie van enkele vezel morfologie (figuur 2) mogelijk maakt.
In de laatste stap, afzonderlijke kanalen of elke dwarsdoorsnede zijn uitgevoerd voor het kwantificeren van spiervezels populaties met behulp van een speciaal voor ImageJ macro. De automatische analyse duurt ongeveer 5-10 minuten voor een rat biceps dwarsdoorsnede die tussen 3.000-6.000 vezels, terwijl de handmatige analyse duurde ongeveer 60 min 25. Automatische analyses sterk afhankelijk van rekenkracht van het werkstation en de bestandsgrootte. Zoals eerder aangetoond, de macro kan relatief spiervezel populaties te detecteren met een nauwkeurigheid van ± 4% vergeleken met handmatige analyse (Figuur 3). Totale absolute tellingen hoger vergeleken met handmatige analyses echter relatieve tellingen hetzelfde gebleven binnen ± 4% bereik, zoals eerder aangegeven.
Figuur 1: Workflow van de spiervezels kwantificering Protocol. Eerst worden spiermonsters verkregen uit dedier en bevroren correct (zie Jupiter video door Meng et al. 27). Snijd vervolgens spier doorsneden en gedrag immunokleuring. Afbeeldingen ophalen van gekleurde dwarsdoorsneden met behulp van een slide scanner voor gedetailleerde hele dwarsdoorsneden beelden. Voer de kwantificering macro voor ImageJ voor spiervezels bevolking analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Rat bicepsenspier doorsnede. Overzicht van de lood rat bicepsenspier doorsnede: De doorsnede toont slow MHC I vezels in geel, tussenliggende MHC IIA vezels in groen en snel MHC IIB vezels in rood. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.
Figuur 3: Muscle Fiber analyseresultaten van Rat doorsnede in Figuur 2. Analyses van de spier MHC I, MHC IIA en MHC IIB vezels. Top: Absolute tellingen van spiervezels door handmatige of automatische tellen. Midden: Relatieve delen van spiervezels populatie na handmatige kwantificatie. Bodem: Relatieve delen van spiervezels populaties na absolute kwantificatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: immunohistochemische kleuring van MHC Fibers. Beschrijving van primaire en secundaire antilichamen waaronder verdunningen voor de sTaining procedure. (Gemodificeerd van Bergmeister et al. 25)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we een algemeen toegankelijke methode te bestuderen automatisch kwantificeren spiervezel populaties ratten doorsneden door immunohistochemie in een tijd efficiënte manier. Voor reproduceerbaarheid presenteren wij een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving en mogelijke modificaties voor toepassingen in andere soorten niet beschreven in deze studie. Verder bespreken we de voordelen van de werkwijze voorwaarden voor een optimale werking en beperkingen.
Momenteel is een aantal werkwijzen bestaan om kleuring spiervezels populaties identificeren en een aantal werkwijzen zijn beschreven voor manuele of semi-automatische kwantificering van spiervezels 17. Echter, geen protocollen bestaan die zowel combineren en beschrijven een standaardbenadering betrouwbaar vlek spiervezels populaties automatisch verwerven en kwantificeren spiervezels, via vrij beschikbare software analyseert. Op basis van eerdere publicaties"> 24, 29, we geoptimaliseerde bestaande zware keten immunohistochemische kleuringen myosine voor automatische analyse van vezelpopulaties in muriene spieren dwarsdoorsneden. Daardoor hebben we onlangs aangetoond dat de geautomatiseerde analyse van hele dwarsdoorsneden haalbaar, betrouwbaar vergeleken met handmatige analyses en meer tijdsefficiënte 27. Bovendien is de werkwijze gebruikersonafhankelijke waardoor menselijke fouten verminderd en waardoor een objectieve vergelijking zoals bijvoorbeeld tussen de verschillende behandelingsgroepen.
Het gehele protocol is gebaseerd op gedetailleerde hoge kwaliteitsbeelden van gehele dwarsdoorsneden voor de geautomatiseerde kwantificeringsproces. ImageJ als open source software biedt een aantal krachtige en toch eenvoudige commando's, die gerangschikt in een macro maken spiervezel identificatie. Echter, kwaliteitsverschillen binnen of tussen doorsnede moeten worden geminimaliseerd om betrouwbare resultaten te bereiken. We hebben identified een aantal kritische stappen die essentieel zijn voor het bereiken van de vereiste kwaliteit zijn. Dit omvat het gebruik van optimale primaire antilichamen. Ook het gebruik van geschikte secundaire antilichamen verschaffen verschillende fluorescentiesignalen essentieel was en we verdubbeld concentraties verbeterde signaalkwaliteit. Daarnaast zagen we een hogere en meer gelijkmatige kleuring kwaliteit met het gebruik van Triton X in het antilichaam cocktails. Belangrijk is dat deze werd niet waargenomen met het gebruik van Tween plaats. Beelden met suboptimale kleuring kwaliteit werden handmatig gecorrigeerd voor een beter contrast met automatische beeldopname mogelijk te maken. Het belangrijkste voor de aankoop proces was de correcte werking van de autofocus-systeem. Hiervoor gebruikten we een DAPI-kit om de celkernen van satellietcellen, die een betrouwbare landmark waarin het autofocussysteem vlekken.
Voor het ImageJ kwantificeringsproces, werden optimale waarden bepaald door handmatige geautomatiseerde uitslagen en opeenvolgende fine-tuning van de parameters 25: Threshold en analyseren van deeltjes. De verkregen waarden waren voldoende biceps en lumbricale spieren en kan bijgevolg andere spieren rat. Bovendien Bloemberg et al. 24 blijkt dat de kleuring is toepasbaar voor andere soorten, zoals mensen of muizen. Derhalve kan het gehele protocol theoretisch worden aangepast voor gebruik in andere soorten, maar zou echter vereisen vaststellen van de noodzakelijke parameters. De betreffende commando's worden gemarkeerd in de broncode.
Verdere mogelijke modificaties van de werkwijze omvatten het instellen van de diascanner. In onze opstelling, gebruikten we een dia-scanner systeem, met een 2.5x lens voor het voorbeeld en 20X lens voor de feitelijke overname. Overwegende dat het veranderen van de lens voor de preview-proces geen significant voordeel zal bieden in termen van kwaliteit of de snelheid, kan de overname ook worden uitgevoerd met behulp van een 10x lens om de snelheid (en con verhogensequently de resolutie) of in plaats van een 40X objectief voor het oplossen en bijgevolg acquisitietijd toenemende verminderen. Zoals getoond in figuur 2, waardoor de resolutie is waarschijnlijk niet nodig voor ratten spieren, maar kan worden overwogen voor andere diersoorten. Andere modificaties die geschikt zijn bij deze opstelling zijn zijn kleuring voor MHC-IIX vezels of laminine extracellulaire matrix van de spier te visualiseren. Deze wijzigingen vereisen echter veranderen de verwerving setup voor twee extra reflectoren (bijvoorbeeld Cy7) en het modificeren van de ImageJ macro aanvullende analyses op te nemen met de correcte parameters om de scriptcode.
Een beperking van deze techniek is dat de absolute vezel tellingen waren significant hoger vergeleken met handmatige tellingen in een eerdere analyse, hoewel relatieve tellingen hetzelfde gebleven 25. Dit is waarschijnlijk het gevolg van onvoldoende scheiding en dus herhaalde kwantificering van vezels. dit effectvaker voorkomt bij vezels die onvoldoende zijn gekleurd en tonen andere typen artefacten. Echter, het aantal relatieve vezels telt en daarmee vezelpopulaties bleef zeer nauwkeurig. In vergelijking met de gangbare praktijk van het kwantificeren van een bepaalde sub-gedeelte van een dwarsdoorsnede, bijvoorbeeld 40%, zijn wij van mening dat de analyses van de gehele dwarsdoorsnede van de ImageJ nauwkeuriger zijn als gevolg van de heterogene spiervezel architectuur (figuur 2) . Een mogelijke beperking van de procedure is de eis om dure diascanners voor automatische verwerving van gehele dwarsdoorsnede, die niet algemeen beschikbaar zijn te gebruiken. Een alternatieve benadering is om enkel veld van gedachten te verwerven en te kwantificeren elk afzonderlijk door de macro.
Tot slot, we geloven dat dit protocol is breed toegankelijk en maakt het mogelijk de snelle en betrouwbare kwantificering van volledige spieren dwarsdoorsneden met behulp van vrij beschikbare analyses software. Daarom is de geïntroduceerde procedurelevert een nuttige bijdrage aan de analyses van spiervezels morfologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de christelijke Doppler Research Foundation. We willen graag bedanken Sabine Rauscher van de Core Facility Imaging aan de Medische Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor ondersteuning van het gehele project. Primaire antilichamen werden ontwikkeld door Schiaffino, S., verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank, gecreëerd door de NICHD van de NIH en gehouden op de Universiteit van Iowa, Departement Biologie, Iowa City, IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
