Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.
Abstract
Quantifizierung von Muskelfaserpopulationen stellt einen tieferen Einblick in die Auswirkungen der Krankheit, Trauma und verschiedene andere Einflüsse auf die Skelettmuskelmasse. Verschiedene zeitaufwendige Verfahren sind traditionell verwendet worden, Faserpopulationen in vielen Bereichen der Forschung zu studieren. Doch vor kurzem immunhistochemischen Methoden basierend auf Myosin Proteinexpression bietet eine schnelle Alternative entwickelt, um mehrere Fasertypen in einem einzigen Abschnitt zu identifizieren. Hier präsentieren wir ein schnelles, zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll für eine verbesserte Qualität der Färbung, so dass die automatische Erfassung ganzer Querschnitt und die automatischen Quantifizierung von Faserpopulationen mit ImageJ. Zu diesem Zweck werden eingebettete Skelettmuskulatur in Querschnitte geschnitten, gefärbt unter Verwendung von schweren Myosinketten der Antikörper mit fluoreszierenden sekundären Antikörper und DAPI für Zellkerne Färbung. Ganze Querschnitte werden dann hochauflösendes Verbund automatisch über einen Schiebe Scanner gescannt zu erhaltenBilder der gesamten Probe. Faserpopulation Analysen werden anschließend langsam, mittel und schnell Fasern unter Verwendung eines automatisierten Makro für ImageJ ausgeführt zu quantifizieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass diese Methode Populationen Faser identifizieren kann zuverlässig auf ein Maß von ± 4%. Darüber hinaus reduziert diese Methode inter Benutzer Variabilität und Zeit pro signifikant die Open-Source-Plattform ImageJ Analysen mit.
Introduction
Skelettmuskelmasse erfährt tiefe Veränderungen während der physiologischen Prozesse , wie Alter 1, 2, Aufgabe 3, 4, 5, 6, 7 oder pathophysiologische Prozesse wie Krankheit 8, 9, 10 oder 11 Trauma. mehrere Forschungsfelder konzentrieren sich auf die strukturellen Auswirkungen dieser Prozesse daher zu funktionellen Veränderungen zu verstehen. Einer der wichtigsten Aspekte der Muskelfunktion bestimmt, ist die Zusammensetzung der Muskelfasern. Muskelfasern exprimieren verschiedene Myosin schwere Kette (MHC) -Proteinen und dadurch klassifiziert in langsam, mittel oder schnell Fasern 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Physiologisch haben Muskeln unterschiedliche Muskelfaserzusammensetzungen in Abhängigkeit von ihrer Funktion im Körper. Verwendung von Muskelfasern Typisierung, Faserpopulationen kann quantifiziert werden 7 Anpassung an physiologische oder pathophysiologische Prozesse zu identifizieren, 17. Historisch gesehen, wurde zwischen den Muskelfasertypen zu unterscheiden, eine Anzahl von zeitraubenden Methoden angewandt. Zu diesem Zweck wurde Muskelfasern entweder bei verschiedenen pH-Werten oder Muskelenzymaktivität durch die Reaktivität von Myosin ATPase eingestuft. Da unterschiedliche Faserqualitäten nicht in einem einzigen Abschnitt, mehrere Querschnitte erforderlich waren , bewertet werden könnten alle Muskelfasern zu identifizieren und 14 manuelle Quantifizierung ermöglichen, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Im Gegensatz dazu verwendeten jüngste Veröffentlichungen Immunhistochemie (IHC) gegen Myosin schweren Kette-Protein kodiert, um schnell mehrere Fasertypen in einer einzelnen Querschnitte beflecken. Auf der Grundlage der Vorteile dieses Verfahrens ist es nun der Goldstandard in der Muskelfaserpopulationsanalyse betrachtet 19, 23, 24. Mit verbesserten IHC Färbeprotokollen, waren wir, dass die vollautomatische Erfassung ganzer Muskelquerschnitt und die anschließenden Faser Quantifizierung automatischer Muskels zu zeigen, vor kurzem der Lage möglich ist, die Open-Source-Plattform ImageJ. Im Vergleich zu manueller Quantifizierung, vorausgesetzt unser Verfahren eine signifikante Abnahme in der Zeit (etwa 10% der manuellen Analysen) erforderlich pro Folie während genauer wobei 4% bis ± 25
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle, zuverlässige, benutzerunabhängige Anleitung zur automatischen Muskelfaser Quantifizierung in ganzen Ratten Muskeln unter Verwendung einer Open-Source-Plattform zu beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir mögliche Änderungen, die seine Verwendung für andere Proben wie Mäuse oder menschliche Muskeln erlauben würden.
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Protocol
Alle Verfahren einschließlich Tierversuchspersonen wurden in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierhaltung durchgeführt , wie von FELASA 26 empfohlen. Genehmigung erhalten wurde vor der Studie der Institutional Review Board der Medizinischen Universität Wien und das Bundesministeriums für Forschung und Wissenschaft (BMWF: Bund fuer Wissenschaft und Forschung, Referenznummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).
1. Muskel-Ernte
HINWEIS: Eine frühere Veröffentlichung von Meng et al. 27 ist verfügbar , um das richtige Einfrieren von Muskelproben im Detail zu beschreiben.
- Erhalten gesamte Muskeln oder ausreichend Gewebe zu erwerben gesamte Querschnitte unmittelbar nach der Tötung der Tiere.
- Entfernen Sie den gesamten Muskel von einer narkotisierten oder eingeschläfert Ratte. Entfernen Sie die gesamte Bindegewebe und Sehnen rund um den Muskel mit einer Pinzette und Schere. Für einnesthesia oder Euthanasie, folgen Sie den internationalen Richtlinien von FELASA 28.
- Wiegen Muskel eine kalibrierte Präzisionsskala. Dieser schnelle Schritt ermöglicht vergleichende Analysen zwischen Muskelproben, vor allem nach interventionellen Verfahren.
- Setzt Muskel in ein Gefäß, gefüllt vollständig mit OCT - Verbindung, entsprechend die Größe des Muskels mit einem Sicherheitsabstand von etwa 1 mm auf allen Seiten ( zum Beispiel aus Aluminiumfolie).
- Einfrieren in ca. 2 min vorgekühltem Isopentan unter Verwendung von flüssigem Stickstoff. Das Isopentan muss beginnen am Boden des Behälters weiße Kristalle zu zeigen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für die richtige Architektur des Muskels erhalten und ermöglicht dadurch die richtige Färbung und Faseranalysen 27. - Store Proben für mindestens 24 h bei -80 ° C in OCT konserviert. Die Proben können, werden jedoch bei -80 ° C für mehrere Monate oder sogar Jahre gespeichert, wenn corre ctly abgekühlt.
- Schnitt 10 um Querschnitte von dem mittleren Bereich des Muskels bei -20 ° C eine Kryotom verwenden. Wenn bei 10 & mgr; m Schneiden nicht möglich ist, erhöhen, die Dicke in Schritten von 2 & mgr; m bis zu einem Maximum von 20 & mgr; m. Hinreichend scharfe Schneidklingen sind für diesen Schritt notwendig.
- Übernehmen Sie die Abschnitte Klebstoff gleitet durch Annähern die Folien auf die Querschnitte. Die Querschnitte haften automatisch an die Kleberutschen. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C über Nacht vor der Färbung.
2. Färbung
HINWEIS: Eine große Anzahl von Antikörpern gegen Myosin-Proteine zur Verfügung steht; jedoch sind qualitativ hochwertige Antikörper wesentlich für die automatisierte Erfassung und Analysen. Für Verdünnungen und Bezug auf Antikörper, siehe Tabelle 1. Für eine Tabellenkalkulationsdatei die korrekten Verdünnungen und sehen Sie die Anzahl der erforderlichen Lösungsmengen zu berechnen, siehesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental 1 Datei.
- Tauen und Luft trocknet die gefrorenen Muskelschnitte für 10 Minuten vor dem Färbeverfahren.
- Wasch gleitet vorsichtig mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) + 0,05% Triton X für 10 min und dann für 5 min. Triton hat sich gezeigt, signifikant die Färbung Qualität zu verbessern. Siehe die Diskussion für weitere Details.
- Lassen Abschnitte der Luft trocknet für 2 min und umreißen Einzelquerschnitten auf jeder Folie eine hydrophobe Stift (erforderliche Menge des Antikörpers zu minimieren) und ermöglicht eine zusätzliche Trocknung für 15 min.
- Blockiert alle Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) mit 10% Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur.
- Verdünnte alle primären Antikörper (Tabelle 1) in einem Cocktail von PBS + 0,05% Triton X (PBST) mit 10% Ziegenserum. Mischen Sie ausreichend vor der Anwendung. Triton X ist von wesentlicher Bedeutung für die gleiche Färbung der gesamten Querschnitten. Berechnenetwa 30 & mgr; l des primären Antikörpers Cocktail pro Querschnitt.
- Für die Schritte 2,7-2,13 ausreichenden Schutz vor Licht gewährleisten. Gedimmten Raumbeleuchtung und bedeckt Färbeschalen bieten ausreichenden Schutz. Zusätzlich füllt das Färbewanne mit Flüssigkeit am Boden während der Färbung eine feuchte Umgebung bereitzustellen, und das Trocknen zu verhindern.
- Die primären Antikörper anwenden (Tabelle 1) Cocktails auf die Objektträger für 1 h in einer feuchten Färbeschale auf Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X für 10 min und dann mit neuen PBST für 5 min.
- Verdünnte Sekundärantikörper in einem Cocktail von PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% Ziegenserum. Berechnen von 30 & mgr; l des primären Antikörpers Cocktail pro Querschnitt.
- Bewerben sekundären Antikörper-Cocktail auf die Objektträger für 1 h.
- Waschen Sie die Objektträger mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) für 10 min und mit neuen PBST für weitere 5 min.
- Tragen Sie eine DAPI Kernfärbung Kit (vorzugsweise Lese-to-use-Lösungen) for 15 min oder nach den Anweisungen des Herstellers Zellkerne anzufärben.
- Waschobjektträger kurz mit PBS + 0,05% Triton X (PBST) für 1 min. Danach lassen gleitet der Luft trocknen kurz.
- Anwenden fluoreszierendes Eindeckmediums und Deckgläser. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt und führt Bildgebung optimal innerhalb von 24-48 h.
3. Mikroskopie
- Last rutscht in Dia-Scanner. Es können maximal 12 Folien ist möglich, abhängig von der Dia-Scanner.
- Starten Sie ein neues Projekt. Für die Vorschau eingestellt den DAPI-Kanal und die 2,5X Linse. Für die detaillierte Analyse verwenden DAPI, GFP, FITC und Cy5-Kanäle und das 20x-Objektiv. Der Autofokus wird während des gesamten Projekts im DAPI Kanal erworben.
- Verwenden Sie die folgenden Farben für jeden Kanal: DAPI -blau, FITC: grün, Texas Rot: Rot, Cy5: gelb.
- Erstellen Vorschauen jeder Folie des DAPI Kanal. Zu diesem Zweck gelten manuellen Fokus auf der ersten Probe und verwenden Sie es überall in der VorschauAnalyse Vorschaubild von jeder Probe zu erwerben.
- Skizzieren jeden Querschnitt, der für die detaillierte Erfassung einbezogen werden sollten. ziehen Sie nicht umreißt der Nähe der Ränder der Probe, Beschriftung des gesamten Gebietes von Interesse zu gewährleisten.
- Set Belichtungszeiten für jeden Kanal. In den meisten Fällen Belichtungsparameter der verschiedenen Kanäle sind identisch für alle Querschnitte auf.
- Führen Sie eine automatische Bildaufnahme. Korrekten Erwerb für das erste Feld der Ansichten, fehlerhafte Erfassung früh im automatisierten Prozess zu verhindern.
- Bei Bedarf etabliert Fernbedienung Desktop-Spiegelung Software. Dies ermöglicht die Fernüberwachung des Bilderfassungsprozesses durch den Computer-Bildschirm des Dia-Scanner auf einem anderen Computer über ein beliebiges Netzwerk oder Internet-Spiegelung. Obwohl, können keine Änderungen an der physikalischen Einrichtung in Bezug auf die verwendeten Folien hergestellt werden, die virtuelle Umgebung der Bildaufnahme-Software ermöglicht die Überwachung korrekte Fokus oder Belichtungszeiten der Bilder. Darüber hinaus kann die geschätzte Zeit für die Fertigstellung regelmäßig überprüft werden.
- Nach Beendigung der Bildaufnahme, Steuerung des korrekten Autofokus aller Bilder, die durch manuell, wenn die Faserarchitektur zu steuern, einzelne Fasern und die verschiedenen Fasertypen unterscheidbar sind.
- Re-acquire fokussiert falsch Bildbereiche für einzelne Sichtfelder oder ganze Bereiche von Interesse. Für reacquisition der einzelnen Bereiche markieren Bereiche oder Bilder während des gesamten Projekts und reacquire Bereiche mit manuellem Fokus. In den meisten Fällen führt ein zusätzlicher Bildausschnitt in einer anderen Fokusebene auf die falsch fokussierten Bilder
- Für jeden Querschnitt, der in der endgültigen Analyse einbezogen werden soll, exportieren, jeden Kanal (ohne DAPI) separat als JPEG-Dateien. Name und sortieren Sie Dateien nach den freiliegenden Kanäle in Ordnern mit dem Namen Texas Red, FITC und Cy5.
4. Automatisierte Faseranalyse
Zelt "> Hinweis: Das Makro aus der folgenden Webseite erhältlich: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- Vorschau jedes Bild eine konventionelle Bildbearbeitungssoftware vor Analysen und prüfen, ob ein ausreichender Kontrast zwischen stained Fasern und Hintergrund verwendet wird. Falls notwendig, Einstellen des Kontrasts und der Helligkeit der Differenz zu erhöhen, unter Verwendung von Helligkeits- und Kontrasteinstellung Befehle.
- Öffnen ImageJ oder Fidschi. Öffnen Sie das Makro mit dem Befehl „Plugins - Makros -. Edit“ Dies zeigt den Makros Quellcode und ermöglicht eine schnelle Anpassung von Parametern. für jeden Kanal in dem Quellcode des Makros Falls erforderlich, Ordner-Verzeichnis ändern.
HINWEIS: Die Werte für Analysen Muskelfaser basieren auf Ratten Bizeps und Lumbrikalmuskel Muskeln, andere Arten oder Muskeln können unterschiedliche Werte erfordern. - Verwenden Sie den Befehl „Ausführen“ das Makro zu starten. Alle Bilder des Ordners werden nun in das Makro geladen und in einer aufeinanderfolgenden Reihenfolge quantifizieren. Die Ergebnisse sind shown in einem neuen Fenster. Dieser Schritt kann von Sekunden bis zu mehreren Stunden dauern, abhängig von der Datenmenge, die analysiert werden.
- Exportieren Sie das Ergebnisfenster als Tabellenkalkulationsdatei. Identifizieren Sie Werte für positiv gezählt Cy5 (langsam), FITC (intermediate) und Texas Rot (schnell) Fasern und summieren für Gesamtfaserzahl.
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Representative Results
Ganzer Rattenmuskel Querschnitt wurden gefärbt schnell Immunhistochemie unter Verwendung von MHC-I, IIA und IIB Muskelfasern zu identifizieren. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops Diascanners wurden ganze Querschnitte dann für automatisierte Muskelfasern automatisch erfasst Analysen mit ImageJ. Das Konzept des Verfahrens zugrunde, eine einfache, zuverlässige und zeitsparende Workflow für die Quantifizierung von Muskelfasern auf der Bereitstellung.
Die Prozedur des Arbeitsablauf (Abbildung 1) beginnt mit der korrekten Entfernung und Einfrieren von Muskelproben, wie zuvor in einem früheren Tutorial von Meng et al. 27. Dies ist wichtig für eine angemessene Qualität der Färbung. unter Verwendung von primären Antikörpern gegen Myosin schwere Kette-Proteine der Klasse I, IIA und IIB und geeigneten sekundären fluoreszierenden Antikörper Im nächsten Schritt werden die Muskelproben geschnitten und gefärbt. Für eine optimale staining Qualität, die empfohlenen Konzentrationen des Herstellers für den sekundären Antikörper wurden verdoppelt und Triton X für die Antikörper-Cocktails verwendet auch Färbungsqualität. Die Immunfluoreszenzfärbung von Muskelfasern ist schnell mit geringer Kreuzreaktivität und kann in ca. 5 h für Chargen von bis zu 26 Dias in unserer Einrichtung erreicht werden. Resultierenden Bilder zeigten einen hohen Kontrast zwischen positiven Fasern und dem umgebenden Gewebe und eine starke Unterscheidung zwischen verschiedenen Fasertypen (Abbildung 2). Als nächstes wird die Bildaufnahme unter Verwendung eines Diascanners durchgeführt, das automatische Scannen der gesamten Muskelquerschnitte ermöglicht. Hier können bis zu 12 Dias werden automatisch, beispielsweise gescannt, über Nacht. Hiermit Übersicht Bilder des Querschnitts sind in hohen Detailstufe mit einer Auflösung erzeugt , die Inspektion der einzelnen Fasermorphologie ermöglicht (Figur 2).
Im letzten Schritt, einzelne Kanäle of jeden Querschnitt werden für die Quantifizierung von Muskelfaserpopulationen unter Verwendung eines speziell für Makro ImageJ exportiert. Die automatische Analyse dauert etwa 5-10 Minuten für eine Ratte biceps Querschnitt zwischen 3.000-6.000 Fasern enthält, während die manuelle Analysen 25 etwa 60 min dauerte. Automatische Analysen hängen stark von Rechenleistung der Workstation und Dateigröße. Wie zuvor gezeigt, ist die Makro Lage Populationen relative Muskelfaser zu erfassen , mit einer Genauigkeit von ± 4% im Vergleich zur manuellen Analyse (Abbildung 3). Insgesamt absolute Zählungen sind höher im Vergleich zum manuellen Analysen blieben jedoch relativ ähnlich Zählungen innerhalb eines Bereichs ± 4%, wie zuvor gezeigt.
Abbildung 1: Workflow des Muskelfaser Quantifizierung Protokoll. Zuerst Muskelproben werden aus dem erhaltenenTier und gefriert richtig (siehe JoVE Video von Meng et al. 27). Dann Muskelquerschnitt geschnitten und Immunfärbung führen. Erwerben Sie Bilder von gefärbten Querschnitten eines Dia-Scanner für detaillierte ganze Querschnitte von Bildern verwenden. Führen Sie die Quantifizierung Makro für ImageJ für Muskelfaserpopulation analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Rat der Muskelmuskelquerschnitt. Übersicht eines gefärbten Ratte Bizepsmuskel Querschnitt: Der Querschnitt langsam MHC-I-Fasern in gelb, Zwischen MHC IIA Fasern in grün und schnell MHC IIB Fasern in rot zeigt. Bitte klicken Sie hier einen größeren versi anzuzeigenauf dieser Figur.
Abbildung 3: Muskelfaser Analysiert Ergebnisse Ratte Querschnitt in Abbildung 2. Analyse der Muskel MHC I, MHC II A und MHC IIB Fasern. Top: Absolute Zählungen von Muskelfasern durch manuelle oder automatische Zählung. Mitte: Relative Teile der Muskelfasern Populationen nach manueller Quantifizierung. Unten: Relative Portionen von Muskelfasern Populationen nach dem absoluten Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: immunhistochemischen Färbung von MHC - Fasern. Beschreibung von primären und sekundären Antikörpern einschließlich Verdünnungen für die s verwendetTaining Verfahren. (Modifiziertes von Bergmeister et al. 25)
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Discussion
Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methodik zu studieren und automatisch die Muskelfaser Populationen von Ratten Querschnitt über die Immunhistochemie in einer Zeit effiziente Art und Weise zu quantifizieren. Für Reproduzierbarkeit präsentieren wir einen detaillierten Schritt für Schritt erklärt und mögliche Modifikationen für Anwendungen in anderen Arten, die nicht in dieser Studie beschrieben. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile des Verfahrens, Voraussetzungen für eine optimale Funktion und seine Grenzen.
Derzeit gibt es eine Anzahl von Färbemethoden Muskelfasern Populationen und eine Anzahl von Methoden zu identifizieren , wurde für die manuelle oder halbautomatische Quantifizierung von Muskelfasern 17 beschrieben. Jedoch keine Protokolle vorliegen, die beide kombinieren und einen standardisierten Ansatz beschreiben zuverlässig Muskelfaserpopulationen beflecken und automatisch zu erfassen und Muskelfasern zu quantifizieren, frei verfügbar Analysen Software. Basierend auf früheren Veröffentlichungen„> 24, 29, wir optimiert vorhandene Myosin schwere Kette Immunhistochemie Färbeverfahren für die automatisierte Analyse von Faserpopulationen in murine Muskelquerschnitte. Dadurch wir haben kürzlich gezeigt , dass die automatisierte Analyse von Vollquerschnitten ist machbar, zuverlässig im Vergleich zur manuellen Analysen und zeiteffizienter 27. Darüber hinaus ist das Verfahren benutzerunabhängige somit menschliche Fehler zu reduzieren und dadurch einen objektiven Vergleich wie beispielsweise zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen.
Das gesamte Protokoll basiert auf der Bereitstellung von detaillierten und qualitativ hochwertigen Bildern von ganzen Querschnitt für den automatisierte Quantifizierung Prozess. ImageJ als Open-Source-Software stellt eine Anzahl von leistungsfähigen und dennoch einfachen Befehlen, die in einem Makro angeordneten Muskelfaser Identifizierung ermöglichen. Allerdings Qualitätsunterschiede innerhalb oder zwischen dem Querschnitt Notwendigkeit, zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, minimiert werden. Wir haben identified einige wichtige Schritte, die zur Erreichung der geforderten Qualität wesentlich sind. Dies schließt die Verwendung von optimalen primären Antikörpern. Ebenso wurde die Verwendung von geeigneten sekundären Antikörper bereitstellt unterschiedlichen fluoreszierenden Signale wesentlich, und wir verdoppelt Konzentrationen für eine verbesserte Signalqualität. Darüber hinaus beobachteten wir eine höhere und sogar Färbequalität mit der Verwendung von Triton X in den Antikörper-Cocktails. Wichtig war, dies nicht mit der Verwendung von Tween stattdessen beobachtet. Weitere Bilder mit suboptimalen Färbequalität wurden für einen besseren Kontrast manuell eingestellt automatische Bildaufnahme zu ermöglichen. Am wichtigsten für den Erwerb Prozess war die korrekte Funktion des Autofokus-Systems. Zu diesem Zweck haben wir einen DAPI-Kit die Zellkerne von Satellitenzellen zu färben, die einen zuverlässigen Orientierungspunktes für das Autofokus-System zur Verfügung gestellt.
Für die ImageJ Quantisierungsverfahren wurden optimale Werte durch Vergleich manueller auf automatische und aufeinanderfolgende Ergebnisse fein tu bestimmtning der Parameter 25: Threshold und Analysieren Partikel. Die resultierenden Werte waren ausreichend für Bizeps und Lumbrikalmuskel Muskeln und daher möglicherweise andere Ratte Muskeln. Zusätzlich Bloemberg et al. 24 zeigen , dass die Färbung auf andere Arten , wie Menschen oder Mäusen , anwendbar ist. Daher kann das gesamte Protokoll theoretisch für die Verwendung in anderen Arten angepasst werden, jedoch würde jedoch erfordern, um die notwendigen Parameter zu identifizieren. Die entsprechenden Befehle werden im Quelltext hervorgehoben.
Weitere mögliche Modifikationen des Verfahrens umfassen die Einrichtung des Dia-Scanners. In unserem Setup verwenden wir ein Dia-Scanner-System, mit einem 2,5-fach-Objektiv für die Vorschau und 20X Objektiv für den tatsächlichen Erwerb. Während Wechsel wird die Linse für den Vorschau-Prozess keinen signifikanten Vorteil in Bezug auf die Qualität oder Geschwindigkeit liefern, kann der Erwerb auch ein 10fach-Objektiv durchgeführt werden, mit der Geschwindigkeit zu erhöhen (und consequently vermindern die Auflösung) oder stattdessen ein 40X-Objektiv für die Auflösung zu erhöhen und folglich Akquisitionszeit. Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, ist die Auflösung zu erhöhen höchstwahrscheinlich nicht für Ratten Muskeln notwendig , aber auch für andere Arten in Betracht gezogen werden. Andere Modifikationen, die in dieser Konfiguration geeignet sind, sind Anfärbung für MHC-IIX Fasern oder Laminin der Muskel der extrazellulären Matrix zu visualisieren. Diese Änderungen erfordern jedoch den Erwerb Setup für zwei zusätzliche Reflektoren zu ändern (zum Beispiel Cy7) und Modifizieren des ImageJ Makro zusätzlich gehören Analysen mit den richtigen Parametern zu dem Script-Code.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist , dass die absoluten Faserzahlen signifikant höher waren im Vergleich zur manuellen Zählungen in einer früheren Analyse, obwohl relativ Zählungen ähnlich 25 blieben. Dies ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer unzureichenden Trennung und somit wiederholte Quantifizierung von Fasern. Dieser Effektist in Fasern, die nicht ausreichend gebeizt oder zeigen andere Arten von Artefakten sind. Allerdings blieb die Anzahl der relativen Faserzahlen und damit Faserpopulationen sehr genau. Im Vergleich zu der üblichen Praxis , einen definierten Unterabschnittes eines Querschnitts der Quantifizierung, zB 40%, glauben wir , dass Analysen des gesamten Querschnitts durch die ImageJ sind genauer als Ergebnis der heterogenen Muskelfaserarchitektur (Figur 2) . Eine mögliche Einschränkung des Verfahrens ist die Voraussetzung für die automatisierte Erfassung von gesamtem Querschnitt teure Diascanner zu verwenden, die nicht allgemein verfügbar ist. Ein alternativer Ansatz ist Einfeld der Ansichten zu erfassen und jeweils einzeln durch das Makro zu quantifizieren.
Abschließend glauben wir dieses Protokoll weithin zugänglich und ermöglicht die schnelle und zuverlässige Quantifizierung der gesamten Muskelquerschnitte analysiert Software frei verfügbar werden. Daher wird das Verfahren eingeführtbietet die Analysen der Muskelfasermorphologie einen nützlichen Beitrag.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Christian Doppler Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir möchten, dass Sabine Rauscher von der Core Facility Imaging an der Medizinischen Universität Wien, Österreich für die Unterstützung während des gesamten Projektes danken. Primäre Antikörper wurden von Schiaffino, S. entwickelt, erhalten von der Entwicklungs Studies Hybridoma Bank durch die NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, IA gehalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C.
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J.
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J.
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
