Summary
Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.
Abstract
La quantificazione delle popolazioni di fibra muscolare fornisce una più profonda comprensione degli effetti di malattie, traumi, e varie altre influenze sulla composizione del muscolo scheletrico. Vari metodi in termini di tempo sono stati tradizionalmente usati per studiare le popolazioni di fibra in molti campi della ricerca. Tuttavia, recentemente sviluppato metodi immunoistochimici basati su proteine espressione della catena pesante della miosina fornire una rapida alternativa per identificare i tipi di fibre multiple in una singola sezione. Qui, vi presentiamo un protocollo rapido, affidabile e riproducibile per migliorare la qualità della colorazione, consentendo l'acquisizione automatica di profilati trasversali interi e quantificazione automatica delle popolazioni fibra con ImageJ. A questo scopo, i muscoli scheletrici incorporati sono tagliati in sezioni, colorati con miosina catene pesanti anticorpi con anticorpi fluorescenti secondarie e DAPI per nuclei delle cellule colorazione. intere sezioni trasversali vengono esaminati automaticamente utilizzando uno scanner diapositiva per ottenere alta risoluzione compositole fotografie dell'intera campione. analisi demografiche fibra vengono successivamente eseguite per quantificare fibre lente, intermedie e rapide utilizzando una macro automatizzato per ImageJ. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo può identificare popolazioni di fibre in modo affidabile ad un grado di ± 4%. Inoltre, questo metodo riduce la variabilità inter-utente e tempo per analisi significativamente utilizzando la piattaforma open source ImageJ.
Introduction
Composizione muscolo scheletrico subisce profonde modificazioni durante i processi fisiologici quali l'invecchiamento 1, 2, 3 esercizio, 4, 5, 6, 7, o processi patofisiologici come il morbo 8, 9, 10 o 11 trauma. Quindi, diversi campi di concentrato di ricerca sugli effetti strutturali di questi processi per capire i cambiamenti funzionali. Uno degli aspetti chiave che determinano la funzione muscolare è la composizione delle fibre muscolari. Fibre muscolari esprimono catena pesante proteine differente miosina (MHC) e sono quindi classificate in lento, intermedi, o veloce fibre 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, muscoli hanno differenti composizioni di fibre muscolari a seconda della loro funzione nel corpo. Utilizzando fibre muscolari digitazione, le popolazioni di fibre possono essere quantificati per identificare adattamento a processi fisiologici o patofisiologici 7, 17. Storicamente, sono stati applicati vari metodi richiedono tempo per distinguere tra tipi di fibra muscolare. A questo scopo, le fibre muscolari erano classificati mediante reattività della miosina ATPasi a diversi livelli di pH o enzima attività muscolare. Come differente qualità di fibra non può essere stabilita in una singola sezione, sezioni multiple sono stati richiesti per identificare tutte le fibre muscolari e permettere manuale quantificazione 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Al contrario, recenti pubblicazioni usati immunoistochimica (IHC) contro proteina miosina catena pesante di macchiare rapidamente tipi di fibre multiple in un singolo sezioni trasversali. Sulla base dei vantaggi di questa procedura, è ora considerato il gold standard per l'analisi della popolazione fibre muscolari 19, 23, 24. Utilizzando migliorate protocolli di colorazione IHC, recentemente siamo stati in grado di dimostrare che l'acquisizione completamente automatica delle sezioni trasversali muscolo intero e successiva quantificazione automatica fibra muscolare è possibile utilizzando la piattaforma open source ImageJ. Rispetto alla quantificazione manuale, la nostra procedura prevista una significativa diminuzione del tempo (circa il 10% di manuale analisi) richiesto per vetrino pur essendo precisione di ± 4% 25
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una guida rapida, affidabile, facile da indipendente quantificazione automatica fibra muscolare nei muscoli interi di ratto utilizzando una piattaforma open source. Inoltre, si descrivono i potenziali modifiche che avrebbero permesso il suo utilizzo per altri campioni, come topi o muscoli umani.
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Protocol
Tutte le procedure tra soggetti animali sono state condotte nel rispetto dei principi di cura degli animali da laboratorio, come raccomandato dal FELASA 26. Soddisfazione è stata ottenuta prima dello studio da parte del comitato di revisione istituzionale della Medical University di Vienna e dal Ministero austriaco per la ricerca e la scienza (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numero di riferimento: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).
1. muscolare Harvest
NOTA: una precedente pubblicazione da Meng et al. 27 è disponibile che descrive il corretto congelamento dei campioni di muscolo in grande dettaglio.
- Ottenere interi muscoli o tessuto sufficiente per acquisire intere sezioni trasversali immediatamente dopo eutanasia degli animali.
- Rimuovere l'intero muscolo da un topo anestetizzato o di eutanasia. Rimuovere tutti i tessuti connettivi e tendini che circondano il muscolo con pinze e forbici. Per unnesthesia o l'eutanasia, seguono le linee guida internazionali di FELASA 28.
- Pesare il muscolo utilizzando una bilancia di precisione calibrata. Questo rapido passaggio consente analisi comparative tra i campioni di muscolo, soprattutto dopo procedure interventistiche.
- Mettere muscolo in un recipiente, riempito completamente con OCT, a seconda delle dimensioni del muscolo con un margine di sicurezza di circa 1 mm a tutti i lati (per esempio, in alluminio).
- Congelare in circa 2 min preraffreddati isopentano con azoto liquido. L'isopentano deve iniziare a mostrare cristalli bianchi sul fondo del contenitore.
NOTA: Questo passaggio è essenziale per preservare il corretto architettura del muscolo e quindi permette la colorazione corretta e fibra analisi 27. - Conservare i campioni conservati in OCT per almeno 24 ore a -80 ° C. I campioni possono, tuttavia, essere conservati a -80 ° C per diversi mesi o addirittura anni, se corri raffreddato ctly.
- Tagliare 10 sezioni micron trasversali dalla porzione mediana del muscolo a -20 ° C usando un cryotome. Se il taglio a 10 um, non è fattibile, aumentare lo spessore a passi di 2 um fino a un massimo di 20 um. Sufficientemente lame taglienti sono essenziali per questa fase.
- Applicare le sezioni alle diapositive adesive mediante l'armonizzazione delle diapositive per le sezioni trasversali. Le sezioni trasversali si attaccano automaticamente alle diapositive adesive. Conservare i vetrini a -20 ° C per una notte prima della colorazione.
2. colorazione
NOTA: Un gran numero di anticorpi contro le proteine miosina catena pesante sono disponibili; tuttavia, anticorpi ad alta qualità sono essenziali per l'acquisizione e analisi automatizzata. Per diluizioni e riferimento agli anticorpi, si veda la Tabella 1. Per un file foglio di calcolo per calcolare le diluizioni corrette e vedere il numero di quantità soluzione richiesta, vederesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental file 1.
- Scongelare e aria asciugare le sezioni muscolari congelati per 10 minuti prima che la procedura di colorazione.
- Lavare i vetrini accuratamente con tampone fosfato salino (PBS) + 0,05% Triton X per 10 minuti e poi per 5 min. Triton ha dimostrato di migliorare significativamente la qualità della colorazione. Vedi la discussione per ulteriori dettagli.
- Let sezioni asciugare per 2 minuti e contorno sezioni individuali di ciascun vetrino con una penna idrofobo (per minimizzare quantità di anticorpo) e consentire asciugatura addizionale per 15 min.
- Bloccare tutti i vetrini con PBS + 0,05% Triton X (PBST) contenente 10% siero di capra per 1 ora a temperatura ambiente.
- Diluire tutti gli anticorpi primari (Tabella 1) in un cocktail di PBS + 0,05% Triton X (PBST) contenente 10% siero di capra. Mescolare sufficientemente prima dell'applicazione. Triton X è essenziale per la colorazione uguale di tutto sezioni trasversali. Calcolarecirca 30 microlitri di primaria cocktail di anticorpi per sezione trasversale.
- Per la procedura 2.7-2.13 garantire una sufficiente protezione dalla luce. luci della stanza in grigio e vaschette di colorazione coperti forniscono una protezione adeguata. Inoltre, riempire il vassoio colorazione con fluido in basso per fornire un ambiente umido durante la colorazione e prevenire l'essiccazione.
- Applicare anticorpo primario (Tabella 1) cocktail per i vetrini per 1 h in un vassoio di colorazione umido della temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini con PBS + 0,05% Triton X per 10 minuti e poi con nuovo PBST per 5 min.
- Diluire anticorpi secondari in un cocktail di PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% siero di capra. Calcolare 30 ml di primaria cocktail di anticorpi per sezione trasversale.
- Applicare cocktail anticorpo secondario per i vetrini per 1 h.
- Lavare i vetrini con PBS + 0,05% Triton X (PBST) per 10 min e con PBST nuovo per altri 5 minuti.
- Applicare un kit di colorazione nucleare DAPI (preferibilmente lettura da usare soluzioni) foR 15 minuti o secondo le istruzioni del produttore per macchiare nuclei delle cellule.
- Lavare i vetrini brevemente con PBS + 0,05% Triton X (PBST) per 1 min. In seguito, i vetrini lasciare brevemente asciugare.
- Applicare fluorescente mezzo di montaggio e vetrini. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce ed eseguire l'imaging ottimale entro 24-48 ore.
3. Microscopia
- Carico scivola in scanner per diapositive. Un massimo di 12 vetrini è fattibile seconda dello scanner diapositiva.
- Avviare un nuovo progetto. Per anteprima impostare il canale DAPI e la lente 2.5X. Per l'analisi dettagliata utilizzare DAPI, GFP, FITC e Cy5 canali e l'obiettivo 20X. Messa a fuoco automatica è acquisita durante il progetto nel canale DAPI.
- Utilizzare i seguenti colori per ogni canale: DAPI -blu, FITC: verde, Texas Red: rosso, Cy5: giallo.
- Creare le anteprime di ogni diapositiva usando il canale DAPI. A tal fine, si applicano messa a fuoco manuale sul primo campione e usarlo per tutto il previewanalisi di acquisire immagini di anteprima di ogni esemplare.
- Outline ogni sezione che dovrebbe essere incluso per il processo di acquisizione dettagliata. Non disegnare delinea vicino ai bordi del campione, al fine di garantire caption di tutta l'area di interesse.
- Impostare i tempi di esposizione per ogni canale. Nella maggior parte dei casi, i parametri di esposizione dei diversi canali sono identici per tutte le sezioni.
- Eseguire acquisizione automatica delle immagini. Verificare la corretta acquisizione per il primo campo di punti di vista, per prevenire l'acquisizione non corretta nelle prime fasi del processo automatizzato.
- Se necessario, stabilire il controllo del desktop remoto tramite il mirroring del software. Ciò consente il monitoraggio a distanza del processo di acquisizione dell'immagine mirroring lo schermo del computer dello scanner diapositiva a un altro computer tramite qualsiasi connessione di rete o internet. Anche se, non è possibile apportare modifiche alla configurazione fisica relativi alle slide utilizzate, l'ambiente virtuale del software di acquisizione immagini permette di monitorare la corretta messa a fuoco o di tempi di esposizione delle immagini. Inoltre, il tempo stimato per il completamento può essere controllata regolarmente.
- Dopo il completamento dell'acquisizione dell'immagine, controllare la corretta messa a fuoco automatica di tutte le immagini controllando manualmente se l'architettura fibra, singole fibre ei vari tipi di fibra sono distinguibili.
- Riacquistare erroneamente focalizzata aree dell'immagine per i singoli campi di vista o di intere aree di interesse. Per riacquisizione di singole aree, indicare le zone o le immagini in tutto l'intero progetto e riacquistare le aree con messa a fuoco manuale. Nella maggior parte dei casi, un dettaglio ulteriore un'immagine in un livello obiettivo diverso conduce alle immagini sfocate
- Per ogni sezione trasversale che dovrebbe essere incluso nelle analisi finali, esportare ogni canale (escludendo DAPI) separatamente come file jpeg. Nome e ordinare i file in base ai canali esposti in cartelle denominate Texas Red, FITC e Cy5.
4. Analisi automatizzata fibra
tenda "> NOTA: La macro può essere ottenuto dalla seguente pagina web: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- Anteprima ogni immagine utilizzando un software di elaborazione immagini convenzionale prima analisi e verificare sufficiente contrasto tra fibre colorate e sfondo. Se necessario, regolare il contrasto e luminosità per aumentare la differenza, utilizzando i comandi di luminosità e regolazione contrasto.
- Aprire ImageJ o Fiji. Aprire la macro utilizzando il comando "Plugins - Macro - Modifica." Questo dimostra il codice sorgente e le macro permette rapido adattamento di parametri. Se necessario, cambiare la directory della cartella per ogni canale nel codice sorgente della macro.
NOTA: I valori per le analisi delle fibre muscolari si basano su bicipiti e muscoli di ratto lombricali, altre specie o muscoli possono richiedere valori diversi. - Utilizzare il comando "run" per avviare la macro. Tutte le immagini della cartella sono ora caricati nel macro e quantificate in ordine consecutivo. I risultati sono shown in una nuova finestra. Questa fase può durare da secondi a diverse ore, a seconda della quantità di dati analizzati.
- Esportare la finestra dei risultati come file di foglio di calcolo. Identificare i valori per conteggiato positivamente Cy5 (lento), FITC (intermedio) e Texas Red fibre (veloce) e riassumere per numero totale di fibre.
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Representative Results
Intero ratto muscolari sezioni sono state colorate rapidamente utilizzando l'immunoistochimica per identificare MHC I, IIA e IIB fibre muscolari. Utilizzando uno scanner vetrino da microscopio a fluorescenza, intere sezioni sono state poi acquisiti automaticamente per fibra muscolare automatizzata analisi con ImageJ. Il concetto del procedimento si basa sulla fornitura di un flusso di lavoro semplice, affidabile e in tempi rapidi per la quantificazione delle fibre muscolari.
Flusso di lavoro del procedimento (figura 1) inizia con la rimozione corretta e congelamento dei campioni di muscolo, come precedentemente descritto in una precedente tutorial da Meng et al. 27. Ciò è essenziale per un'adeguata qualità della colorazione. Nella fase successiva, i campioni di muscolo vengono tagliate e colorate usando anticorpi primari contro miosina pesante classe proteine di catene I, IIA e IIB e appropriati anticorpi fluorescenti secondari. Per ottimale staining qualità, le concentrazioni raccomandate dal produttore per gli anticorpi secondari sono stati raddoppiati e Triton X utilizzati per i cocktail di anticorpi per fornire anche la qualità della colorazione. L'immunofluorescenza delle fibre muscolari è veloce con minore reattività crociata e può essere realizzato in circa 5 ore per lotti fino a 26 vetrini nella nostra configurazione. Immagini risultanti hanno mostrato forte contrasto tra fibre positive e il tessuto circostante ed una forte distinzione tra diversi tipi di fibra (Figura 2). Successivamente, acquisizione delle immagini viene eseguita utilizzando uno scanner diapositiva che consente la scansione automatica di intere sezioni trasversali muscolare. Qui, fino a 12 vetrini vengono analizzati automaticamente, ad esempio, durante la notte. Con ciò, immagini panoramica delle sezioni trasversali sono realizzati in grande dettaglio con una risoluzione che permette l'ispezione della morfologia singola fibra (Figura 2).
Nella fase finale, i singoli canali of ciascuna sezione trasversale è esportato per la quantificazione delle popolazioni fibre muscolari utilizzando una macro specificamente progettato per ImageJ. L'analisi automatica dura circa 5-10 minuti per una sezione trasversale bicipite ratto contenente tra 3,000-6,000 fibre, mentre le analisi manuali preso circa 60 min 25. analisi automatiche dipendono fortemente potenza della dimensione del file stazione di lavoro e di calcolo. Come precedentemente indicato, la macro può rilevare popolazioni fibre muscolari relativi con una precisione di ± 4% rispetto all'analisi manuale (Figura 3). conte assolute complessive sono maggiori rispetto al manuale analisi, tuttavia, conteggi relativi rimaste simili in un intervallo ± 4%, come precedentemente indicato.
Figura 1: Flusso di lavoro della fibra muscolare Quantificazione protocollo. In primo luogo, i campioni muscolari sono ottenuti dallaanimali e congelati in modo corretto (vedi video JoVE da Meng et al. 27). Poi tagliare muscolari sezioni trasversali e condurre colorazione immunitario. Acquisire immagini di sezioni colorate utilizzando uno scanner scivolo per modalità intere immagini sezioni trasversali. Eseguire la macro quantificazione per ImageJ per le analisi popolazione fibra muscolare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rat muscolo bicipite Sezione trasversale. Panoramica di un ratto bicipite muscolare sezione trasversale macchiata: La sezione mostra lenti fibre MHC in giallo, intermedi fibre MHC IIA in fibre MHC IIB verdi e veloci in rosso. Fare clic qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.
Figura 3: Fibra muscolare analisi Risultati del Rat Sezione trasversale nella Figura 2. Analisi dei muscoli MHC I, fibre MHC IIA e IIB MHC. Top: I conteggi assoluti di fibre muscolari di conteggio manuale o automatico. Medio: porzioni relativi delle fibre muscolari popolazioni dopo la quantificazione manuale. Bottom: porzioni relative delle fibre muscolari popolazioni dopo quantificazione assoluta. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: colorazione immunoistochimica di fibre MHC. Descrizione di anticorpi primari e secondari compresi diluizioni utilizzati per le scontenenti procedura. (Modificata da Bergmeister et al. 25)
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Discussion
Qui, dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare e quantificare le popolazioni di fibre muscolari di sezioni trasversali di ratto mediante immunoistochimica in modo efficiente tempo automaticamente. Per la riproducibilità, presentiamo un passo dettagliate descrizione passo e potenziali modifiche per applicazioni in altre specie non descritte in questo studio. Inoltre, si discute i vantaggi del procedimento, prerequisiti per la funzione ottimale e suoi limiti.
Attualmente, un certo numero di metodi di colorazione esistono per identificare popolazioni di fibre muscolari e un certo numero di metodi sono stati descritti per la quantificazione manuale o semi-automatico delle fibre muscolari 17. Tuttavia, non esistono protocolli che combinano entrambi e descrivono un approccio standardizzato per macchiare affidabile popolazioni fibre muscolari ed automaticamente acquisire e quantificare fibre muscolari, utilizzando liberamente disponibili analisi software. Sulla base di precedenti pubblicazioni"> 24, 29, abbiamo ottimizzato catena pesante procedure colorazione immunoistochimica miosina esistente per analisi automatizzata delle popolazioni di fibre in muscolari murine sezioni trasversali. In tal modo, abbiamo recentemente dimostrato che l'analisi automatizzata di sezioni trasversali integrali è fattibile, affidabile rispetto alle analisi manuale, e più tempo efficiente 27. Inoltre, il metodo è indipendenti dall'utente riducendo errore umano e fornendo così un confronto obiettivo come ad esempio tra i diversi gruppi di trattamento.
L'intero protocollo si basa sul fornire immagini dettagliate e di alta qualità di intere sezioni trasversali per il processo di quantificazione automatizzato. ImageJ come software open source fornisce una serie di comandi potente ma semplice, che disposti in una macro permettono l'identificazione delle fibre muscolari. Tuttavia, differenze di qualità all'interno o tra necessità sezione trasversale di minimizzare per ottenere risultati affidabili. Abbiamo identified alcuni passaggi critici che sono essenziali per raggiungere la qualità richiesta. Ciò include l'uso di anticorpi primari ottimali. Analogamente, l'uso di appropriati anticorpi secondari forniscono segnali fluorescenti distinti era essenziale, e abbiamo raddoppiato concentrazioni per una migliore qualità del segnale. Inoltre, abbiamo osservato una maggiore qualità e più uniforme colorazione con l'uso di Triton X nei cocktail di anticorpi. È importante sottolineare che questo non è stato osservato con l'uso di Tween invece. Immagini di qualità non ottimale colorazione sono stati regolati manualmente per un migliore contrasto per consentire l'acquisizione automatica dell'immagine. Più importante per il processo di acquisizione è stato il corretto funzionamento del sistema di messa a fuoco automatica. A questo scopo, abbiamo utilizzato un DAPI-kit per colorare i nuclei cellulari di cellule satelliti, che ha fornito un punto di riferimento affidabile per il sistema autofocus.
Per il processo ImageJ quantificazione, valori ottimali sono stati determinati confrontando manuale ai risultati automatizzati e consecutiva fine-tuning dei parametri 25: Threshold e analizzare particelle. I valori risultanti erano sufficienti per bicipite e muscoli lombricali e quindi potenzialmente altri muscoli di ratto. Inoltre, Bloemberg et al. 24 hanno dimostrato che la colorazione è applicabile per altre specie, come gli esseri umani o topi. Pertanto, l'intero protocollo può teoricamente essere adattato per l'uso in altre specie, ma sarebbe tuttavia, richiedono identificazione dei parametri necessari. I comandi rilevanti sono evidenziate nel codice sorgente.
Ulteriori eventuali modifiche della procedura comprendono la configurazione dello scanner di diapositive. Nella nostra messa a punto, abbiamo utilizzato un sistema di scanner per diapositive, con un obiettivo 2.5X per la lente 20X di anteprima e per l'acquisizione vera e propria. Mentre cambiare la lente per il processo di anteprima fornirà alcun beneficio significativo in termini di qualità o la velocità, l'acquisizione può anche essere condotta utilizzando un obiettivo 10X per aumentare la velocità (e consequently diminuire la risoluzione) o invece un obiettivo 40X per aumentare la risoluzione e di conseguenza il tempo di acquisizione. Come è mostrato in figura 2, l'aumento della risoluzione è più probabile non necessario per i muscoli di ratto ma può essere considerato per altre specie. Altre modifiche che sono adatti in questa configurazione sono di colorazione per fibre MHC-IIX o laminina per visualizzare matrice extracellulare del muscolo. Tali modifiche, tuttavia, richiedono di modificare la configurazione di acquisizione per due riflettori supplementari (per esempio Cy7) e modificando la macro ImageJ includere ulteriori analisi con i parametri corretti per il codice di script.
Una limitazione di questa tecnica è che i conteggi fibra assoluti erano significativamente superiori rispetto ai conteggi manuali in una precedente analisi, anche se i conteggi relativi rimaste simile 25. Questo è probabilmente il risultato della separazione insufficiente e quindi ripetuta la quantificazione delle fibre. Questo effettoè più presente in fibre che sono adeguatamente tinto o mostrano altri tipi di manufatti. Tuttavia, il numero di conteggi fibra relativi e quindi popolazioni fibre rimasta altamente accurata. Rispetto alla pratica comune di quantificare una sotto-porzione definita di una sezione trasversale, ad esempio il 40%, riteniamo che le analisi dell'intera sezione trasversale dal ImageJ sono più precisi a causa dell'architettura fibra muscolare eterogenico (Figura 2) . Un potenziale limitazione della procedura è l'obbligo di utilizzare costosi scanner per diapositive per l'acquisizione automatica di tutta la sezione trasversale, che non sono generalmente disponibili. Un approccio alternativo è quello di acquisire singolo campo di punti di vista e quantificare singolarmente dalla macro.
In conclusione, crediamo che questo protocollo è ampiamente accessibile e permette la quantificazione veloce e affidabile di tutta muscolari sezioni trasversali utilizzando liberamente disponibili le analisi del software. Pertanto, la procedura introdottafornisce un contributo utile alle analisi della morfologia delle fibre muscolari.
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Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Christian Doppler Research. Vorremmo ringraziare Sabine Rauscher dal Nucleo strumento Imaging presso l'Università di Medicina di Vienna, Austria per il supporto durante tutto il progetto. Gli anticorpi primari sono stati sviluppati da Schiaffino, S., ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta a L'University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C.
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J.
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J.
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
