Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.

Abstract

Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) zijn veel gebruikt als een in vitro model in neuroscience en neuropharmacology onderzoek. Het co-bestaan ​​van gliale cellen en neuronen in CGN-cultuur kan echter leiden tot vooroordelen bij de nauwkeurige beoordeling van neuronale levensvatbaarheid. Fluoresceendiacetaat (FDA) en Propidiumjodide (PI) dubbele kleuring is gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten door de levensvatbare en dode cellen tegelijkertijd te evalueren. We hebben FDA-PI dubbele kleuring gebruikt om de gevoeligheden van de colorimetrische analyses te verbeteren en neuronale levensvatbaarheid in CGN's te evalueren. Verder voegde we blauwe fluorescerende DNA vlekken toe (bijvoorbeeld Hoechst) om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe de nauwkeurigheid van de beoordeling van neuronale levensvatbaarheid kan verbeteren door gebruik te maken van deze methoden in de CGN-cultuur. Met behulp van dit protocol kan het aantal gliale cellen uitgesloten worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om de ongewenste gli te onderscheidenAlcellen van neuronen in verschillende gemengde celculturen, zoals primaire corticale cultuur en hippocampale cultuur.

Introduction

Colorimetrische cytotoxiciteitsbepalingen, zoals de 3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide (MTT) -assay, worden gewoonlijk gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen in vitro te meten. Primaire gekweekte Cerebellar Granule Neuronen (CGN's) van ratten zijn gevoelig voor verschillende neurotoxinen, waaronder 1-methyl-4-fenylpyridinium-ion, waterstofperoxide en glutamaat 1 , 2 . Daarom kunnen CGN culturen gebruikt worden als een in vitro model op het gebied van neurowetenschappen. CGN-culturen kunnen een verscheidenheid aan cellen bevatten, waaronder neuronen en gliale cellen, die ongeveer 1% van de totale cellen in de CGN-cultuur kunnen uitmaken. Glialcellen reageren echter verschillend op neurotoxinen in vergelijking met neuronen, wat leidt tot een vooroordeel in de neuronale levensvatbaarheid gemeten door colorimetrische analyses 3 .

In levensvatbare cellen kan fluoresceendiacetaat (FDA) omgezet worden in fluoresceïne door esterase.Propidiumjodide (PI) kan interageren met het DNA na het binnendringen van dode cellen en kan gebruikt worden om apoptose binnen de cultuur aan te geven. Daarom kan FDA-PI dubbele kleuring tegelijkertijd levensvatbare cellen en dode cellen evalueren, wat suggereert dat de cellevendigheid nauwkeuriger kan worden gemeten door beide colorimetrische methoden te combineren. Bovendien, door Hoechst toe te voegen, een blauwe fluorescerende vlek voor kernen, zou de nauwkeurigheid van de cellevendigheid verder kunnen worden verbeterd. Het hier beschreven protocol beschrijft FDA-PI dubbele kleuring en FDA-PI-Hoechst triple staining, die gebruikt kan worden om de neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te analyseren in primaire gekweekte CGN's.

Dit protocol profiteert van het visualiseren en onderscheiden van CGNs en glialcellen door hun verschillende maten en vormen. Na kleuring worden de aantallen levensvatbare neuronen en dode neuronen geteld uit representatieve beelden die worden genomen door fluorescerende microscopie. De grote gliale cellen worden uitgesloten door de vergelijking van typische CGNs tAken onder fluorescerende modus met die welke onder fase contrast modus zijn genomen. Een soortgelijke strategie kan worden uitgevoerd om neuronale levensvatbaarheid in gemengde celculturen te meten die neuronen en gliale cellen bevatten, zoals primaire corticale culturen en hippocampale culturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures volgden de National Institutes of Health (NIH) Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren (NIH Publicaties nr. 80-23, herzien 1996) en werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) aan de universiteit van Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. Bereiding van oplossingen en cultuurmedia

Opmerking: Reagenten en voorraden moeten onder steriele omstandigheden worden bereid. Steriliseer door te filteren met behulp van een filter met een poriegrootte van 0,22 μm.

  1. Bereid Poly-L-Lysine (PLL) voorraadoplossing door 5 mg PLL toe te voegen aan 10 ml dubbel gedestilleerd water (ddH 2 O). Steriliseren door te filteren. Aliquot en sla de PLL voorraadoplossing bij -20 ° C gedurende enkele maanden op.
  2. Bereid Krebs-buffer door 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH2P04, 2,6 g D-glucose en 5,94 g 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur toe te voegen aan 100 ml DdH 2 </ Sub> O. Steriliseren door te filteren. Bewaar de Krebs-bufferoplossing bij maximaal een maand bij 4 ° C.
  3. Bereid 3.82% Mg 2 SO 4 oplossing door 3,82 g Mg 2 SO 4 aan 100 ml ddH 2 O toe te voegen. Steriliseren door te filtreren. Bewaar de Mg 2 SO 4 oplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
  4. Bereid 1,2% CaCl2 oplossing op door 1,2 g CaCl2 toe te voegen aan 100 ml ddH20. Steriliseer door te filtreren. Bewaar de CaCl2 oplossing bij 4 ° C gedurende meerdere maanden.
  5. Bereid 2M KCl-oplossing door 15 g KCl toe te voegen aan 100 ml ddH 2 O. Steriliseer door te filtreren. Bewaar de KCl-oplossing gedurende 4 maanden bij 4 ° C.
  6. Bereid de D-glucose voorraadoplossing door 1,8 g D-glucose toe te voegen tot 100 ml ddH 2 O. Steriliseer door te filtreren. Aliquot en sla de D-glucose oplossing op bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.
  7. Bereid Cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C) voorraadoplossingIon door 0,24 g Ara-C toe te voegen aan 10 ml ddH20. Steriliseren door te filtreren. Aliquot en sla de Ara-C voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden op.
  8. Bereid 250 ml kweekmedium (voor 25-30 pups) met 25 ml Fetal Bovine Serum (FBS), 2,5 ml 100x glutamine, 2,78 ml 2M KCl oplossing en 2,5 ml 100x antibiotica in Basal Medium Eagle (BME) . Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
  9. Bereid 25K medium op met 2,5 ml 100x glutamine, 2,78 ml 2M KCl oplossing en 2,5 ml 100x antibiotica in BME. Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
  10. Bereid 5K medium op met 2,5 ml 100x glutamine en 2,5 ml 100X antibiotica in BME. Stel het volume in op 250 ml en steriliseer door te filtreren.
    OPMERKING: Het kweekmedium, 25K medium en 5K medium moet vers bereid worden
  11. Bereid FDA voorraadoplossing door 5 mg FDA toe te voegen aan 1 ml aceton. Bewaar de FDA-voorraadoplossing bij 4 ° C voor langdurige opslag. </ Li>
  12. Bereid PI-voorraadoplossing door 1 mg PI aan 1 ml ddH 2 O toe te voegen. Bewaar de PI-voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
  13. Bereid Hoechst voorraadoplossing door 5 mg Hoechst 33342 toe te voegen aan 1 ml ddH 2 O. Bewaar de Hoechst voorraadoplossing bij 4 ° C gedurende enkele maanden.

2. Bereiding van Dissectie Oplossingen

OPMERKING: Doe dit 1 d voor de dissectie.

  1. Bereid de dissectieoplossing door 15 ml Krebs-buffer, 1,2 ml 3,82% Mg2SO4-oplossing en 0,45 g Bovine Serumalbumine (BSA) toe te voegen aan 150 ml ddH20. Pas de pH aan op 7,4 met behulp van NaOH.
  2. Label 5 x 50 ml buizen als volgt: 1, 2, 3, 4 en 5.
  3. Plaats 40 ml dissectieoplossing in een 50 ml spuit met een filter. Filter 30 ml dissectieoplossing in buis 1 en 2 ml elk tot meerdere 35 mm celcultuurschotels, die gebruikt worden om weefsels te verwerken.
  4. Naar tUbe 2, voeg 12,5 mg trypsine in 50 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  5. Aan buis 3, voeg 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg sojaboon-trypsine-inhibitor en 150 μl van 3,82% Mg2S04-oplossing in 15 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  6. Voeg bij buis 4 5 ml van de oplossing uit buis 3. Voeg 10,5 ml dissectieoplossing toe. Steriliseren door te filteren.
  7. Aan buis 5, voeg 100 μl van 3,82% Mg2S04-oplossing en 15 μl van 1,2% CaCl2-oplossing in 12,5 ml dissectieoplossing toe. Meng volledig door vortexing. Steriliseren door te filteren.
  8. Bewaar alle buizen bij 4 ° C voor gebruik.

3. Coating van de celcultuurplaten

OPMERKING: Doe dit 1 d voor de dissectie.

  1. Voeg 1 ml PLL voorraadoplossing toe aan 100 ml ddH 2 O (eindconcentratie: 5 μg / ml). Coat plastic6-putjes of 12-putjes celcultuurplaten (2 ml per putje voor 6-putjescelcultuurplaten of 1 ml per putje voor 12-cellencultuurplaten) door 5 μg / ml poly-L-lysineoplossing toe te voegen.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 dag (of bij 37 ° C gedurende 2 uur). 1-2 uur voor de dissectie, verwijder de oplossing met een pipet. Was eens met ddH20 en droog in de celkweekkap.

4. Verwerking van weefsels voor 8 dagen oude Sprague-Dawley-ratten.

  1. Zet een 100 mm schotel op ijs. Decapiteer de ratpups in het gerecht met een paar gesteriliseerde scharen.
  2. Steek de schaar in de foramen magnum en snijd de twee kanten van de schedel, van de oren naar de ogen. Til de schedel op met een paar tang. Zorg ervoor dat de hele hersenen in de schedel zijn. Isoleer het cerebellum en zet het in de bovenstaande 35 mm schaal met een paar tang.
  3. Werk onder een dissectiemicroscoop. Verwijder de meninges en bloedvaten met twee paar tang.
  4. Knip de weefsels met een mes. Zet de weefsels in buis 1. Centrifuge gedurende 5 minuten bij RT en 1.500 x g.
  5. Aspirateer de supernatant. Bewaar de pellet.
  6. Voeg de oplossing in buis 2 toe aan de pellet. Resuspendeer door zachtjes te schudden.
  7. Plaats de buis in een waterbad van 37 ° C gedurende 15 minuten. Schud elke 3 minuten voorzichtig.
  8. Voeg de oplossing in buis 4 toe aan deze oplossing. Schud en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT en 1500 x g.
  9. Aspirateer de supernatant. Bewaar de pellet.
  10. Voeg de oplossing in buis 3 toe om de pellet te resuspenderen.
  11. Bereid twee 15 ml buizen. Plaats de helft van de cellen in elke buis. Pipet omhoog en omlaag 60-70x met een katoenen plug Pasteur pipette om de cellen te homogeniseren.
  12. Voeg 3 ml van de oplossing in buis 5 toe aan elke 15 ml buis. Laat ze 10 minuten bij kamertemperatuur zitten en verwijder de supernatant zorgvuldig met een Pasteur-pipet met katoen. Plaats de supernatant in nieuwe 15 ml buizen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT en 1500 x g.
  13. EENSpiraal het supernatant. Bewaar de pellet.
  14. Voeg kweekmedium in de pellet om een ​​celdichtheid van ongeveer 1,5 x 106 cellen / ml (ongeveer 100 ml voor 10 pups) te krijgen.
  15. Zet de cellen in cultuurplaten en kweek ze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.

5. Toevoeging van Ara-C en D-glucose tijdens de cultuur

  1. Na 24 uur voeg Ara-C voorraadoplossing toe (10 μl / putje voor 12-cellencelcultuurplaten of 20 μl / putje voor 6-cellencelcultuurplaten; eindconcentratie: 1 mM) om de groei van de glialcellen te remmen.
  2. Op dag 7 voeg 50 μL D-glucose voorraadoplossing per put toe voor 12-cellencultuurcultuurplaten of 100 μl per putje voor 6-putjescelcultuurplaten zodat de uiteindelijke concentratie 1 mM is.

6. FDA-PI Double Staining en FDA-PI-Hoechst Triple Staining in CGN Culture

  1. Bereid FDA-PI werkoplossing door 20 μL FDA voorraadoplossing toe te voegen (Eindconcentratie: 10 μg / ml) en 50 μl PI-stamoplossing (eindconcentratie: 50 μg / ml) in 10 ml PBS. Meng door vortexing en plaats dit op ijs.
    1. Voor de FDA-PI-Hoechst werkoplossing voegt u 20 μL FDA-voorraadoplossing toe (eindconcentratie: 10 μg / ml), 50 μl PI-voorraadoplossing (eindconcentratie: 50 μg / ml) en 10 μl Hoechst voorraadoplossing (Uiteindelijke concentratie: 5 μg / ml) in 10 ml PBS. Meng door vortexing en plaats dit op ijs.
      OPMERKING: Verspreid de FDA-PI werkoplossing en FDA-PI-Hoechst werkoplossing voor het gebruik.
  2. Neem de celkweekplaat uit de incubator. Zet het op ijs.
  3. Aspireer het kweekmedium en vervang het met koude PBS.
    OPMERKING: De oplossing moet langzaam en zorgvuldig worden uitgevoerd. Vermijd het aanraken van de cellen met pipet tips.
  4. Aspireer de koude PBS en vervang deze met koude FDA-PI of FDA-PI-Hoechst werkoplossing (500 μl / weLl voor 12-cellencelcultuurplaten of 1 ml / putje voor 6-putjescelcultuurplaten). Laat het ijs voor 5 minuten.
  5. Aspireer de FDA-PI of FDA-PI-Hoechst werkoplossing en voeg koude PBS (100 μL / putje toe voor 12-cellencelcultuurplaten of 50 μl / putje voor 6-cellencelcultuurplaten).
    OPMERKING: Cellen mogen niet drogen bij het maken van afbeeldingen.
  6. Neem afbeeldingen met behulp van fluorescerende microscopie. Gebruik een excitatiefilter met een pasband van 450 - 490 nm. Ontdek de fluorescentie emissies voor respectievelijk FDA, PI en Hoechst bij respectievelijk 520, 620 en 460 nm. Onder dezelfde omstandigheden, neem een ​​afbeelding onder normaal licht met behulp van de fase contrast modus van fluorescerende microscopie.
    OPMERKING: Neem beelden binnen 15 minuten na FDA-PI of FDA-PI-Hoechst-kleuring. De belichtingstijd bedraagt ​​100-300 ms en de analoge winst is 2,8x.

7. Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid

  1. Voor FDA-PI dubbele kleuring, overlay de beelden van de cellen gedetecteerd na het filterenDoor verschillende fluorescentiefilters door de FDA-positieve laag op de PI-positieve laag in een grafische editorsoftware te slepen.
    1. Pas de dekking van de FDA-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van het "Lagen" paneel in te voeren. Voeg twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken. Stel het contrast van de overlaybeelden in door "50" in het veld "Contrast" in te voeren onder "Afbeelding" | "Aanpassingen" | "Helderheids contrast." Zorg ervoor dat er geen FDA en PI dubbel positieve cellen in de overlaybeelden zijn.
  2. Voor FDA-PI-Hoechst triple-kleuring, overlay de beelden van de cellen die zijn vastgesteld na het filteren van verschillende fluorescentiefilters door de FDA-positieve laag op de PI-positieve laag in een grafische editorsoftware te slepen. Pas de opaciteit van de FDA-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van de "Layers & #"34; paneel.
    1. Voeg twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken. Sleep de Hoechst-positieve laag op de samengevoegde laag. Pas de opaciteit van de Hoechst-positieve laag aan door "50%" in het veld "Opaciteit" van het "Lagen" paneel in te voeren. Voeg de twee lagen samen door op de knop "Merge Visible" in het menu "Layer" te klikken.
  3. Visueel onderscheid grote, onregelmatige glialcellen van CGNs door de beelden die onder de fluorescentiemodus zijn genomen te vergelijken met die welke onder fase contrastmodus zijn genomen - cellen met een diameter van drie keer groter dan CGNs worden beschouwd als glialcellen en dienen uitgesloten te worden.
  4. Tel het aantal respectievelijke levensvatbare neuronen en dode neuronen, met behulp van een celteller plugin in een beeldverwerkingsprogramma ( bijv. ImageJ) 4 .
    1. Voor dubbele kleuring van FDA-PI markeer handmatig kleine FDA-positieve cellen alsLevensvatbare neuronen. Markeer PI-positieve cellen handmatig als dode neuronen. Voor FDA-PI-Hoechst triple staining, markeer kleine FDA- en Hoechst-dubbel-positieve cellen handmatig als levensvatbare neuronen. Markeer PI- en Hoechst-dubbel-positieve cellen handmatig als dode neuronen.
  5. Bereken het percentage neuronale levensvatbaarheid door gebruik te maken van de volgende vergelijking:% neuronale levensvatbaarheid = [aantal levensvatbare neuronen / (aantal dode neuronen + aantal levensvatbare neuronen)] x 100%. Kies voor elke put vijf willekeurige velden en gemiddelde het percentage neuronale levensvatbaarheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De dubbele immunostaining van GAP43 (rood) en GFAP (groen) werd gebruikt om de vorm van neuronen en gliale cellen, respectievelijk 2 , 5 te analyseren. Zowel neuronen als gliale cellen zijn aanwezig in CGN-cultuur. De GFAP-positieve glialcellen zijn groot en onregelmatig in vorm, zoals aangegeven door de pijlen in de afbeeldingen ( Figuur 1 ). Traditionele assays voor cel vitaliteit kunnen geen gliale cellen onderscheiden van neuronen wanneer ze gebruikt worden om neuronale levensvatbaarheid te meten. Daarom, FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring, die glialcellen van neuronen kunnen onderscheiden, zijn voordelig voor de nauwkeurige evaluatie van neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur.

De lage-kaliumuitdaging werd gebruikt om neuronale dood in een CGN-cultuur te induceren. De representatieve beelden tonen de CGN cultuur uitgedaagd met een kaliummedium (5K), normaal medium (25K) of origiNal medium, zoals geanalyseerd door FDA-PI dubbele kleuring ( Figuur 2A ) of FDA-PI-Hoechst triple staining ( Figuur 2B ). Neuronale levensvatbaarheid gemeten door verschillende methoden wordt weergegeven in Figuur 3 (gemiddelde ± SEM). De celviabiliteiten gemeten door FDA-PI dubbele kleuring in de 25K- en 5K-groepen van de controle waren respectievelijk 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% en 43,9 ± 8,6% ( Figuur 3A ). De celviabiliteiten gemeten door FDA-PI-Hoechst drievoudige kleuring in de controle-, 25K- en 5K-groepen waren respectievelijk 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% en 48,3 ± 4,4% ( Figuur 3B ). De celviabiliteiten gemeten door MTT-analyse in de controle-, 25K- en 5K-groepen waren respectievelijk 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% en 57,5 ​​± 5,7% ( Figuur 3C ). De percentages van lactische dehydrogenase (LDH) vrijgave in de controle, 25K en 5K groepen waren respectievelijk 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% en 202,1 ± 15,3% (respectievelijk 2 . De MTT-analyse beoordeelt de activiteit van NADPH-afhankelijke cellulaire oxidoreductase, die het aantal levensvatbare cellen 2 weerspiegelt. Deze methode kan echter geen gliale cellen onderscheiden van neuronen wanneer ze gebruikt worden om neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur te meten. Door het gebruik van FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring kan het aantal gliale cellen uitgesloten worden, en neuronale levensvatbaarheid kan nauwkeurig gemeten worden. Bovendien was de neuronale levensvatbaarheid in 5K mediumbehandelde CGN's gemeten door FDA-PI of FDA-PI-Hoechst-kleuring iets kleiner dan die gemeten door MTT-analyse. Dit zou kunnen zijn omdat de meeste glialcellen die niet gevoelig waren voor 5K medium geïnduceerde neurotoxiciteit, werden uitgesloten door FDA-PI of FDA-PI-Hoechst-kleuring, maar niet door de MTT-analyse.

Figuur 1
Figuur 1: Zowel kleine neuronen als grote, onregelmatige gliale cellen zijn aanwezig in CGN-cultuur. Op dag 8 in vitr o waren CGNs dubbel immunostained met respectievelijk GAP43 (rood) en GFAP (groen) voor neuronen en glialcellen. De fase contrast beelden tonen de morfologie van de cellen. Traditionele assays voor cel vitaliteit kunnen geen gliale cellen onderscheiden van neuronen wanneer ze gebruikt worden om neuronale levensvatbaarheid te meten. Daarom, FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring, die glialcellen van neuronen kunnen onderscheiden, zijn voordelig voor de nauwkeurige evaluatie van neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur. Schaalbalk: 100 μm. Blauwe pijl: typische neuronen; Witte pijl: typische gliale cellen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
FDA-PI Dubbele Verf en FDA-PI-Hoechst Triple Staining Demonstreer Lage Kaliumgeïnduceerde Neuronale Dood in CGN Cultuur. Op dag 8 in vitr o werden CGN culturen overgeschakeld naar 5K of 25K medium. Het medium in de controle culturen werd niet veranderd. Na 24 uur van de uitdaging werden de CGN culturen geanalyseerd door ( A ) FDA-PI dubbele kleuring of ( B ) FDA-PI-Hoechst triple staining. Schaalbalk = 100 μm. Pijl: typische gliale cellen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Kwantificering van neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur. Op dag 8 in vitr o werden CGN culturen overgeschakeld naar 5K of 25K medium. Het medium in de controlecultuurS is niet gewijzigd. Na 24 uur van de uitdaging werd de cellevensbaarheid geanalyseerd door ( A ) FDA-PI dubbele kleuring, ( B ) FDA-PI-Hoechst triple staining en ( C ) MTT assay. ( D ) De LDH-afgifte werd geanalyseerd door LDH-analyse. De gegevens worden uitgedrukt als de middelen ± SEM. ** p <0,01 versus controle (ANOVA, Tukey's test). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol werd gewijzigd van procedures die eerder zijn beschreven 6 , 7 . Onderzoekers hebben tijd aan het proberen om de niet-neuronale celgroei te verminderen door de voorwaarden te verbeteren bij het cultiveren van primaire neuronen in vitro 8 . Echter, zelfs bij verbeterde kweekomstandigheden blijven sommige gliale cellen. Bovendien zijn niet-neuronale cellen nodig in primaire neuronale culturen, omdat ze helpen bij neuronale groei en rijping 9 . In deze studie werd Ara-C gebruikt om de groei van gliale cellen te minimaliseren, hoewel er nog steeds ongeveer 1 tot 5% aanwezigheid van gliale cellen in de CGN-cultuur was. Dit probleem wordt ook voorgesteld in andere groepenstudies 10 . In de CGN-cultuur zijn de groottes en vormen van glialcellen grotendeels verschillend van neuronen. De diameter van CGN's is ongeveer 10 μm, en volwassen CGN's hebben rijke processen die de neuronen verbinden. HoweVer, de diameter van gliale cellen in de cultuur is relatief groot, ongeveer 30-100 μm, dus het is gemakkelijk om glialcellen van neuronen in beelden te onderscheiden. Daarom is een voordeel van FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring het nauwkeurig meten van neuronale levensvatbaarheid in primaire neuronale culturen waarin niet-neuronale celgroei niet door de cultietechnieken wordt voorkomen.

Lage kaliumgeïnduceerde apoptose in CGN-culturen, met 25K mediumbehandelde cellen als de controle, vertegenwoordigt een uitstekend model om neuronale apoptose te bestuderen. Veel groepen, waaronder ons laboratorium, hebben deze klassieke modelstudie gebruikt om de onderliggende apoptotische mechanismen van neuronen 2 , 11 . Daarom werd dit model gebruikt om neuronale dood te veroorzaken. De concentratie van kleurstoffen en de duur van de kleuring die in dit protocol gebruikt worden, zijn geoptimaliseerd. Lage concentraties kleurstoffen en korte duur van het vlek kunnen onvoldoende kleuring veroorzaken, wat leidt tot de onnauwkeurige coupéNting van dode neuronen. Hoge concentraties kleurstoffen en langdurige kleurperioden kunnen echter neuronale dood induceren en een vooroordeel veroorzaken bij de schatting van de cellevendigheid. Daarom moeten de afbeeldingen zo snel mogelijk na het toevoegen van de kleurstoffen worden genomen. In de FDA-PI dubbele kleuringbeelden worden kleine FDA-positieve cellen gemarkeerd als levensvatbare neuronen. Echter, cellichamen hebben de neiging om in de CGN-cultuur te groeperen. Daarom kan het moeilijk zijn om levensvatbare cellen door FDA-kleuring te scheiden. In deze studie werd Hoechst, een kernvlek gebruikt om de nauwkeurigheid te verbeteren. Kleine cellen met FDA-positieve cellichamen en Hoechst-positieve kernen kunnen worden beschouwd als levensvatbare neuronen in FDA-PI-Hoechst triple-kleurenbeelden.

Vergeleken met colorimetrische cytotoxiciteitsbepalingen vereisen FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring meer tijd voor de evaluatie van neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur. Daarom is het huidige protocol mogelijk niet geschikt om neuroprotectieve geneesmiddelen te screenen. Echter, deze beperkingKan worden opgelost door gebruik te maken van een beeldsysteem met hoge inhoud. Een andere beperking van deze techniek is dat CGN's en glialen niet door PI kunnen worden gediscrimineerd. Echter, omdat neuronen meer vatbaar zijn voor neurotoxinen dan glialcellen, zijn PI-positieve dode cellen hoofdzakelijk neuronen 12 .

Naast FDA, PI en Hoechst worden andere kleurstoffen, zoals MTT, SYTO13 en SYBR14, ook gebruikt om de levensvatbaarheid van de cel 13 , 14 te meten. Voor de MTT-analyse kunnen glialcellen die niet gevoelig zijn voor neurotoxinen MTT omzetten naar formazan, wat leidt tot de overschatting van neuronale levensvatbaarheid. SYTO13 is celdoorlatend en heeft een hoge groene fluorescerende opbrengst wanneer gebonden aan DNA of RNA. Een vorige studie suggereerde dat SYTO13-kleuring voornamelijk apoptotische cellen aangeeft in CGN-cultuur, maar onderscheidt geen gliale cellen van neuronen 13 . SYBR14 is een membraan-permanente nucleïnezuur kleurstof. SYBR14-PI dubbele kleuring is onsEd om de levensvatbaarheid van cellen te meten omdat beide kleurstoffen DNA labelen, waardoor de dubbelzinnigheid 14 wordt omzeild. Dubbele kleuring van SYBR14-PI kan echter niet gliacellen van neuronen in CGN-cultuur effectief onderscheiden. Daarom, FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring, die glialcellen van neuronen kunnen onderscheiden, zijn voordelig voor de nauwkeurige evaluatie van neuronale levensvatbaarheid in CGN-cultuur.

Ten slotte zijn FDA-PI en FDA-PI-Hoechst-kleuring niet beperkt tot de analyse van neuronale levensvatbaarheid in CGN-culturen. Veel gemengde celculturen (bijvoorbeeld primaire corticale culturen en primaire hippocampale culturen) bevatten ook neuronen en gliale cellen. Daarom kan een soortgelijke strategie toegepast worden op die gemengde celculturen om de neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Stichting Natuurwetenschappen van de provincie Zhejiang (LY15H310007), het toegepaste onderzoeksproject inzake non-profit technologie van de provincie Zhejiang (2016C37110), de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (U1503223, 81673407), de Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), het Ningbo Municipal Innovation Team van Life Science and Health (2015C110026), het Guangdong Provinciaal Internationaal Samenwerkingsproject van Wetenschap en Technologie (No. 2013B051000038), het Shenzhen Basic Research Programma (JCYJ20160331141459373), de Guangdong-Hong Kong Technology Co-operation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), de Onderzoeksraad van Hong Kong (15101014), de Hong Kong Polytechnische Universiteit (G-YBGQ) en het KC Wong Magna Fonds aan de Universiteit van Ningbo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

Neuroscience Cerebellar granule neuronen fluoresceendiacetaat propidiumjodide cellevendigheid glialcellen fluorescentiemicroscopie
Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter