Her beskriver vi en protokol til at vurdere antifungal aktivitet af primære humane immunceller i realtid under anvendelse af fluorescerende Aspergillus reporter konidier sammenholdt med live-cell video mikroskopi og flowcytometri. Genererede data give indsigt i værtens celle- Aspergillus interaktioner såsom fungicid aktivitet, fagocytose, cellevandring og hæmning af svampevækst.
Aspergillus fumigatus er et opportunistisk fungale patogen forårsager invasive infektioner hos immunkompromitterede værter med en høj case-dødeligheden. Forskning undersøger immunologiske responser mod A. fumigatus er blevet begrænset af manglen på konsekvente og pålidelige assays til måling af antifungale aktivitet af specifikke immunceller in vitro. En ny fremgangsmåde er beskrevet til at vurdere den antifungale aktivitet af primære monocytter og neutrofiler fra humane donorer mod A. fumigatus anvendelse af fluorescerende Aspergillus reporteren (FLARE) konidier. Disse konidier indeholder en genetisk kodet dsRed reporter, som udtrykkes konstitutivt i levende FLARE konidier, og er eksternt mærket med Alexa Fluor 633, som er resistente over for nedbrydning i fagolysosomet, således tillader en skelnen mellem levende og døde A. fumigatus konidier. Video mikroskopi og flowcytometri efterfølgende bruges til at visualisere interagereion mellem konidier og medfødte immunceller, vurdere fungicid virkning samtidig giver et væld af oplysninger om fagocyt migration, fagocytose og inhibering af svampevækst. Denne ny teknik har allerede givet spændende ny indsigt i vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus. Det er vigtigt at bemærke laboratoriet opsætning kræves for at udføre denne analyse, herunder den nødvendige mikroskopi og flowcytometri faciliteter, og evnen til at arbejde med humant donorblod og genetisk manipulerede svampe. Men dette assay er stand til at generere store mængder data og kan afsløre detaljerede indsigt i den antifungale respons. Denne protokol er med held blevet anvendt til at undersøge vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus.
Det er vigtigt at bemærke laboratoriet opsætning kræves for at udføre denne analyse, herunder den nødvendige mikroskopi og flowcytometri facilities, og evnen til at arbejde med humant donorblod og genetisk manipulerede svampe. Men dette assay er stand til at generere store mængder data og kan afsløre detaljerede indsigt i den antifungale respons. Denne protokol er med held blevet anvendt til at undersøge vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus.
Aspergillus fumigatus er et opportunistisk svampepatogen og de mest almindelige fungale årsag til invasive lungeinfektioner i immunokompromitterede vært 1, 2. Forstå, hvordan værten immunceller genkende og eliminere Aspergillus er et vigtigt område for svampe forskning, men de aktuelt tilgængelige svampedræbende analyser har væsentlige begrænsninger. Almindeligt anvendte metoder til måling af fungicid aktivitet, indbefatter kolorimetriske assays og bestemmelse af kolonidannende enheder 3, 4. Imidlertid er sådanne fremgangsmåder tilvejebringer information om fungal levedygtighed på et enkelt tidspunkt snarere end at se den dynamiske vekselvirkning mellem vært og patogen. Følgelig kan disse fremgangsmåder ikke hensyn til, om en svamp er blevet dræbt eller blot (midlertidigt) begrænset i vækst eller metabolisk aktivitet. Vi har udviklet en metode, der kan observere fungicidal aktivitet direkte og samtidig indfange detaljerede oplysninger om fagocytose, fagocyt migration og hæmning af svampevækst.
Tidligere blev en protokol offentliggjort ved hjælp af real-time imaging som et middel til at måle fagocytose af Candida albicans ved en muse makrofag cellelinie 5. Dette koncept er nu blevet udviklet yderligere at behandle viden hul i vores forståelse af Aspergillus interaktioner med immunceller ved at udnytte fluorescerende Aspergillus reporteren (FLARE) konidier 6, 7, 8. Disse konidier udtrykker en rød fluorofor (dsRed) og er mærket med en anden fluorofor (Alexa Fluor 633). Når en FLARE Konidiet bliver dræbt, stopper det producerer dsRed og den resterende dsRed svinder, mens AF633 forbliver fluorescerende og bundet til konidier. Dette skaber en klar sondring mellem levende og døde fuNGAL celler under levende celler og flowcytometri, og muliggør sporing af den skæbne enkelte konidier efter deres interaktion med immunceller.
De beskrevne assays tilvejebringer en effektiv fremgangsmåde til at visualisere interaktionen mellem værten immunceller og Aspergillus og vil være af betydelig værdi i unraveling de cellulære signalveje der er ansvarlige for antifungale effektormekanismer i medfødte immunceller. Andre anvendelsesområder omfatter visualisere hvordan ændringer i Aspergillus vækst, såsom overgangen fra hvile til hævede konidier, eller fra opsvulmede konidier til hyfer, påvirke fagocyt genkendelse og funktion.
Den følgende protokol beskriver i detaljer, hvordan man opnår humane monocytter og neutrofiler; hvordan man forbereder flare conidier; og hvordan man kan fange deres svar med video mikroskopi og flowcytometri. Selv om anvendelsen af humane immunceller isoleret fra donorblod beskrives her, detteteknik har vist sig lige så effektive anvendelse af en række murine cellepopulationer.
Denne metode beskriver en innovativ in vitro metode til at studere den antifungale aktivitet af humane primære fagocytter mod A. fumigatus anvendelse af fluorescerende Aspergillus REPORTER (FLARE) konidier, levende celler og flowcytometri. Tidligere undersøgelser har vist den merværdi anvendelse FLARE konidier både in vivo i murin eksperimentel svampeinfektion og in vitro vurdering af antifungal immunitet 6, 7. Kombinere FLARE konidier med denne næste generation af levende celler teknik muliggør en opsætning til at måle levedygtigheden af individuel konidier under dynamiske interaktioner in vitro.
Den beskrevne fremgangsmåde har potentiale til at undersøge de specifikke roller og betydning af visse cellulære processer af immunceller på deres antifungale responser. Hertil kommer, antifungale responser af fagocytter fra specifikke patienterdefinerede enkelt komponent defekter i deres immunsystem kan vurderes nærmere. Meget tidlige og indledende antifungale reaktioner kan studeres i detaljer i løbet af 6 timer med kontinuerlig billeddannelse. Dette giver mulighed for selv subtile forskelle, der skal detekteres, såsom hastigheden af fagocyt overgangen til svampen, internalisering satser, dynamik fungicide begivenheder 12, hvilket ville være undistinguishable anvendelse af konventionelle fagocytose fremgangsmåder.
Hvilken som helst celletype kan anvendes med denne metode; celletyperne her anvendte blev udvalgt, fordi disse fagocytter udgør de første og anden linje til forsvar i de humane luftveje mod A. fumigatus 13. Interessant nok kan iagttages meget klare forskelle mellem hvordan monocytter og neutrofiler i indgreb med hvilende og hævede konidier og hyfer. Monocytter næppe migrere til konidier, mens neutrofiler vise meget mere vandrende aktivitet. Yderligere fluorescerende markers såsom levende-døde markører på immunceller kan indbefattes i assayet for at give indsigt i fagocyt overlevelse efter interaktioner med Aspergillus. Interessante potentielle fremtidige ansøgninger om denne teknologi omfatter co-dyrkning af forskellige værtscelletyper, konsekvenserne for antifungale responser (fx makrofager på en epitelcelle monolag, monocytafledte dendritiske celler sammen med neutrofiler), og den tidstro måling af reaktiv produktion oxygenformer eller neutrofil ekstracellulær fælde formation efter stimulering med Aspergillus.
Enkelte punkter skal bemærkes at bruge denne protokol fremmest laboratoriet opsætning nødvendig: et mikroskop med en inverteret fase, et miljøkammer stabil ved 37 ° C, og excitation / emissionsfiltre for dsRed (532/561 nm) og AF633 ( 633 nm). Evnen af mikroskopet for at holde cellerne i fokus og fastholde immersionsolien (særlig relevant under mUlti-punkt erhvervelse) bør overvåges med jævne mellemrum på grund af den lange varighed af billeddannelse. Til kvantificering af fungicid aktivitet flowcytometri faciliteter er nødvendige. Derudover passende institutionelle og etisk godkendelse skal være på plads til at arbejde med rask donor og patient afledt blodprøver og genetisk manipulerede svampe. Det anbefales kraftigt at bruge friske blodprøver (brug på samme dag) for at forbedre cellelevedygtighed og bevare funktionaliteten. Ideelt er isolering af celler udføres umiddelbart efter trækning blodprøverne og neutrofiler afbildes straks efter isolering.
Afslutningsvis til en næste generation af levende celler teknik vurdere i stor detalje fagocyt svampedræbende aktivitet mod A. fumigatus er beskrevet. Denne teknologi kan give et unikt indblik i de enkelte celle-svampe interaktioner i begyndelsen af medfødte immunforsvar mod Aspergillus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet af MRC og University of Aberdeen (MRC Center for Medicinsk Mykologi) og af Wellcome Trust Strategic Award – Medicinsk Mykologi Fungal Immunologi (SFB, JMB, JK, AW). En særlig tak gives til støtte fra Chloe fond. TMH er støttet af en bevilling fra National Institute of Health (NIH, kode RO1 093.808) og Memorial Sloan Kettering Cancer Center er støttet af NIH tilskud P30 CA008748. Derudover TMH er en efterforsker i Patogenese af smitsomme sygdomme støttet af Burroughs Wellcome fonden. Vi vil gerne takke Aberdeen Mikroskopi og Histologi faciliteten for deres hjælp og støtte.
Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
15 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
50 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |