Summary
Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l'inibizione della crescita di funghi.
Abstract
Aspergillus fumigatus è un patogeno fungino opportunistica causano infezioni invasive nei pazienti immunocompromessi con un alto tasso di mortalità. La ricerca indaga risposte immunologiche contro A. fumigatus è stata limitata dalla mancanza di test coerenti e affidabili per misurare l'attività antifungina di specifiche cellule immunitarie in vitro. Un nuovo metodo è descritto per valutare l'attività antifungina di monociti primari e neutrofili da donatori umani contro A. fumigatus utilizzando fluorescenti Aspergillus Reporter (FLARE) conidi. Queste conidi contengono un reporter DsRed geneticamente codificato, che è costitutivamente espressa da conidi FLARE vivo, e sono esternamente etichettati con Alexa Fluor 633, che è resistente alla degradazione nel fagolisosoma, permettendo così una distinzione tra vivo e morto conidi A. fumigatus. Il video microscopia e citometria a flusso vengono successivamente utilizzati per la visualizzazione interagisconoionico tra conidi e cellule dell'immunità innata, valutando attività fungicida pur fornendo anche una serie di informazioni sulla migrazione dei fagociti, fagocitosi e l'inibizione della crescita fungina. Questa nuova tecnica ha già fornito nuove interessanti intuizioni l'interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus. È importante notare la configurazione di laboratorio necessaria per eseguire questo test, compreso il microscopio necessaria e citometria a flusso strutture, e la capacità di lavorare con donatori di sangue umano e funghi geneticamente manipolati. Tuttavia, questo saggio è in grado di generare grandi quantità di dati e può rivelare forniscono informazioni dettagliate della risposta antimicotico. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare l'interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus.
E 'importante notare la configurazione di laboratorio necessario per eseguire questo test, tra cui il microscopio necessaria e citometria a flusso facilities, e la capacità di lavorare con donatori di sangue umano e funghi geneticamente manipolati. Tuttavia, questo saggio è in grado di generare grandi quantità di dati e può rivelare forniscono informazioni dettagliate della risposta antimicotico. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare l'interazione ospite-patogeno delle cellule immunitarie primarie contro A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus è un patogeno fungino opportunistica e la causa fungina più comune delle infezioni polmonari invasive nell'ospite immunocompromesso 1, 2. Capire come le cellule immunitarie dell'ospite riconoscere ed eliminare Aspergillus è un settore importante della ricerca di funghi, tuttavia, i saggi fungicide attualmente disponibili hanno limitazioni significative. Metodi comunemente usati per misurare l'attività fungicida includono saggi colorimetrici e determinazione delle unità formanti colonia 3, 4. Tuttavia, tali metodi forniscono informazioni sulla viabilità funghi in un unico punto di tempo anziché visualizzare l'interazione dinamica tra ospite e patogeno. Di conseguenza, questi metodi non possono prendere in considerazione se un fungo è stato ucciso o semplicemente (temporaneamente) limitata in crescita o l'attività metabolica. Abbiamo sviluppato un metodo in grado di osservare fungicil'attività dal direttamente mentre catturando simultaneamente informazioni dettagliate riguardanti la fagocitosi, la migrazione dei fagociti e l'inibizione della crescita di funghi.
In precedenza, un protocollo è stato pubblicato utilizzando imaging in tempo reale come un mezzo per misurare la fagocitosi di Candida albicans da una linea cellulare di topo macrofagi 5. Questo concetto è stato ora ulteriormente sviluppato per affrontare il gap di conoscenza nella nostra comprensione delle interazioni con le cellule immunitarie Aspergillus utilizzando fluorescenti Aspergillus Reporter (FLARE) conidi 6, 7, 8. Questi conidi esprimono un fluoroforo rosso (DsRed) e sono etichettati con un secondo fluoroforo (Alexa Fluor 633). Una volta che un conidio FLARE viene ucciso, si smette di produrre DsRed e il restante DsRed svanisce, mentre l'AF633 rimane fluorescente e legato alla conidi. Questo crea una chiara distinzione tra fu vivo e mortocellule NGAL durante l'imaging cellulare dal vivo e citometria a flusso, e consente il monitoraggio del destino dei conidi individuali dopo la loro interazione con le cellule del sistema immunitario.
I saggi descritti forniscono un metodo efficace di visualizzare l'interazione tra cellule immunitarie dell'ospite e Aspergillus e saranno di notevole valore nel chiarire le vie di segnalazione cellulari responsabili meccanismi effettori antifungini in cellule immunitarie innate. Altre applicazioni includono la visualizzazione come i cambiamenti nella crescita Aspergillus, come ad esempio il passaggio da riposo a conidi gonfio, o da conidi gonfio di ife, influenzano il riconoscimento dei fagociti e funzione.
Il seguente protocollo descrive in dettaglio come ottenere monociti e neutrofili; come preparare il conidi FLARE; e come catturare le loro risposte con il video microscopia e citometria a flusso. Sebbene l'uso di cellule immunitarie umane isolate da sangue del donatore viene qui descritto, questotecnica si è dimostrata altrettanto efficace utilizzando una varietà di popolazioni di cellule murine.
Protocol
Il protocollo per ottenere neutrofili e cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è basato su metodi precedentemente pubblicati 9. L'uso di campioni di sangue di volontari sani è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell 'Università di Aberdeen. Prima di iniziare assicurarsi che tutte le approvazioni etiche sono a posto per un prelievo di sangue di volontari sani e / o pazienti per lo scopo dell'esperimento descritto. Mantenere le cellule in ghiaccio, ove possibile, di aumentare la loro sopravvivenza.
1. A. fumigatus, Cultura e Condizioni
- Preparare glucosio agar minimo come descritto 10.
- Regolare mezzi a pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C per 20 min.
- Lasciare raffreddare a 65 ° C.
- Lavorando in una cappa a flusso sterile, versare 30 mL di supporti raffreddati in un pallone T75 e lasciar raffreddare il collo del pallone di riposo su una pipetta 25 ml di cReate una pendenza agar.
- Striscia la DsRed Af293- ceppo A. fumigatus sull'agar e incubare per 7 giorni a 37 ° C + 5% di CO 2. Due boccette produrrà circa 10 9 conidi in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-biotinilazione.
2. A. fumigatus etichettatura e preparazione
Nota: Quando si esegue questo test per la prima volta, preparare il parental Af293- ceppo A. fumigatus. Prelevare campioni di entrambi i ceppi in provette per microcentrifuga ed etichettare solo uno di ogni ceppo come descritto di seguito. Ciò permetterebbe di avere il controllo conidi senza colore e conidi con un solo colore, sia DsRed o AF633, per testare la configurazione e le attrezzature.
- Raccolto A. fumigatus conidi immergendo la coltura con 30 ml di PBS + 0,05% Tween-80. Filtrare la sospensione risultante attraverso un colino cella 40 micron in una provetta da 50 ml per rimuovere i frammenti ifali.
- Centrifuge a 805 xg per 10 min, rimuovere il surnatante e lavare una volta in 20 mL di PBS sterile. Piscina conidi da due piastre dello stesso ceppo durante la fase di lavaggio.
- Dopo la fase di lavaggio, risospendere il pellet in 5 ml di PBS e trasferimento 1 ml della sospensione di conidi in provette per microcentrifuga. 1 ml di sospensione di ciascun ceppo è solitamente sufficiente per cellule vive. Avvolgere le aliquote restanti in fogli e conservare a 4 ° C.
- aliquote centrifuga di sospensione di conidi a 9.300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 mL 0,05 M NaHCO 3 pH 8,3.
- Preparare 10 mg di biotina / 200 pl dimetilsolfossido soluzione madre (DMSO) ricostituendo 25 mg di biotina in 500 microlitri di DMSO. Aggiungere 10 microlitri biotina / soluzione stock DMSO alla provetta, coperchio in foglio di alluminio e incubare per 2 ore su un agitatore meccanico a 4 ° C.
- Aliquotare il resto della biotina / DMSO archivio solution e congelare a -20 ° C per l'uso in esperimenti successivi.
- Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di 100 mM Tris-HCl pH 8,0 per 1 ora per disattivare biotina liberamente fluttuante.
- Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare il pellet due volte con 1 ml di PBS sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS.
- Sciogliere 1 mg di streptavidina-AF633 in 0,5 mL di PBS per fare un / soluzione madre 2 mg mL. Aggiungere 10 ml di 2 mg / mL streptavidina-AF633 per 1 ml di sospensione di conidi e incubare per 40 minuti a temperatura ambiente su un agitatore meccanico coperto in foglio di alluminio. Il restante Streptavidina-AF633 può essere congelato in aliquote per l'uso in esperimenti successivi.
- Centrifugare per 10 minuti a 9300 xg e rimuovere con attenzione il surnatante. Risospendere il pellet di conidi in 1 ml di PBS e contare il conidi con un emocitometro a una diluizione 1: 1.000 (1: 100 e poi 1,10). Regolare la concentrazione conidi di 3,6 x 10 6 / ml con CO 2 media indipendenti, avvolgerlo in carta e conservare a 4 ° C.
NOTA: I conidi sono ora etichettati con AF633 e verranno indicati come FLARE conidi. - Opzionale: Se è necessaria la stimolazione con conidi gonfio, dopo aver contato conidi (passo 2.9), diluire conidi di 7,2 x 10 6 / ml in base azotata di lievito (YNB) medio e aggiungere 500 microlitri sospensione di conidi di 4,5 ml YNB medie un autoclavato 50 mL beuta. Coprire e posizionare il pallone in un incubatore scuotimento (200 rpm a 37 ° C) per 6 ore.
- Trasferire il medio in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 805 xg per 10 min a temperatura ambiente e lavare una volta in PBS. Centrifuga di nuovo e risospendere pellet in 1 ml di CO 2 media indipendenti, dando 3.6 x 10 6 conidi / mL.
Nota: Conidi spesso ciuffo dopo che diventano gonfie rendendo difficile un conteggio preciso, si consiglia di calcolare con la cNumeri ounted di conidi utilizzati riposo.
- Trasferire il medio in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 805 xg per 10 min a temperatura ambiente e lavare una volta in PBS. Centrifuga di nuovo e risospendere pellet in 1 ml di CO 2 media indipendenti, dando 3.6 x 10 6 conidi / mL.
3. Isolamento di neutrofili umani e monociti
- Disegnare 20 ml di sangue venoso da volontari sani in due provette di sangue 10 mL contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Per ciascun donatore separatamente, versare 20 ml di sangue in una provetta da 50 ml e diluire con 15 ml di PBS.
- Alla base del sangue con 15 mL di una soluzione di isolamento dei linfociti (densità 1.077 g / mL) con un ago della siringa e ferro. Posizionare l'ago nella parte inferiore del tubo e forzare delicatamente la soluzione di isolamento dei linfociti fuori. Centrifugare a 630 xg per 20 minuti senza freno e bassa accelerazione.
- Preparare PBS, raffreddato in ghiaccio.
NOTA: i passaggi 3.4 e 3.5 deve essere seguita contemporaneamente per generare monociti (3.4) e neutrofili (3.5). - Utilizzando un pastette, raccogliere lo strato PBMC. Questo è lo strato al centro tra il siero giallo (superiore) e la soluzione trasparente isolamento dei linfociti (inferiore) strato, etrasferire in un tubo da 50 ml fresca.
- Riempire il tubo con PBMC fino a 50 ml con PBS freddo e centrifugare a 582 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS freddo e risospendere in 1 ml di PBS per 20 ml di sangue del donatore utilizzati inizialmente.
- Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro.
- Preparare una soluzione tampone con l'aggiunta di 26 mL di calore inattivato siero fetale di vitello (FCS) e 2,1 ml di 0,5 M EDTA a 500 ml di HBSS. Centrifugare le cellule per 10 min a 515 xg e risospendere in 40 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e aggiungere 10 ml di microperle CD14 per 1 x 10 7 cellule, mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C, avendo cura di mescolare i tubi ogni 5 min.
- Lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione tampone a 1 x 10 7 cellule e centrifuge a 515 g per 10 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 1 x 10 8 cellule in 500 microlitri di soluzione tampone.
- Mettere 1 colonna per campione su un separatore magnetico secondo le istruzioni del produttore. Prima lavare la colonna una volta con 500 ml di soluzione tampone.
- Pipetta 500 microlitri di sospensione cellulare attraverso la colonna, attendere che la colonna asciugare e poi lavare ripetendo questo tre volte con soluzione tampone.
- Posizionare un nuovo tubo 15 ml sotto la colonna e la colonna prendere fuori dal separatore magnetico. Poi lavare le cellule fuori della colonna nel tubo di 1 mL di soluzione tampone.
- Aggiungere 4 ml di soluzione tampone e centrifugare a 515 xg per 10 minuti, e poi risospendere in 1 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media.
- Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con unemocitometro.
- Regolare la concentrazione cellulare a 6 x 10 5 / mL con RPMI e sementi 200 microlitri su un piatto di imaging basata vetro da 35 mm. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Il giorno dopo, prima di imaging, rimuovere il RPMI e aggiungere 200 ml di CO 2 di media indipendenti.
Nota: Questi monociti possono essere differenziate in diversi sottoinsiemi dei macrofagi prima di imaging. Se questa è una tecnica da esplorare, un eccellente punto di partenza è il recente lavoro di Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Dopo la raccolta strato PBMC, rimuovere tutto il siero e la maggior parte della soluzione di isolamento dei linfociti, ma attenzione a non rimuovere il nastrino bianco sulla parte superiore del sedimento rosso come questo contiene la maggior parte dei neutrofili.
- Preparare un tampone 10x ipotonico lisi magazzino aggiungendo 83 g di NH 4 Cl e 10 g di KHCO 3 in 1 L di acqua sterile. Conservare a 4 °C.
- Diluire tale stock 10x con acqua sterile e aggiungerlo ai tubi. Quindi, capovolgere con cautela 3 volte e incubare in ghiaccio per 15 min.
- Centrifugare a 394 xg per 10 minuti e risospendere in tampone di lisi ipotonica per 10 min in ghiaccio.
- Centrifugare a 394 xg e lavare due volte con PBS freddo. Risospendere in 1 mL di CO 2 media indipendenti per donatore.
- Fare diluizioni 1:10 per il conteggio aggiungendo 20 microlitri della sospensione cellulare a 160 ml di PBS e 20 ml di trypan blu. Contare le cellule con un emocitometro.
- Citometria a flusso, regolare la concentrazione di 6 x 10 5 / mL e aggiungere sospensione cellulare 400 microlitri di una piastra da 24 pozzetti. Per la microscopia, aggiungere 200 microlitri della stessa sospensione cellulare ad un piatto di imaging basata vetro da 35 mm.
Nota: l'imaging dei neutrofili o citometria a flusso deve essere iniziato immediatamente a causa della loro propensione a subire apoptosi se lasciato non stimolato. Se questo non è possibile neutrofili devono essere tenuti inghiaccio e utilizzato il più presto possibile (entro lo stesso giorno).
4. Citometria a Flusso
- Aggiungere 200 ml di 1,2 x 10 6 / ml FLARE conidi alle cellule nella piastra a 24 pozzetti, e quindi aggiungere 100 ml di 20 mg / mL voriconazolo. Aggiungere 300 ml di RPMI e incubare per 16 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
NOTA: Voriconazolo viene aggiunto per impedire la germinazione dei conidi. - Aggiungere 25 ml di una soluzione stock 1 mM calcofluor-bianco a ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 25 pM e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Centrifugare a 582 g per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS.
- Per raccogliere cellule aderenti (monociti), aggiungere 1 ml di PBS con 3 mM EDTA a ciascun pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2. lavare delicatamente le cellule dalla piastra pipettando e raccogliere le cellule in un tubo.
- Risciacquare una volta in tampone FACS (2% siero di vitello fetale al PBS), e poi risospendere in FACS buffer per analisi FACS.
- Per l'analisi FACS, prima regolare i parametri di compensazione del citometro a flusso e impostare cancelli positivi utilizzando tubi di compensazione monocromatiche, incluse conidi senza colore: DsRed + conidi, AF633 + conidi e Calcofluor bianco + conidi (generato come in 4.2).
- Impostare cancello libera conidi basa su avanti e scatter laterale utilizzando conidi con nessun colore. Situato porta cellulare su avanti e scatter lato escludendo la porta conidi libero.
- Analizzare provetta registrando 10.000 eventi.
NOTA: Le cellule associati conidi dal vivo saranno DsRed + e + AF633. Le cellule associate a conidi morti saranno solo AF633 +. cellule bystander che non sono impegnati conidi sarà dsRed- e AF633-. Le popolazioni di cellule conidi-impegnati sono ulteriormente analizzati per la colorazione bianca calcofluor sul canale Pacific Blue. Conidi che restano al di fuori delle cellule sarà calcofluor Bianco +, e conidi che sono stati internalizzati sarannoCalcofluor Bianco-.
5. Live Cell microscopio video
Nota: La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e filtri di eccitazione / emissione appropriati per DsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conidi FLARE non funzionano con il laser 488 nm al posto del laser 532/561 nm per DsRed. Quando si esegue questo esperimento per questa prima volta, utilizzare il conidi di controllo con nessun colore e il colore unico per verificare fluorescenza di fondo e sanguinare-through tra la DsRed e canali AF633.
- Accendere il riscaldamento microscopio prima dell'esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo necessario per la temperatura della camera di stabilizzazione varierà per differenti configurazioni microscopio.
- Accendere il microscopio e il computer, ed eccoannuncio il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare i neutrofili o monociti umani.
- Per DsRed e AF633, impostare la potenza del laser al 10% e il tempo di esposizione di 1 s nelle impostazioni di acquisizione.
- Rimuovere il vetrino imaging e aggiungere 100 ml di 3 x 10 6 / ml FLARE sospensione di conidi nei rispettivi pozzetti (volume totale 300 pl / pozzetto). Registrare il tempo che FLARE conidi vengono aggiunti al piatto.
- Riportare la diapositiva per il palco e regolare la sensibilità della fotocamera per DsRed e AF633 di vedere chiaramente la conidi ma non overexpose l'immagine. Impostare un elenco dei punti di fase se è richiesta l'acquisizione multi-point.
- Iniziano l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco, i canali sono ottimizzate e il tempo di ciclo e la durata è impostato. Tempo di ciclo e la durata delle immagini dipendono dalla domanda sperimentale. L'obiettivo è di mantenere il tempo di ciclo più breve possibile (≤2 min) con 1 min consentendo analisi approfondite uptdinamica ake.
Representative Results
I risultati rappresentativi sono riportati seguendo il protocollo descritto. La figura 1 illustra un video live-cell 6 h rappresentativo con neutrofili umani e FLARE conidi. DsRed (rosso) è espressa dalla conidi stessi mentre sono stati etichettati con AF633 (magenta).
La figura 2 è un'immagine di un singolo punto temporale da un film simile come mostrato in figura 1, che illustra la differenza tra vivo e morto conidi FLARE. conidi morti si distinguono da conidi in diretta da perdere il loro segnale DsRed (rosso), pur mantenendo una fluorescenza AF633 luminoso (magenta). A. fumigatus conidi spesso sopravvivere all'interno di fagociti per oltre 6 ore. Pertanto, per quantificare efficacemente uccidere, citofluorimetria trame sono mostrati per un periodo di incubazione 16 h in figura 3. Questi dati sono stati ottenuti con una ce macrofagi alveolarill linea come esempio, ma può essere eseguita con qualsiasi tipo di cellula. In figura 4 la migrazione è mostrato nella prima ora di stimolazione per i neutrofili umani e la loro velocità e movimento direzionale. La Figura 5 mostra la percentuale di neutrofili e monociti che hanno ingerito 1, 2, 3 o più conidi mentre la figura 6 mostra il numero di conidi che germinano in ife.
Figura 1: Live-cell microscopia video film di neutrofili umani e FLARE conidi. I neutrofili sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. bar scala = 10 micron.Un ingrandimento in video è mostrato con i canali separati per chiarire il ruolo dei conidi FLARE con DIC in alto a sinistra, DsRed (rosso) in alto a destra, AF633 (verde) in basso a sinistra e il video unito in basso a destra . Cliccate qui per scaricare questo video.
Figura 2: immagine punto temporale singolo dimostrare la differenza tra vivo e morto conidi FLARE. neutrofili umani sono state stimolate con FLARE conidi e ripreso con un microscopio confocale a disco rotante. L'immagine è stata scattata dai film generati. conidi morti si distinguono dalle ife avendo perso il loro DsRed (rosso: in alto a destra) del segnale, pur mantenendo la loro fluorescenza AF633 (verde: in basso a sinistra). Si prega di cliccare qui per Una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione e validazione di fagocitosi e l'uccisione di A. fumigatus conidi. macrofagi alveolari di topo (MH-S) sono stati incubati con FLARE conidi in un rapporto 1: 1 per 16 ore in presenza di voriconazolo. cellule MH-S associati conidi vivi sono mostrati nella porta rosso (+ DsRed AF633 +). cellule MH-S associati conidi morti sono mostrati nella porta blu (DsRed-AF633 +). cellule spettatore MH-S sono mostrati nella porta oro. Calcofluor bianco, un colorante fluorescente cellulare impermeabile che si lega alla parete cellulare fungina, è usato per distinguere extracellulare conidi (Calcofluor bianco +) da conidi intracellulare (calcofluor White-). Come una convalida supplementare al metodo, è dimostrato che il trattamento con citocalasina D 2 mM inibisce l'assorbimento da parte delle cellule conidi MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La migrazione dei neutrofili e monociti umani contro A. fumigatus conidi. I neutrofili sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. La migrazione di tutti i singoli neutrofili umani per campo è stato manualmente monitorati tramite il software di monitoraggio nei confronti di riposo (A) e gonfia (B) conidi per 1 ora. Dati rappresentano 1 fotogramma di celle per ogni condizione dello stesso donatore. Il fattore meandri (C), una misura di directiomovimento nal, e la velocità (D) sono stati poi quantificati utilizzando lo stesso software. Media ± SEM per 3 donatori sono indicati con 30 cellule per donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. *: P <0,05 (test t corretto di Welch). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: fagocitosi di A. fumigatus conidi dai neutrofili e monociti umani. Neutrofili e monociti sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. Fagocitosi è stata misurata come la quantità di cellule contengonoing FLARE conidi dopo 4 ore di stimolazione. I dati sono presentati come media ± SEM da 3 donatori e 3 fotogrammi al donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Inibizione di germinazione di A. fumigatus conidi dai neutrofili e monociti. Neutrofili e monociti sono stati isolati da sangue umano e seminate insieme FLARE conidi di CO 2 di media indipendenti con un rapporto di 1: 3, rispettivamente. Imaging è stato avviato direttamente a 37 ° C con un microscopio confocale disco rotante. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min e 55 s per un periodo di 6 ore. L'inibizione della germinazione di funghi è stata esaminata misurando la percentuale di conidi che ha avuto germeinati dopo 2, 4 e 6 ore di co-coltura. I dati sono presentati come media ± SEM da 3 donatori e 3 fotogrammi al donatore oltre 2 esperimenti indipendenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo metodo descrive un innovativo metodo in vitro per studiare l'attività antifungina dei fagociti primari umani contro A. fumigatus utilizzando fluorescente Aspergillus Reporter (FLARE) conidi, cellule vive e citometria a flusso. Studi precedenti hanno dimostrato il valore aggiunto di utilizzare FLARE conidi sia in vivo nella infezione fungina sperimentale murino e nella valutazione in vitro di antimicotico immunità 6, 7. Combinando FLARE conidi con questa tecnica cellule vive prossima generazione consente un'installazione per misurare la vitalità di conidi individuo durante interazioni dinamiche in vitro.
Il metodo descritto ha il potenziale per indagare i ruoli specifici e l'importanza di alcuni processi cellulari di cellule immunitarie alle risposte antifungini. Inoltre, le risposte antifungini di fagociti da pazienti affetti da specifichedefiniti difetti monocomponenti nel loro sistema immunitario possono essere valutati in maggior dettaglio. Molto risposte antifungini precoci e iniziali possono essere studiati in dettaglio più di 6 ore di immagini in continuo. Questo permette anche sottili differenze da rilevare, ad esempio la velocità di migrazione dei fagociti verso il fungo, i tassi di internalizzazione, dinamica degli eventi fungicide 12, che sarebbero indistinguibili utilizzando metodi convenzionali fagocitosi.
Qualsiasi tipo di cellula può essere utilizzato con questo metodo; i tipi cellulari usate qui sono stati scelti perché questi fagociti costituiscono la prima e la seconda linea di difesa nelle vie aeree umane contro A. fumigatus 13. È interessante notare, differenze molto chiare possono osservare tra come monociti e neutrofili impegnarsi con riposo e conidi gonfio e ife. I monociti difficilmente migrano verso conidi, mentre i neutrofili mostrano un'attività molto più migratoria. mar fluorescenti aggiuntivekers, come marcatori dal vivo-morto sulle cellule del sistema immunitario possono essere inclusi nel saggio di fornire approfondimenti di sopravvivenza dei fagociti seguente interazioni con Aspergillus. Interessanti potenziali future applicazioni per questa tecnologia includono la co-coltura di diversi tipi di cellule ospiti, le conseguenze per le risposte antifungini (ad esempio, i macrofagi su un monostrato epiteliale, cellule dendritiche derivate da monociti insieme con neutrofili), e la misura in tempo reale della reattivo ossigeno produzione di specie o neutrofili extracellulare formazione trappola seguito di stimolazione con Aspergillus.
Alcuni punti devono essere notato per utilizzare questo protocollo, soprattutto il setup di laboratorio richieste: un microscopio con una fase invertita, una camera climatica stabile a 37 ° C, e l'eccitazione / filtri di emissione per DsRed (532/561 nm) e AF633 ( 633 nm). La capacità del microscopio per mantenere le cellule a fuoco e mantenere l'immersione in olio (particolarmente rilevante durante multi-point acquisizione) deve essere monitorata periodicamente a causa della lunga durata delle immagini. Per la quantificazione dell'attività fungicida citometria a flusso sono richieste strutture. Inoltre, opportune approvazioni istituzionali ed etici devono essere in atto per lavorare con donatore sano e campioni di sangue dei pazienti derivati e funghi geneticamente manipolati. Si raccomanda vivamente di utilizzare campioni di sangue fresco (uso lo stesso giorno) per aumentare la vitalità delle cellule e preservare la funzionalità. Idealmente, l'isolamento di cellule viene eseguita immediatamente dopo aver disegnato i campioni di sangue e neutrofili sono ripreso immediatamente dopo l'isolamento.
In conclusione, una tecnica di imaging di cellule vive di nuova generazione per valutare in grande attività antifungina dettaglio phagocyte contro A. fumigatus è descritto. Questa tecnologia è in grado di fornire una visione unica singole interazioni cellula-fungine nelle prime difese immunitarie innate contro Aspergillus.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal MRC e l'Università di Aberdeen (MRC Centro di Micologia Medica) e dal Wellcome Trust Award strategica - Micologia Medica Fungal Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Un ringraziamento speciale è data al sostegno del Fondo Chloe. TMH è sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institute of Health (NIH, il codice RO1 093.808) e il Memorial Sloan Kettering Cancer Center è supportato dal NIH concedere P30 CA008748. Inoltre, TMH è un investigatore nella patogenesi della malattia infettiva sostenuta dal Fondo Burroughs Wellcome. Desideriamo ringraziare l'Aberdeen Microscopia e Istologia strumento per il loro aiuto e sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
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