Summary
Burada, canlı hücre bir video mikroskobu ile birlikte floresan Aspergillus raportör konidyalarını kullanarak gerçek zamanlı olarak birincil insan bağışıklık hücrelerinin antifungal aktivitesini değerlendirmek ve akım sitometri bir protokol açıklar. Oluşturulan veriler, fungisit aktivite, fagositoz, hücre göçü ve mantar büyüme inhibisyonu olarak ana bilgisayarın hücreye Aspergillus etkileşimleri ilişkin bilgi sağlar.
Abstract
Aspergillus fumigatus, yüksek vaka ölüm oranı ile bağışıklığı taviz vermiş konakçılarda invaziv enfeksiyonlara yol açan fırsatçı fungal patojendir. A. fumigatus karşı bağışıklık tepkileri araştıran Araştırma in vitro olarak spesifik bir bağışıklık hücrelerinin antifungal aktivitesinin ölçülmesi için tutarlı ve güvenilir analizlerin olmaması ile sınırlandırılmıştır. Yeni yöntem, primer monositleri ve flüoresan Aspergillus Reporter (havşa) konıdi kullanılarak, A. fumigatus karşı insan donörlerden nötrofillerin mantar önleyici aktivitesini değerlendirmek için tarif edilmektedir. Bu conidia kurucu canlı FLARE conidia ile ifade edilir, ve harici olarak, böylece canlı ve ölü A. fumigatus conidia arasında bir ayrım sağlayan phagolysosome içindeki bozunmaya karşı dayanıklı olmaktadır Alexa Fluor 633 ile etiketlenir genetik olarak kodlanmış DsRed muhabir içerir. Video mikroskobu ve sitometrisi sonradan etkileşim görselleştirmek için kullanılan akışconidia ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki iyon, aynı zamanda, fagosit göç, fagositoz ve mantar büyümesinin engellenmesi ile ilgili bilgi hazinesi temin ederken fungisidal aktivitesi değerlendirilerek hazırlanabilir. Bu yeni teknik, zaten A. fumigatus karşı primer immün hücrelerinin konak-patojen etkileşimi içine heyecan verici yeni bakış açıları sağlamıştır. Gerekli mikroskopisi dahil olmak üzere bu deneyi gerçekleştirmek ve tesisleri flow sitometri için gerekli laboratuvar kurulumu ve insan donör kan ve genetik olarak manipüle mantar ile çalışmak kapasitesini dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, bu deney, büyük miktarda veri üretme yeteneğine sahiptir ve antifungal yanıt yönelik ayrıntılardan ortaya çıkarabilir. Bu protokol, başarılı bir şekilde A. fumigatus karşı birincil bağışıklık hücrelerinin konukçu-patojen etkileşimini incelemek için kullanılmıştır.
Gerekli mikroskobu dahil olmak üzere bu deneyi gerçekleştirmek için gerekli laboratuvar kurulumu, dikkat ve f akım sitometri için önemlidiracilities ve kapasite insan donör kanı ve genetik olarak manipüle mantarlar ile çalışmak. Bununla birlikte, bu deney, büyük miktarda veri üretme yeteneğine sahiptir ve antifungal yanıt yönelik ayrıntılardan ortaya çıkarabilir. Bu protokol, başarılı bir şekilde A. fumigatus karşı birincil bağışıklık hücrelerinin konukçu-patojen etkileşimini incelemek için kullanılmıştır.
Introduction
Aspergillus fumigatus, fırsatçı bir fungal patojendir ve bağışıklık, ev sahibinin 1, 2 invasif akciğer enfeksiyonlarının en sık görülen mantar nedenidir. Mantar araştırma önemli bir alan konak bağışıklık hücreleri tanıyıp Aspergillus ortadan kaldırmak nasıl olduğunu anlamak, ancak, şu anda mevcut mantar öldürücü tahliller önemli kısıtlamalara sahiptir. Mantar öldürücü aktiviteye ölçmenin Yaygın olarak kullanılan yöntemler, kolorimetrik tahlilleri ve koloni oluşturan birim 3, 4 belirlenmesini içerir. Bununla birlikte, bu yöntemler, tek bir zaman noktasında yerine ev sahibi ve patojen arasındaki dinamik etkileşimin görüntüleme daha mantar canlılığı hakkında bilgi sağlar. Bir mantar öldüren veya basitçe (geçici olarak) büyüme ya da metabolik aktivitede sınırlandırılmış olsun Buna göre, bu yöntemler dikkate alamaz. Biz gözlemleyerek fungici yapabilen bir yöntem geliştirdikeş zamanlı olarak, fagositoz, fagosit göç ve mantar büyümesi inhibisyonu ile ilgili detaylı bilgi yakalama iken, doğrudan dal aktivitesi.
Daha önce, bir protokol, bir fare makrofaj hücre hattı 5, Candida albicans fagositoz ölçmek için bir araç olarak, gerçek zamanlı görüntüleme kullanılarak basıldı. Bu kavram artık floresan Aspergillus Reporter (FLARE) konidianıri 6, 7, 8 kullanarak bağışıklık hücreleri ile Aspergillus etkileşimleri anlayışımızda bilgi açığını gidermek için daha da geliştirilmiştir. Bu konidıler kırmızı fluorofor (dsRed) ifade eden ve ikinci bir fluorofor (Alexa Fluor 633) ile etiketlenir. Bir FLARE conidium öldürdü sonra, DsRed üreten durdurur ve AF633 konidiaya floresan ve bağlı kalırken kalan dsRed, kaybolur. Bu canlı ve ölü fu arasında açık bir ayrım yaratırcanlı hücre görüntüleme sırasında ngalll hücreleri ve akım sitometri ve bağışıklık hücreleri olan etkileşimleri aşağıdaki bireysel Konidyumların kaderin izlemeyi mümkün kılar.
Tarif edilen deneyler konak bağışıklık hücreleri ve Aspergillus arasındaki etkileşimi görselleştirme etkili bir yöntem sağlar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri antifungal efektör mekanizmaları sorumlu olan hücresel sinyal yollarını çözülüyor önemli bir değer olacaktır. Diğer uygulamalar, örneğin şişkin konidiaya veya şişmiş conidia gelen hiflere dinlenme gelen anahtar olarak Aspergillus büyüme değişiklikler, fagosit tanıma ve işlevini nasıl etkilediğini görselleştirme içerir.
Aşağıdaki protokol, insan monositleri ve nötrofilleri nasıl elde edileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır; nasıl FLARE konidianıri hazırlamak; ve nasıl bir video mikroskobu ile yanıtlarını yakalamak için ve akım sitometri. verici kanından izole insan bağışıklık hücreleri kullanımı burada, bu tarif edilmesine karşınteknik murin hücre popülasyonlarının kullanarak çeşitli eşit derecede etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Protocol
Nötrofiller ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) elde etmek için protokol, önceden yayımlanan metotlardan 9 dayanmaktadır. Sağlıklı gönüllülerden alınan kan örnekleri kullanılması Aberdeen Üniversitesi İnsan araştırma etik komitesi tarafından onaylandı. başlamadan önce şunlara dikkat edin bütün etik onayları açıklanan deney amacıyla sağlıklı gönüllüler ve / veya hastalardan kan çizmek için yerinde bulunmaktadır. onların hayatta artırmak mümkün hücreleri buz üzerinde tutun.
1. A.fumigatus Kültür ve Koşullar
- Tarif edildiği gibi 10 glikoz minimal agar ortamı hazırlar.
- 20 dakika boyunca 120 ° C de, 1 M NaOH ile pH 6.5 ve otoklava ortamı ayarlayın.
- 65 ° C'ye kadar soğumaya bırakılır.
- bir steril akış başlığı içinde çalışarak, T75 şişesi içine soğutulmuş ortamı 30 mL dökün ve c 25 ml'lik bir pipetle üzerinde akıtma dinlenme boynuna soğumaya bırakınBir agar eğim REATE.
- Agar üzerine DsRed Af293- A. fumigatus soyu üzerinden leke yapmayan ve 37 ° C ile + 5% CO2 7 gün boyunca inkübe edilir. İki tüp 5 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ön-biyotinilasyon yaklaşık 10 9 konıdi verecektir.
2. A. fumigatus Etiketleme ve Hazırlama
Not: ilk kez bu tahlili yaparken, ebeveyn Af293- A. fumigatus suşu hazırlar. mikrosantrifüj tüpleri içinde, her iki suşların örnekleri almak ve aşağıda tarif edildiği gibi, sadece her bir suşun bir etiket. Bu kurulum ve ekipmanı test etmek, dsRed veya AF633 ya, tek tek renk ile hiçbir renk ve conidia kontrol konidianıri sahip sağlayacaktır.
- 30 ml PBS +% 0.05 Tween-80 ile kültür daldırarak Hasat A. fumigatus conidia. Hif fragmanlarını temizlemek amacıyla, bir 50 ml tüp içine, bir 40 um'lik bir hücre süzgecinden Elde edilen süspansiyon süzülür.
- C10 dakika boyunca 805 x g'de entrifuge süpernatant kaldırmak ve steril PBS'nin 20 mL kez yıkayın. Yıkama aşaması sırasında aynı türden iki plakalardan Havuz conidia.
- Yıkama adımından sonra, 5 ml PBS pelet ve transfer mikrosantrifüj tüpleri içine konidial süspansiyon 1 ml'lik eş payları yeniden süspanse edin. Her cinsin süspansiyonu 1 ml genellikle canlı hücre görüntüleme için yeterlidir. 4 ° C 'de folyo ve deposunda kalan alikotları sarın.
- konidial süspansiyon santrifüj alikoları, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 9,300 x g'de ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. 1 ml 0.05 M NaHCOs 3, pH 8.3 konidial pelletini.
- 500 uL DMSO içinde 25 mg biyotin yeniden oluşturulması ile 10 mg biyotin / 200 uL dimetilsülfoksit (DMSO) bir stok çözelti hazırlayın. alüminyum folyo ile 10 uL biyotin / mikrosantrifüj tüpüne DMSO stok çözeltisi, kapak ekleyin ve 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde 2 saat süreyle inkübe edin.
- biyotin / DMSO stok çözeltideki kalanını alikosuburada n ve sonraki deneylerde kullanılmak üzere -20 ° C'de dondurun.
- 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. serbest yüzen biyotin devre dışı bırakmak için, 1 saat boyunca, pH 8.0, 100 mM Tris-HCl, 1 mL konidial pelletini.
- 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. Steril 1 mL PBS ile iki kez yıkanır ve pelet 1 mL PBS içinde pelletini.
- 2 mg / mL stok çözelti yapmak için PBS 0.5 mL streptavidin-AF633 1 mg çözülür. konidial süspansiyon 1 mL başına 2 mg / ml streptavidin AF633 10 uL ekleyin ve alüminyum folyo ile kaplı bir rocker, oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edilir. Kalan Streptavidin AF633 sonraki deneylerde kullanılmak üzere alikolar içinde dondurulabilir.
- 9,300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant kaldırmak. 1 mL PBS içinde konidial pelletini ve 1 bir hemasitometre kullanarak konıdi sayısı: 1000 seyreltme (1: 100 ve daha sonra 1:10). CO ile 3.6 x 10 6 / mL 2 bağımsız ortamı konidial konsantrasyonu ayarlama, 4 ° C 'de folyo ve mağaza sarın.
NOT: conidia şimdi AF633 ile etiketlenir ve FLARE Konidyumların olarak anılacaktır. - İsteğe bağlı: şişmiş conidia uyarma gerekli ise, konıdi (adım 2.9) sayıldıktan sonra, maya azot baz içinde 7.2 x 10 6 / mL (YNB) orta konıdi sulandırın ve bir 50 otoklava 4.5 ml YNB ortamına 500 uL konidial süspansiyon eklemek mL Erlenmeyer şişesine. Kapak ve 6 saat boyunca bir çalkalama inkübatöründe (37 ° C'de 200 rpm) içine yerleştirilir.
- bir 15 ml tüp orta aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 805 x g'de santrifüj edildi ve PBS içinde bir kez yıkayın. 1 ml CO tekrar santrifüj ve tekrar süspansiyon pelet 3.6 x 10 6 conidia / ml veren 2 bağımsız ortam.
Not: Doğru zor sayım yapma şişmiş olduktan sonra Konidyumlar sık simlenirler o c hesaplamak için tavsiye edilirkullanılan konidyayı dinlenme ounted sayıları.
- bir 15 ml tüp orta aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 805 x g'de santrifüj edildi ve PBS içinde bir kez yıkayın. 1 ml CO tekrar santrifüj ve tekrar süspansiyon pelet 3.6 x 10 6 conidia / ml veren 2 bağımsız ortam.
İnsan nötrofil ve monositlerin 3. İzolasyon
- etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 mL'lik iki kan tüplerine sağlıklı gönüllülerden venöz kan 20 mL çizin. ayrı ayrı her bir donör, bir 50 ml tüp içinde 20 ml kan dökün ve 15 ml PBS ile seyreltilir.
- bir şırınga ve demir iğne ile lenfosit izolasyonu çözeltisi (yoğunluk 1.077 g / ml), 15 mL kan altına koymak. Tüpün alt kısmında iğne yerleştirilir ve hafifçe lenfosit izolasyonu çözüm zorlar. bir fren ve düşük bir ivme ile 20 dakika boyunca 630 x g'de santrifüjleyin.
- PBS, buz üzerinde soğutulmuş hazırlayın.
NOT: 3.4 Adımları ve 3.5 monositleri (3.4) ve nötrofil (3.5) üretmek için eşzamanlı takip edilmelidir. - Bir pastette kullanarak, Hücre katmanı hasat. Bu san serumu (üst) ve şeffaf bir lenfosit izolasyonu çözeltisi (alt) tabakası arasında merkezi bir tabakadır veyeni bir 50 mL tüp içine aktarılır.
- 10 dakika boyunca 582 x g'de 50 soğuk PBS ile mL santrifüj PBMC ile tüp doldurun. Süpernatantı ve başlangıçta kullanılan verici kanı 20 mL başına 1 mL PBS içinde soğuk PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez yıkanır.
- PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. Bir hemasitometre ile hücre sayımı.
- ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) ve HBSS, 500 mL, 0.5 M EDTA, 2.1 mL 26 ml ilave edilerek bir tampon çözeltisi hazırlayın. 1 x 10 7 hücre başına tampon solüsyonu 40 uL, 10 515 x g'de dakika ve tekrar süspansiyon hücreleri santrifüjleyin.
- 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın ve 1 x 10 7 hücre başına CD14 mikro boncuklar 10 uL eklenir, iyice karıştırılır ve her 5 dakikada bir tüpler karıştırmak için emin, 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
- 1 x 10 7 hücreleri ve cen başına tampon çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler yıkanır10 dakika boyunca 515 x g'de trifuge.
- Aspire süpernatantı tamamen ve tampon çözeltisinin 500 uL kadar x 01-10 Ağustos hücreleri tekrar süspansiyon.
- üreticinin talimatlarına göre bir manyetik ayırıcı numune başına 1 sütun yerleştirin. Birinci tampon çözeltisi 500 uL ile bir kez kolon yıkayın.
- , Kolon boyunca hücre süspansiyonu 500 ul pipet kuru sütun bekleyin ve tampon çözeltisi ile üç kez tekrarlayarak yıkayın.
- sütununun altında yeni bir 15 ml tüp yerleştirilir ve manyetik ayırıcı kapalı sütun alır. Daha sonra tampon çözeltisi 1 mL tüp içine sütunun üzerinden hücreleri yıkayın.
- 10 dakika boyunca 515 x g'de tampon çözeltisi ve santrifüj 4 mL ekleyin ve sonra Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında, 1 mL de yeniden süspanse edin.
- PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. bir ile hücre sayımıhemositometre.
- RPMI 6 x 10 5 / mL hücre konsantrasyonuna ayarlamak ve 35 mm cam tabanlı görüntüleme tabağına 200 uL tohum. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- Ertesi gün, görüntü vermeden önce, RPMI kaldırıp CO 2 bağımsız ortamın 200 uL ekleyebilir.
Not: Bu monositler de önce görüntüleme çeşitli makrofaj alt kümeleri içine ayırt edilebilir. Bu keşfedilmeyi bir tekniktir ise, mükemmel bir başlangıç noktası Ohradanova-Repic ark son kağıdıdır. 1 1.
- Hücre katmanı hasat sonrasında serum tümünü kaldırmak ve lenfosit izolasyonu çözümün en, ancak bu nötrofillerin en içerecektir kırmızı topağı üzerine küçük beyaz bant kaldırmak için dikkatli olun.
- NH4CI 83 g ve steril 1 L su içinde KHCO 3 10 g eklenerek 10x hipotonik lizis tampon stok hazırlayın. 4 ° 'de saklayınC.
- steril su ile bu stok 10x seyreltin ve tüpler ekleyin. Sonra, dikkatle 3 kez ters ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe.
- buz içinde 10 dk için hipotonik liziz tamponu içinde 10 dakika ve tekrar süspansiyon için 394 x g'de santrifüjleyin.
- 394 x g'de santrifüj ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır. Donör başına CO2 bağımsız orta 1 mL içinde süspanse edin.
- PBS 160 uL ve tripan mavisi 20 uL hücre süspansiyonu 20 uL eklenmesiyle sayım 1:10 dilüsyonları yapılır. Bir hemasitometre ile hücre sayımı.
- Akış sitometrisi için 6 x 10 5 / mL konsantrasyonu ayarlamak ve 24 gözlü bir levhaya 400 uL hücre süspansiyonu ekleyin. mikroskopi için, 35 mm cam tabanlı görüntüleme çanak aynı hücre süspansiyonu 200 uL ekleyin.
Nötrofil görüntüleme veya uyarılmamış bırakılırsa apoptosise maruz nedeniyle eğilimi hemen başlatılmalıdır akış sitometrisi: unutmayın. Bu değilse olası nötrofiller üzerinde tutulmalıdırBuz ve (aynı gün içinde) en kısa zamanda kullanılır.
4. Akış Sitometri
- 24 gözlü filtre plakasının içindeki hücrelere, 1.2 x 10 6 / ml FLARE conidia 200 uL ekleyin ve daha sonra 20 ug / mL, vorikonazol, 100 uL ilave edin. RPMI 300 uL ilave edin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 16 saat boyunca inkübe edilir.
NOT: Vorikonazol Konidıal çimlenmeyi önlemek için eklenir. - 25 uM'lik bir son konsantrasyon için, her bir kuyucuğa 1 mM Kalkofluor beyaz stok solüsyonu 25 uL ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 10 dakika süre ile inkübe edilir.
- 10 dakika boyunca 582 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve PBS ile iki kez yıkayın.
- Yapışkan hücreler (monositler) hasat etmek için, her bir göze, 3 mM EDTA içeren PBS içinde 1 ml ilave edilir ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 10 dakika süre ile inkübe edilir. Yavaşça bir tüp içinde hücreleri pipetleme plaka kapalı hücreleri yıkayın ve toplayın.
- PB FACS tamponunda bir kez yıkayın (% 2 cenin dana serumuS) ve daha sonra FACS analizi için FACS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.
- FACS analizi için, ilk akış sitometresi dengeleme parametrelerini ayarlamak ve bir renk ile konidia içeren tek renkli dengeleme boruları kullanılarak pozitif kapıları, set: DsRed + conidia, AF633 + conidia ve Kalkofluor Beyazı + conidia (4.2 gibi üretilen).
- Set serbest conidia kapısı ileri dayanan ve yan dağılım hiçbir renk ile konidyayı kullanarak. ücretsiz conidia kapısı hariç tutarak ön ve yan saçılma üzerine hücre kapısı ayarlayın.
- 10.000 olayları kaydederek örnek tüp analiz edin.
NOT: Canlı Konidyumların ilişkili Hücreler + ve AF633 + dsRed edilecektir. Ölü Konidyumların ile ilişkili hücreler AF633 + sadece olacaktır. dsRed- ve AF633- olacak konidianıri meşgul değil Bystander hücreleri. conidia-yapan hücre popülasyonlan, Pasifik Mavi kanalında Kalkofluor Beyazı boyama için analiz edilir. içselleştirilmiş olan Kalkoflor Beyaz + olacak hücrelerinin dışında kalan Konidyumlar ve Konidyumların olacakKalkoflor Beyaz-.
5. Canlı Hücre video Mikroskopi
Mikroskop seçimi yerel olarak mevcut ne bağlı olacaktır, ancak bir mikroskop kurulum, ters evre, DsRed (532/561 nm) ve AF633 için 37 ° C ve uygun uyarım / emisyon filtreleri ısıtılmış bir kazanı dahil etmek gerekir: Not (633 nm). FLARE konıdı dsRed için 532/561 nm lazer yerine 488 nm lazer ile çalışmaz. Bu ilk kez bu deney yaparken, dip fluor ışıması bakımından test taşmasını DsRed ve AF633 kanallar arasında hiçbir renk ve tek bir renk ile kontrol konıdi kullanın.
- Deney öncesi bir mikroskop ısıtıcı açın ve çevresel kontrol bölmesi 37 ° C ye ısınmasına için yeterli bir süre sağlar. stabilize edilmesi için bir oda sıcaklığı için geçen zaman, farklı mikroskop kurulumları için değişecektir.
- Mikroskop ve bilgisayar ve lo açınreklam görüntüleme yazılımı. Mikroskop sahnede görüntüleme tabak monte ve insan nötrofil veya monositleri bulmak için odağı ayarlayın.
- dsRed ve AF633 için, edinim ayarlarında 1 s% 10 ve maruz kalma süresine lazer gücü ayarlayın.
- Görüntüleme slayt çıkarın ve 100 uL ilave 3 x 10 6 / ml FLARE uygun kuyulara konidial süspansiyon (toplam hacim 300 uL / oyuk). Konidyumların dişe eklenir fişeği süresi olarak kaydedilir.
- sahneye slayt dönün ve açıkça konidianıri görüyor ancak görüntüyü overexpose değil dsRed ve AF633 için kamera hassasiyetini ayarlayın. Çok noktalı edinimi gerekiyorsa bir sahne noktaları listesi oluşturun.
- Tüm noktalar odakta olduğunda, kanallar optimize edilmiştir ve döngü süresi ve süresi ayarlanır görüntüleme başlayın. Çevrim süresi ve görüntüleme süresi deneysel soruya bağlıdır. hedef 1 dakika ŞTT derinlemesine analiz için izin mümkün olan en kısa (≤2 dakika) çevrim süresini tutmaktırAKE dinamiği.
Representative Results
Temsilci sonuçlar açıklanan protokol izlenerek gösterilmektedir. Şekil 1, insan nötrofil ve FLARE conidia temsili bir 6 saat canlı hücre bir video göstermektedir. onlar AF633 (Eflatun) ile etiketlendi ise dsRed (kırmızı) Konidyumların kendileri tarafından ifade edilir.
Canlı ve ölü FLARE konidia arasındaki farkı gösteren, Şekil 1 'de gösterildiği gibi Şekil 2, benzer bir film tek bir zaman noktasında bir görüntü olup. Ölü konıdı parlak AF633 (eflatun) floresan korurken dsRed (kırmızı) sinyali kaybederek canlı Konidyumların ayırt edilir. A. fumigatus conidia genellikle 6 üzerinde saat fagositler içinde hayatta. Bu nedenle, etkin bir grafik olarak gösteren Şekil 3'te 16 saatlik bir inkübasyon dönemi için gösterilmiştir akış sitometrisi, öldürme ölçmek için. Bu veriler, bir alveolar makrofaj ce elde edilmiştirancak bir örnek olarak ll hattı herhangi bir hücre türü ile gerçekleştirilebilir. Şekil 4'te migrasyonu da insan nötrofil uyarıldıktan ve aynı zamanda bunların hız ve yön hareketinin ilk saat içinde gösterilir. Şekil 5, Şekil 6, hif içine çimlenme conidia sayısını gösterir ise 1, 2, 3 ya da daha fazla konıdi yutan nötrofil ve monosit yüzdesini göstermektedir.
Şekil 1: İnsan nötrofillerin ve FLARE Konidyumların Canlı hücre, video mikroskobu filmi. Nötrofiller insan kanından izole edilmiş ve 1 'lik bir oranda CO2 bağımsız ortam içinde parlama conidia ile birlikte ekilmiştir: sırasıyla 3. Görüntüleme dönen bir disk konfokal mikroskop ile 37 ° C 'de, doğrudan başlatıldı. Çıkan 6 saatlik bir süre içinde 1 dakika ve 55 saniye aralıklarla ele geçirildi. Ölçek çubuğu 10 um =.videoda yakınlaştırılmış bir sol üst kısımdaki DIC ile FLARE Konidyumların rolünü açıklığa kavuşturmak için ayrılmış kanalları ile gösterilir, sağ üstteki dsRed (kırmızı) alt, AF633 (yeşil) sol ve sağ alt kısımdaki birleştirilmiş Video . Bu videoyu indirmek için tıklayın.
Şekil 2: Tek zaman noktalı görüntü canlı ve ölü FLARE konidia arasındaki farkı gösteren. İnsan nötrofilleri FLARE konidia ile uyarılır ve bir döner disk konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir. Bir görüntü üretilen filmlerin alındı. Onların AF633 floresan (: sol alt yeşil) korurken sinyal: Ölü konıdı onların dsRed (sağ üst kırmızı) kaybetti tarafından hif ayırt edilir. Için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 3: Niceleme ve fagositoz ve A. fumigatus conidia öldürülmesi doğrulama. vorikonazol mevcudiyetinde 16 saat: 1 oranında fare alveoler makrofaj hücreleri (MH-S) 'nin 1 genışlemenın conidia ile inkübe edilmiştir. Canlı conidia'sı ile ilişkili MH-S hücreleri kırmızı kapısı (DsRed + AF633 +) gösterilmiştir. Ölü conidia'sı ile ilişkili MH-S hücreleri mavi kapısı (DsRed-AF633 +) gösterilmiştir. Bystander MH-S hücreleri altın kapısı gösterilmektedir. Kalkofluor Beyazı, mantar hücresi duvarına bağlanan bir hücre-geçirgen olmayan floresan boya, hücre dışı konıdi hücre içi conidia dan (Kalkofluor Beyazı +) (Kalkofluor Beyaz) ayırt etmek için kullanılır. yöntem için fazladan bir doğrulama olarak, 2 uM sitokalasin D ile tedavinin MH-S hücreleri ile konidial alımını inhibe gösterilmiştir.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan nötrofil ve A. fumigatus conidia karşı monositlerin Göç. Nötrofiller insan kanından izole edilmiş ve 1 'lik bir oranda CO2 bağımsız ortam içinde parlama conidia ile birlikte ekilmiştir: sırasıyla 3. Görüntüleme dönen bir disk konfokal mikroskop ile 37 ° C 'de, doğrudan başlatıldı. Görüntüler 6 saatlik bir süre boyunca 1 dk ve 55 ler aralıklarla ele geçirildi. Alan başına tüm bireysel insan nötrofil göçü el 1 saat boyunca, (A) ve şişmiş (B) konıdi dinlenme karşı izleme yazılımı kullanılarak takip edilmiştir. Veriler, aynı verici her bir durum için hücre 1 çatıyı temsil etmektedir. Kıvrımlı faktörü (C) directio bir ölçüsüdürnihai hareketi ve hızı (D) daha sonra, aynı yazılım kullanılarak ölçülür. 3 donör 2 bağımsız deney içinde donör başına 30 hücreleri ile gösterilmiştir için ortalama ± SEM. *: P <0.05 (Welch düzeltilmiş t testi). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5: İnsan nötrofil ve monosit A. fumigatus conidia fagositozu. Sırasıyla, 3: nötrofiller ve monositler 1 'lik bir oranda, insan kanından izole edilmiş ve CO2 bağımsız ortam içinde parlama conidia ile birlikte ekilmiştir. Görüntüleme dönen bir disk konfokal mikroskop ile 37 ° C 'de, doğrudan başlatıldı. Çıkan 6 saatlik bir süre içinde 1 dakika ve 55 saniye aralıklarla ele geçirildi. Fagositoz hücreleri içeren miktarı olarak ölçülmüştürstimülasyon 4 saat sonra FLARE konıdi ing. Veriler 3 vericiden ve 2 bağımsız deney içinde donör başına 3 çerçeveleri ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 6: nötrofiller ve monositler tarafından A. fumigatus conidia çimlenme inhibisyonu. Sırasıyla, 3: nötrofiller ve monositler 1 'lik bir oranda, insan kanından izole edilmiş ve CO2 bağımsız ortam içinde parlama conidia ile birlikte ekilmiştir. Görüntüleme dönen bir disk konfokal mikroskop ile 37 ° C 'de, doğrudan başlatıldı. Görüntüler 6 saatlik bir süre boyunca 1 dk ve 55 ler aralıklarla ele geçirildi. Mantar çimlenme inhibisyonu mikrop vardı konidia yüzdesi ile ölçerek muayene edilmiştireş-kültür, 2, 4 ve 6 saat sonra yanarsa. Veriler 3 vericiden ve 2 bağımsız deney içinde donör başına 3 çerçeveleri ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Bu yöntem, bir floresan Aspergillus raportör (havşa) konıdi, canlı hücre görüntülemesi kullanılarak, A. fumigatus karşı insan primer fagositlerin antifungal aktiviteye çalışma ve akış sitometrisi için bir in vitro yöntem, yenilikçi tarif etmektedir. Daha önceki çalışmalar, hem fare deneysel mantar enfeksiyonu in vivo ve antifungal bağışıklık 6, 7 in vitro değerlendirilmesi içinde parlama konıdi kullanılarak katma değeri göstermiştir. Bu yeni nesil canlı hücre görüntüleme tekniği ile FLARE konidyalarını birleştiren in vitro dinamik etkileşimler sırasında bireysel Konidyumların uygulanabilirliğini ölçmek için bir kurulum için izin verir.
tarif edilen yöntem, mantarlara karşı tepkiler bağışıklık bazı hücre hücresel süreçlerin belirli roller ve önemini araştırmak için potansiyele sahiptir. muzdarip spesifik hastaların fagositlerin Buna ek olarak, anti-mantar tepkilerbağışıklık sisteminde tanımlanan tek bileşenli kusurlar daha detaylı olarak değerlendirilebilir. Çok erken ve ilk antifungal tepkiler sürekli görüntüleme 6 saatin üzerinde ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu tür mantar doğru fagosit göç hızı olarak, hatta küçük farklar tespit edilecek sağlar, içselleştirme oranları, geleneksel fagositoz yöntemler kullanılarak undistinguishable olacağını mantar öldürücü olayların 12, dinamikleri.
Herhangi bir hücre türü, bu yöntem ile kullanılabilir; Bu fagositler A. fumigatus 13 karşı insan solunum yollarında savunma birinci ve ikinci hatlar oluşturmaktadır çünkü burada kullanılan hücre tipi seçildi. İlginç bir şekilde, çok açık farklılıklar monositler ve nötrofiller dinlenme ve şişmiş Konidyumların ve hif nasıl etkileşimde arasında gözlemlenebilir. Nötrofiller çok daha göçmen aktivite göstermektedirler ederken monositler pek, Konidyumların göç ederler. Ek floresan marBu tip bağışıklık hücreleri üzerinde canlı ölü belirteçleri olarak kers Aspergillus ile etkileşimleri aşağıdaki fagosit yaşam süresinde anlayış sağlamak için deneye dahil edilebilir. Bu teknoloji için ilginç potansiyel gelecek uygulamalar farklı konakçı hücre tipleri ko-kültür, mantar karşıtı yanıtlar için sonuçlar (örneğin, bir epitelyal tek tabaka, birlikte nötrofiller monosit türevli dendritik hücreler üzerinde makrofajlar) ve reaktif gerçek zamanlı ölçüm Aspergillus ile uyarımı takiben oksijen türlerinin üretilmesi veya nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu.
DsRed (532/561 nm) ve AF633 (bir ters evre, bir mikroskop, 37 ° C 'de sabit bir kazanı ve uyarma / emisyon filtreleri: birkaç nokta Bu protokol, her şeyden laboratuar gerekli kurulum kullanmak not edilmesi gerekir 633 nm). m sırasında özellikle ilgili (odak hücrelerin tutmak ve yağ daldırma korumak için mikroskop kabiliyetiUlti nokta alım) nedeniyle görüntülemenin uzun süreli periyodik olarak izlenmelidir. Mantara karşı olan etkinlik ölçümü için tesisler gereklidir akım sitometri. Buna ek olarak, uygun kurumsal etik onaylar sağlıklı bir vericiden ve hasta alınan kan örneklerinden ve genetik olarak manipüle mantar çalışmak yerine olması gerekir. Kuvvetle hücre canlılığı artırmak ve işlevselliği korumak için taze kan örnekleri (aynı gün kullanılmasını) kullanılması önerilir. İdeal olarak, hücrelerin izolasyonu kan örneklerinden sonra derhal gerçekleştirilir ve nötrofiller izole edildikten sonra hemen görüntülenmiş.
A.fumigatus açıklanmıştır karşı Sonuç olarak, yeni nesil canlı hücre görüntüleme tekniği harika detay fagosit antifungal aktiviteye değerlendirmek. Bu teknoloji Aspergillus'a karşı erken doğal bağışıklık savunmasının bireysel hücre-mantar etkileşimleri eşsiz bir bakış sağlayabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Tıbbi Mikoloji Mantar İmmünoloji (SFB, jmb, JK, AW) - Bu çalışma MRC ve Aberdeen Üniversitesi (Tıp Mikoloji için MRC Merkezi) tarafından ve Wellcome Trust Stratejik Ödülü tarafından desteklenmektedir. Özel bir Chloe'nin fonundan destek verilir teşekkür ederim. TMH NIH hibe P30 CA008748 tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (NIH, kod RO1 093808) ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nden bir hibe ile desteklenmektedir. Buna ek olarak, TMH Burroughs Wellcome Fonu tarafından desteklenen Enfeksiyon Hastalıkları PATOGENEZİNDEKİ bir araştırmacı. Biz onların yardım ve destek için Aberdeen Mikroskopi ve Histoloji Tesisi teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
