Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a atividade antifúngica de células imunes humanas primárias em tempo real usando fluorescente Aspergillus repórter conídios em conjunto com microscopia de vídeo ao vivo de células e citometria de fluxo. Dados gerados fornecer informações sobre hospedeiras cell- interacções Aspergillus tais como actividade fungicida, a fagocitose, a migração de células e inibição do crescimento de fungos.
Abstract
Aspergillus fumigatus é um fungo patogénico oportunista causando infecções invasivas em hospedeiros imunocomprometidos, com uma elevada taxa de letalidade. Investigação investigar respostas imunológicas contra A. fumigatus, foi limitada pela falta de ensaios consistentes e fiáveis para a medição da actividade anti-fúngica de células imunes específicas in vitro. Um novo método é descrito para avaliar a actividade anti-fúngica dos monócitos e neutrófilos primários a partir de dadores humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescente repórter Aspergillus conídios (queimador). Estes conídios conter um repórter dsRed geneticamente codificado, que é constitutivamente expressa pela conídios ALARGAMENTO vivo, e são externamente marcadas com Alexa Fluor 633, que é resistente à degradação no interior do fagolisossoma, permitindo assim uma distinção entre os conídios de A. fumigatus vivo e morto. microscopia de vídeo e citometria de fluxo são posteriormente usados para visualizar o Interactião entre conídios e células imunitárias inatas, avaliar a actividade fungicida ao mesmo tempo, proporcionando uma riqueza de informação sobre a migração dos fagócitos, a fagocitose e a inibição do crescimento de fungos. Esta nova técnica já forneceu excitantes novos insights sobre a interação patógeno-hospedeiro de células imunes primárias contra A. fumigatus. É importante notar a configuração laboratório necessário para realizar este ensaio, incluindo a microscopia necessário e citometria de fluxo instalações, e a capacidade para trabalhar com sangue do dador humano e fungos geneticamente manipuladas. No entanto, este ensaio é capaz de gerar grandes quantidades de dados e pode revelar insights detalhados para a resposta anti-fúngico. Este protocolo foi utilizado com êxito para estudar a interacção hospedeiro-patogénio de células imunitárias primárias contra A. fumigatus.
É importante observar a configuração de laboratório necessário para executar este ensaio, incluindo a microscopia necessário e citometria de fluxo facilities, e a capacidade para trabalhar com sangue do dador humano e fungos geneticamente manipuladas. No entanto, este ensaio é capaz de gerar grandes quantidades de dados e pode revelar insights detalhados para a resposta anti-fúngico. Este protocolo foi utilizado com êxito para estudar a interacção hospedeiro-patogénio de células imunitárias primárias contra A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus é um fungo patogénico oportunista e causa fúngica mais comum de infecções pulmonares invasivas no hospedeiro imunocomprometido 1, 2. Entender como as células imunológicas do hospedeiro reconhecer e eliminar Aspergillus é uma importante área de pesquisa de fungos, no entanto, os ensaios de fungicidas atualmente disponíveis têm limitações significativas. Métodos comumente usados para medir a actividade fungicida incluem ensaios colorimétricos e determinação de unidades formadoras de colónias 3, 4. No entanto, tais métodos proporcionam informação sobre a viabilidade fúngica num único ponto de tempo, em vez de visualizar a interacção dinâmica entre hospedeiro e agente patogénico. Por conseguinte, estes métodos não podem ter em conta o facto de um fungo foi eliminado ou simplesmente (temporariamente) restrito em crescimento ou a actividade metabólica. Nós desenvolvemos um método capaz de observar fungiciactividade dal directamente enquanto captura simultaneamente a informação detalhada em relação a fagocitose, a migração dos fagócitos e inibição do crescimento de fungos.
Anteriormente, um protocolo foi publicado utilizando imagiologia em tempo real como um meio para medir a fagocitose de Candida albicans por uma linha de células de macrófago de ratinho 5. Este conceito tem sido agora mais desenvolvida para resolver as lacunas de conhecimento em nossa compreensão das interacções Aspergillus com células do sistema imunológico, utilizando conídios 6, 7, 8 fluorescente repórter Aspergillus (queimador). Estes conídios expressar um fluoróforo vermelho (dsRed) e são marcadas com um segundo fluoróforo (Alexa Fluor 633). Uma vez que um conídios FLARE é morto, ele pára de produzir dsRed e os restantes dsRed desaparece, enquanto o AF633 permanece fluorescente e estar vinculado ao conídios. Isso cria uma distinção clara entre fu vivos e mortoscélulas NGAL durante imagens de células vivas e citometria de fluxo, permitindo também o acompanhamento do destino dos conídios indivíduo após a sua interação com células do sistema imunológico.
Os ensaios descritos proporcionam um método eficaz de visualizar a interacção entre células do sistema imunológico do hospedeiro e Aspergillus e vai ser de valor considerável no esclarecimento das vias de sinalização celulares responsáveis por mecanismos efectores antifúngicos em células imunitárias inatas. Outras aplicações incluem a visualização como alterações no crescimento de Aspergillus, tais como o interruptor de descanso para os conídios inchado, ou a partir de conídios inchado para hifas, afectar o reconhecimento e função de fagócitos.
O protocolo que se segue descreve detalhadamente como a obtenção de monócitos humanos e neutrófilos; como preparar os conídios FLARE; e como capturar suas respostas com vídeo microscopia e citometria de fluxo. Embora a utilização de células imunitárias humanas isoladas a partir de sangue do doador é descrita aqui, estatécnica provou igualmente eficazes usando uma variedade de populações de células de murino.
Protocol
O protocolo para a obtenção de neutrófilos e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) é baseada em métodos publicados anteriormente 9. O uso de amostras de sangue de voluntários saudáveis foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa humana da Universidade de Aberdeen. Antes de começar certifique-se todas as aprovações éticas estão no local para a retirada de sangue de voluntários saudáveis e / ou pacientes com a finalidade do experimento descrito. Manter as células no gelo sempre que possível para aumentar a sua sobrevivência.
1. A. fumigatus Cultura e Condições
- Prepare meio de ágar mínimo de glucose tal como descrito 10.
- Ajustar meios para pH 6,5 usando NaOH 1 M e autoclave a 120 ° C durante 20 min.
- Deixa-se arrefecer para 65 ° C.
- Trabalhando numa cara de fluxo estéril, verter 30 mL de meio arrefecido em um frasco T75 e deixa-se arrefecer com o gargalo do frasco que descansa sobre uma pipeta de 25 ml a create uma inclinação agar.
- Streak a dsRed Af293- estirpe de A. fumigatus no agar e incubar durante 7 dias a 37 ° C + 5% de CO 2. Dois frascos irá produzir cerca de 10 9 conídios em 5 mL de solução salina de fosfato tamponada (PBS) pré-biotinilação.
2. A. fumigatus e Rotulagem Preparação
Nota: Ao realizar este ensaio, pela primeira vez, preparar o parental Af293- estirpe de A. fumigatus. Retirar amostras de ambas as estirpes em tubos de microcentrífuga e etiquetar apenas um de cada estirpe, como descrito abaixo. Isso permitirá que se tenha conídios controle sem cor e conídios com uma única cor, ou dsRed ou AF633, para testar a configuração e equipamentos.
- Colheita A. fumigatus conidia por imersão da cultura com 30 mL de PBS + 0,05% Tween-80. Filtra-se a suspensão resultante através de um filtro celular de 40? M para um tubo de 50 mL para remover fragmentos de hifas.
- Centrifuge a 805 xg durante 10 min, remover o sobrenadante e lava-se uma vez em 20 ml de PBS estéril. conídios piscina a partir de duas placas da mesma estirpe durante o passo de lavagem.
- Seguindo o passo de lavagem, ressuspender o sedimento em 5 mL de PBS e de transferência de alíquotas de 1 ml de suspensão de conídios em tubos de microcentrífuga. 1 ml de suspensão de cada estirpe é geralmente suficiente para a imagem de células vivas. Enrole as alíquotas restantes na folha e armazenar a 4 ° C.
- alíquotas de centrífuga de suspensão de conídios a 9300 xg durante 10 min à temperatura ambiente e cuidadosamente remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de conídios 0,05 M de NaHCO3, pH 8,3.
- Preparar 10 mg biotina / 200 mL de dimetilsulfóxido solução estoque (DMSO) através da reconstituição de 25 mg de biotina em 500 uL de DMSO. Adicionar 10 uL de biotina / solução de estoque de DMSO ao tubo de microcentruga, a cobertura em folha de alumínio e incuba-se durante 2 horas num agitador rotativo a 4 ° C.
- Alíquota o restante da biotina / DMSO estoque solution e congelar a -20 ° C para utilização em experiências subsequentes.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de Tris-HCl pH 8,0 100 durante 1 h para desactivar biotina livre flutuação.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Lava-se a pelete duas vezes com 1 mL de PBS estéril e ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS.
- Dissolve-se 1 mg de estreptavidina-AF633 em 0,5 mL de PBS para fazer uma solução estoque a 2 mg / mL. Adicionar 10 ul de 2 mg / mL de estreptavidina-AF633 por 1 ml de suspensão de conídios e incubar durante 40 min à temperatura ambiente num agitador rotativo coberto de folha de alumínio. O restante Estreptavidina-AF633 pode ser congelada em alíquotas para utilização em experiências subsequentes.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg e remover cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de conídios em 1 mL de PBS e contar os conídios usando um hemocitómetro a uma diluição de 1: 1000 (1: 100 e, em seguida, 01:10). Ajustar a concentração de conídios de 3,6 x 10 6 / mL com CO2 meios independentes, enrole em tiras e armazenar a 4 ° C.
NOTA: Os conídios são agora rotulados com AF633 e será referido como conídios FLARE. - Opcional: Se é necessária a estimulação com conídios inchado, após a contagem de conídios (passo 2.9), dilui-se conídios de 7,2 x 10 6 / mL em base de azoto de levedura meio (YNB) e adicionar 500 uL de suspensão de conídios de 4,5 ml de meio YNB em um autoclave 50 mL Erlenmeyer. Cobrir e colocar o balão em um incubador com agitação (200 rpm a 37 ° C) durante 6 h.
- Transferir o meio para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 805 xg durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se uma vez em PBS. Centrifugar novamente e ressuspender o pellet em 1 ml de CO 2 forma independente, dando 3,6 x 10 6 conídios / ml.
Nota: Os conídios frequentemente aglutinar depois que se tornam inchados fazendo preciso contar difícil, é aconselhável para calcular com o counted números de conídios descansando utilizados.
- Transferir o meio para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 805 xg durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se uma vez em PBS. Centrifugar novamente e ressuspender o pellet em 1 ml de CO 2 forma independente, dando 3,6 x 10 6 conídios / ml.
3. Isolamento de neutrófilos humanos, e monócitos
- Desenhar 20 ml de sangue venoso de voluntários saudáveis em dois tubos de 10 mL de sangue, contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Para cada doador separadamente, verter 20 mL de sangue em um tubo de 50 ml e dilui-se com 15 mL de PBS.
- Subjazia o sangue com 15 mL de uma solução de isolamento de linfócitos (densidade 1,077 g / mL) com uma agulha de seringa e ferro. Coloque a agulha na parte inferior do tubo e suavemente forçar a solução de isolamento de linfócitos para fora. Centrifugar a 630 xg durante 20 min sem travão e baixo aceleração.
- Prepare PBS, arrefecidas em gelo.
NOTA: As etapas 3,4 e 3.5 devem ser seguidos simultaneamente para gerar monócitos (3.4) e (3.5) neutrófilos. - Usando um pastette, colher a camada de PBMC. Esta é a camada no centro entre o soro amarelo (superior) e a solução transparente isolamento dos linfócitos camada (inferior), etransferir para um tubo de 50 ml fresco.
- Encher o tubo com o PBMC até 50 mL com PBS frio e centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS frio e ressuspender em 1 ml de PBS por 20 ml de sangue de doadores utilizados inicialmente.
- Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro.
- Prepara-se uma solução tampão por adição de 26 ml de soro inactivado por calor de vitelo fetal (FCS) e 2,1 mL de EDTA 0,5 M a 500 ml de HBSS. Centrifugar as células durante 10 min a 515 x g e ressuspender em 40 ul de solução tampão por 1 x 10 7 culas.
- Transferir a suspens celular para um tubo de 15 mL e adicionar 10 ul de microesferas de CD14 por 1 x 10 7 culas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C, certificando-se de misturar os tubos a cada 5 min.
- Lave as células por adição de 1 mL de solução tampão por 1 x 10 7 culas e centrifuge a 515 xg durante 10 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 1 x 10 8 culas em 500 uL de solução tampão.
- Coloque 1 coluna por amostra em um separador magnético de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro lava-se a coluna uma vez com 500 uL de solução tampão.
- Pipetar 500 uL de suspensão de células através da coluna, esperar para a coluna secar e em seguida lavar, repetindo esta três vezes com solução tampão.
- Colocar um novo tubo de 15 mL por baixo da coluna e levar a coluna fora do separador magnético. Em seguida, lavar as células para fora da coluna dentro do tubo com 1 mL de solução tampão.
- Adicionar 4 ml de solução tampão e centrifugar a 515 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender em 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio.
- Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com umhemocitômetro.
- Ajustar a concentração de células de 6 x 10 5 / ml com RPMI e semear 200 mL num prato de imagiologia à base de vidro de 35 mm. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2.
- No dia seguinte, antes da imagem, remover o meio RPMI e adicionar 200 uL de CO 2 forma independente.
Nota: Estes monócitos também podem ser diferenciadas em vários subconjuntos de macrófagos antes da imagiologia. Se esta é uma técnica a ser explorada, é um excelente ponto de partida é o artigo recente de Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Após a colheita da camada de PBMC, remover todo o soro e a maior parte da solução de isolamento de linfócitos, mas ter cuidado para não remover a pequena faixa branca no topo do sedimento vermelho como esta irá conter a maior parte dos neutrófilos.
- Preparar um estoque de tampão 10x hipotónico a lise por adição de 83 g de NH4Cl e 10 g de KHCO3 em 1 L de água estéril. Armazenar a 4 °C.
- Diluir esta 10x estoque com água estéril e adicioná-lo aos tubos. Em seguida, inverter cuidadosamente 3 vezes e incubar em gelo durante 15 min.
- Centrifugar a 394 xg durante 10 min e ressuspender em tampão de lise hipotónico durante 10 min em gelo.
- Centrifugar a 394 xg e lavar duas vezes com PBS frio. Ressuspender em 1 ml de CO 2 forma independente por doador.
- Fazer diluições 1:10 para contagem por adição de 20 uL da suspensão de células a 160 ul de PBS e 20 uL de azul de tripano. Contar as células com um hemocitómetro.
- Por citometria de fluxo, para ajustar a concentração de 6 x 10 5 / ml e adicionar a suspensão de células de 400 ul de uma placa de 24 poços. Para a microscopia, adicionar 200 uL da mesma suspensão de células para uma placa de imagiologia à base de vidro de 35 mm.
Nota: imagiologia de Neutrófilos ou citometria de fluxo deve ser iniciado imediatamente devido à sua propensão para sofrer apoptose, se não estimuladas. Se isso não for possível neutrófilos deve ser mantido emgelo e utilizadas o mais rapidamente possível (dentro de um mesmo dia).
4. Citometria de Fluxo
- Adicionar 200 ul de 1,2 x 10 6 / mL conídios ALARGAMENTO para as células na placa de 24 poços, e, em seguida, adiciona-se 100 mL de 20 ug / mL de voriconazol. Adicionar 300 uL de meio RPMI e incubados durante 16 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
NOTA: O voriconazol é adicionado para evitar a germinação de conídios. - Adicionam-se 25 uL de uma solução de estoque 1 mM Calcofluor-branco para cada poço para uma concentração final de 25 uM e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Centrifugar a 582 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e lava-se duas vezes com PBS.
- Para colher as células aderentes (monócitos), adicionar 1 ml de PBS com EDTA a 3 mM a cada poço e incubar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. Com cuidado, lavar as células para fora da placa por pipetagem e recolher células em um tubo.
- Lavar uma vez em tampão de FACS (soro de vitelo fetal a 2% a PBS), e em seguida ressuspender em tampão FACS para análise de FACS.
- Para a análise FACS, primeiro ajustar os parâmetros de compensação do citetro de fluxo e configurado portões positivos usando tubos de compensação de cor única, incluindo conídios sem cor: dsRed + conídios, AF633 + conídios, e Calcofluor Branco + conídios (gerado como em 4.2).
- Definir porta conídios livre com base em dispersão frontal e lateral usando conídios sem cor. Definir porta célula em dispersão frontal e lateral, excluindo a porta conídios livre.
- Analisar tubo de amostra através da gravação de 10.000 eventos.
NOTA: As células associadas com conídios ao vivo será dsRed + e AF633 +. Células associadas com conídios morto será apenas AF633 +. células espectador que não se envolveram conídios será dsRed- e AF633-. As populações de células envolvidos-conídios são ainda analisados por coloração com Calcofluor branco no canal azul do Pacífico. Conídios que permanecem fora das células será calcofluor Branco +, e conídios que foram internalizados seráCalcofluor White-.
5. celular Vivo Vídeo Microscopy
Nota: A escolha de microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara ambiental aquecida a 37 ° C e os filtros de excitação / emissão adequados para dsRed (532/561 nm) e AF633 (633 nm). conídios FLARE não funcionam com o laser de 488 nm, em vez do laser 532/561 nm para dsRed. Ao realizar esta experiência para esta primeira vez, utilizar os conídios de controlo sem cor e de cor única para testar para a fluorescência de fundo e a infiltração entre a dsRed e canais AF633.
- Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente para aquecer a 37 ° C. O tempo necessário para estabilizar a temperatura da câmara para variará para diferentes configurações do microscópio.
- Ligue o microscópio e computador, e eisanúncio do software de imagem. Monte o prato de imagem no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os neutrófilos ou monócitos humanos.
- Para dsRed e AF633, defina a potência do laser para 10% e tempo de exposição a 1 s nas configurações de aquisição.
- Remover o slide de imagem e adicionar 100 uL de 3 x 10 6 / mL de suspensão de conídios ALARGAMENTO aos poços apropriados (volume total de 300 ul / poço). Anote o tempo que se alargam conídios são adicionados ao prato.
- Devolver o slide para o palco e ajustar a sensibilidade da câmera para dsRed e AF633 para ver claramente os conídios, mas não expor demais a imagem. Configurar uma lista de pontos de estágio se a aquisição multi-ponto é necessária.
- Comece imaginando quando todos os pontos estão em foco, os canais são otimizados e o tempo de ciclo e duração está definida. O tempo de ciclo e a duração da imagem depende da questão experimental. O objectivo é manter o tempo de ciclo tão curto quanto possível (≤2 min) com um min permitindo uma análise em profundidade de UPTdinâmica ake.
Representative Results
Os resultados representativos são mostrados seguindo o protocolo descrito. A Figura 1 ilustra um vídeo ao vivo de células 6 h representante com neutrófilos humanos e conídios ALARGAMENTO. dsRed (vermelho) é expressa pelos próprios conídios enquanto eles foram rotulados com AF633 (Magenta).
A Figura 2 é uma imagem a partir de um único ponto de tempo a partir de um filme semelhante ao exibido na Figura 1, que ilustra a diferença entre os conídios ALARGAMENTO vivo e morto. conídios mortas são distinguidos de conídios ao vivo por perder o seu sinal dsRed (vermelho), mantendo uma fluorescência AF633 brilhante (magenta). A. fumigatus conídios muitas vezes sobreviver dentro fagócitos para mais de 6 h. Portanto, para quantificar de forma eficaz a matar, a citometria de fluxo são mostrados parcelas durante um período de incubação de 16 h na Figura 3. Estes dados foram obtidos com uma ce macrófagos alveolaresA linha ll como um exemplo, mas pode ser realizada com qualquer tipo de célula. Na Figura 4, a migração é mostrado na primeira hora de estimulação para os neutrófilos humanos, bem como a sua velocidade e movimento direccional. A Figura 5 mostra a percentagem de neutrófilos e monócitos que ingeriram 1, 2, 3 ou mais conídios enquanto a Figura 6 mostra o número de conídios que germinam em hifas.
Figura 1: Em células vivas, filme microscopia vídeo de neutrófilos humanos e conídios FLARE. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 h. Escala da barra = 10 m.Um ampliada em vídeo é mostrado com os canais separados para esclarecer o papel da conídios ALARGAMENTO com DIC no canto superior esquerdo, dsRed (vermelho) no canto superior direito, AF633 (verde) no canto inferior esquerdo e o vídeo incorporada no canto inferior direito . Por favor clique aqui para baixar este vídeo.
Figura 2: Imagem ponto de tempo único demonstrando a diferença entre conídios FLARE ao vivo e morto. Os neutrófilos humanos foram estimulados com conídios ALARGAMENTO e fotografada com um microscópio confocal de fiação disco. Uma imagem foi tirada dos filmes gerados. conídios mortas são distinguidos de hifas por ter perdido a sua dsRed (vermelho: superior direito) do sinal, mantendo a sua fluorescência AF633 (verde: inferior esquerdo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação e validação de fagocitose e morte de conídios de A. fumigatus. Mouse células de macrófagos alveolares (MH-S) foram incubadas com conídios queima, em uma proporção de 1: 1 durante 16 horas na presença de voriconazol. culas MH-S associados com conídios vivo são mostrados na porta vermelho (+ dsRed AF633 +). culas MH-S associados com conídios mortas são mostrados no portão azul (dsRed-AF633 +). células espectador MH-S estão apresentados na porta de ouro. Calcofluor White, um corante fluorescente de células-impermeável que se liga à parede da célula fúngica, é usado para distinguir os conídios extracelular (Branco Calcofluor +) a partir de conídios intracelular (Calcofluor White-). Como uma validação extra para o método, é mostrado que o tratamento com 2 uM citocalasina D inibe a captação de conídios por culas MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A migração de neutrófilos humanos, e monócitos contra conídios de A. fumigatus. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 horas. Migração de todos os neutrófilos humanos individuais por campo foi manualmente rastreados usando software de rastreamento que descansa contra o (A) e inchada (B) conídios durante 1 h. Os dados representam uma estrutura de células para cada condição do mesmo dador. O factor sinuosos (C), uma medida de directiomovimento nal, e velocidade (D) foram, então, quantificada usando o mesmo software. Média ± SEM para 3 dadores são mostrados com 30 células por doador mais de 2 expericias independentes. *: P <0,05 (teste t de Welch corrigido). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fagocitose de conídios de A. fumigatus por neutrófilos humanos, e monócitos. Os neutrófilos e os monócitos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 h. Fagocitose foi medida como a quantidade de células contêming ALARGAMENTO conídios após 4 h de estimulação. Os dados são apresentados como média ± EPM de 3 dadores e 3 quadros por doador mais de 2 expericias independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Inibição da germinação de A. fumigatus conidia por neutrófilos e monócitos. Os neutrófilos e os monócitos foram isolados a partir de sangue humano e semearam-se em conjunto com conídios ALARGAMENTO em CO 2 forma independente a uma razão de 1: 3, respectivamente. A visualização foi iniciada directamente a 37 ° C com um microscópio confocal de fiação disco. As imagens foram captadas a intervalos de 1 min e 55 s ao longo de um período de 6 horas. A inibição da germinação dos fungos foi examinado através da medição da percentagem de conídios que tinha germeinated após 2, 4 e 6 h de co-cultura. Os dados são apresentados como média ± EPM de 3 dadores e 3 quadros por doador mais de 2 expericias independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este método descreve um inovador método in vitro para estudar a actividade anti-fúngica de fagócitos primários humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescente repórter Aspergillus (queimador) conídios, imagens de células vivas e citometria de fluxo. Estudos anteriores demonstraram o valor acrescentado de utilizar ALARGAMENTO conídios tanto in vivo em infecção fúngica experimental murino e avaliação in vitro da imunidade anti-fúngico 6, 7. Combinando ALARGAMENTO conídios com esta técnica de imagem de células vivas próxima geração permite uma configuração para medir a viabilidade de conídios individual durante as interacções dinâmicas in vitro.
O método descrito tem o potencial para investigar as funções específicas e importância de certos processos celulares de células imunes em suas respostas antifúngicas. Em adição, as respostas antifúngicas de fagócitos de pacientes que sofrem de específicosdefeitos de componentes individuais definidos no seu sistema imune pode ser avaliado em maior pormenor. Muito respostas antifúngicas primeiros e iniciais podem ser estudadas em grande detalhe ao longo de 6 h de imagiologia contínua. Isto permite que, mesmo para diferenças subtis a ser detectada, tal como a velocidade de migração dos fagócitos para o fungo, as taxas de internalização, dinâmica de eventos fungicidas 12, o que seria indistinguível usando métodos convencionais de fagocitose.
Qualquer tipo de célula pode ser usada com este método; os tipos celulares utilizadas aqui foram seleccionados porque estes fagócitos constitui a primeira e segunda linhas de defesa das vias aéreas humanas contra A. fumigatus 13. Curiosamente, as diferenças muito claros pode ser observado entre a forma como monócitos e neutrófilos engatar com conídios de repouso e inchado e hifas. Monócitos dificilmente migram para conídios, enquanto neutrófilos exibir atividade muito mais migratória. mar fluorescente adicionalkers tais como marcadores vivos mortos nas células imunes pode ser incluído no ensaio, para proporcionar perspectivas sobre a sobrevivência de fagócitos seguinte interacções com Aspergillus. Interessantes aplicações potenciais futuras para esta tecnologia incluem a co-cultura de diferentes tipos de células hospedeiras, as consequências para respostas anti-fúngicos (por exemplo, macrófagos sobre uma monocamada epitelial, células dendríticas derivadas de monócitos em conjunto com os neutrófilos), e a medição em tempo real da reactivo produção de espécies de oxigénio ou de neutrófilos formação armadilha extracelular após a estimulação com o Aspergillus.
Alguns pontos precisam de ser observado ao utilizar este protocolo, acima de tudo a configuração laboratório necessário: um microscópio com uma fase invertida, uma câmara ambiental estável a 37 ° C, e de excitação / emissão para filtros dsRed (532/561 nm) e AF633 ( 633 nm). A capacidade do microscópio para manter as células em foco e reter a imersão em óleo (particularmente relevante durante multi-ponto aquisição) deve ser monitorizada periodicamente devido à longa duração da imagiologia. Para a quantificação da actividade fungicida citometria de fluxo instalações são necessários. Além disso, aprovações institucionais e éticos apropriados precisam estar no lugar para trabalhar com dador saudável e as amostras de sangue do paciente e fungos derivados geneticamente manipulados. É altamente recomendável para utilizar amostras de sangue fresco (utilização no mesmo dia) para aumentar a viabilidade celular e preservar a funcionalidade. Idealmente, o isolamento de células é realizada imediatamente após a tiragem de amostras de sangue e os neutrófilos são fotografada imediatamente após o isolamento.
Em conclusão, uma técnica de imagem de células vivas próxima geração de avaliar em grande actividade antifúngica detalhe fagócitos contra A. fumigatus é descrito. Esta tecnologia pode fornecer uma perspectiva única sobre as interacções celulares-fúngicos individuais no início de defesas imunitárias inatas contra Aspergillus.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo MRC e da Universidade de Aberdeen (MRC Centro de Micologia Médica) e pela Award Estratégico Wellcome Trust - Micologia Médica fúngica Imunologia (SFB, JMB, JK, AW). Um agradecimento especial é dada ao apoio do Fundo Chloe. TMH é apoiado por um subsídio do Instituto Nacional de Saúde (NIH, código RO1 093.808) e do Memorial Sloan Kettering Cancer Center é suportado pelo NIH P30 concessão CA008748. Além disso, TMH é um investigador na patogênese da doença infecciosa apoiado pelo Fundo Burroughs Wellcome. Queremos agradecer a Aberdeen Microscopia e Facility Histologia pela sua ajuda e apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
