यहाँ, हम लाइव सेल वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में फ्लोरोसेंट एस्परजिलस संवाददाता conidia का उपयोग कर वास्तविक समय में प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन और प्रवाह cytometry के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। उत्पन्न डेटा ऐसे कवकनाशी गतिविधि, phagocytosis, सेल प्रवास और कवक विकास के निषेध के रूप में मेजबान सेल एस्परजिलस बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक एक उच्च केस-मृत्यु दर के साथ प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान में आक्रामक संक्रमण के कारण रोगज़नक़ है। ए fumigatus के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच रिसर्च इन विट्रो में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऐंटिफंगल गतिविधि को मापने के लिए सुसंगत और विश्वसनीय परीक्षणों की कमी के द्वारा सीमित किया गया है। एक नई विधि प्राथमिक monocytes और फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia का उपयोग कर ए fumigatus के खिलाफ मानव दाताओं से न्यूट्रोफिल की ऐंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के वर्णन किया गया है। ये conidia एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग dsRed संवाददाता, जो constitutively लाइव चमक conidia द्वारा व्यक्त किया जाता है, और बाह्य एलेक्सा Fluor 633 है, जो phagolysosome भीतर गिरावट के लिए प्रतिरोधी है, इस प्रकार लाइव और मृत ए fumigatus conidia के बीच एक अंतर की इजाजत दी का लेबल लगा होता है। वीडियो माइक्रोस्कोपी और फ्लो बाद में सहभागिता कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता हैconidia और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच आयन, जबकि भी भक्षककोशिकीय प्रवास, phagocytosis और कवक विकास के निषेध पर जानकारी का खजाना उपलब्ध कराने कवकनाशी गतिविधि का आकलन। इस उपन्यास तकनीक पहले से ही ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में रोमांचक नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यह प्रयोगशाला इस परख करते हैं, आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित और सुविधाओं प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक सेटअप, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए नोट करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
यह प्रयोगशाला आवश्यक माइक्रोस्कोपी सहित इस परख करने के लिए आवश्यक सेटअप, ध्यान दें और च प्रवाह cytometry के लिए महत्वपूर्ण हैacilities, और क्षमता मानव दाता रक्त और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने के लिए। हालांकि, इस परख डेटा की बड़ी मात्रा पैदा करने में सक्षम है और ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया में विस्तृत जानकारी प्रकट कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ए fumigatus के खिलाफ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Aspergillus fumigatus एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ और प्रतिरक्षा में अक्षम मेजबान 1, 2 में आक्रामक फेफड़ों में संक्रमण का सबसे आम कवक कारण है। समझना कैसे मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहचानने और एस्परजिलस को समाप्त फंगल अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है, तथापि, वर्तमान में उपलब्ध कवकनाशी assays महत्वपूर्ण सीमाओं की है। कवकनाशी गतिविधि को मापने का आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों वर्णमिति assays और कॉलोनी के गठन इकाइयों 3, 4 के निर्धारण में शामिल हैं। हालांकि, इस तरह के तरीकों से एक ही बार बिंदु पर नहीं बल्कि मेजबान और रोगज़नक़ के बीच गतिशील बातचीत को देखने की तुलना में फंगल व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। तदनुसार, इन तरीकों है कि क्या एक कवक मार दिया गया है या बस (अस्थायी) विकास या चयापचय गतिविधि में प्रतिबंधित खाते में नहीं ले सकते। हम एक विधि को देख fungici करने में सक्षम विकसित किया हैसीधे दाल गतिविधि, जबकि एक साथ phagocytosis, भक्षककोशिकीय प्रवास और कवक विकास के निषेध से संबंधित विस्तृत जानकारी पर कब्जा।
इससे पहले, एक प्रोटोकॉल एक माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन 5 से कैंडिडा एल्बीकैंस के phagocytosis को मापने के लिए एक साधन के रूप में वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग प्रकाशित हुआ था। इस अवधारणा को अब फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia 6, 7, 8 का उपयोग करके प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एस्परजिलस बातचीत की हमारी समझ में ज्ञान अंतर को पाटने का आगे विकसित किया गया। ये conidia एक लाल फ्लोरोफोरे (dsRed) व्यक्त करने और एक दूसरे फ्लोरोफोरे (एलेक्सा Fluor 633) के साथ लेबल रहे हैं। एक बार एक चमक conidium मार दिया जाता है, यह dsRed उत्पादन बंद हो जाता है और शेष dsRed fades, जबकि AF633 फ्लोरोसेंट और conidia के लिए बाध्य बनी हुई है। इस लाइव और मृत फू के बीच स्पष्ट अंतर पैदा करता हैलाइव सेल इमेजिंग के दौरान ngal कोशिकाओं और प्रवाह cytometry, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत निम्न अलग-अलग conidia के भाग्य की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है।
वर्णित assays मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एस्परजिलस के बीच बातचीत के चित्रण के एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं और सेलुलर संकेत दे रास्ते में सहज प्रतिरक्षक कोशिकाओं में ऐंटिफंगल प्रेरक तंत्र के लिए जिम्मेदार नहीं पायें में काफी मूल्य का होगा। अन्य अनुप्रयोगों visualizing कैसे इस तरह के सूजन conidia के लिए, या सूजन conidia से हाईफे के लिए आराम कर रहा से स्विच के रूप में एस्परजिलस विकास में परिवर्तन,, भक्षककोशिकीय मान्यता और समारोह को प्रभावित शामिल हैं।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल विस्तार मानव monocytes और neutrophils प्राप्त करने के लिए कैसे में वर्णन करता है; कैसे चमक conidia तैयार करने के लिए; और कैसे वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ अपनी प्रतिक्रिया पर कब्जा और प्रवाह cytometry के लिए। हालांकि मानव प्रतिरक्षा दाता रक्त से अलग कोशिकाओं के उपयोग यहाँ, इस वर्णन किया गया हैतकनीक murine सेल आबादी की एक किस्म का उपयोग समान रूप से प्रभावी साबित कर दी है।
इस विधि फ्लोरोसेंट एस्परजिलस रिपोर्टर (चमक) conidia, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग ए fumigatus के खिलाफ मानव प्राथमिक फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल गतिविधि का अध्ययन करने और प्रवाह cytometry के लिए इन विट्रो विधि में एक अभिनव वर्णन करता है। पिछले अध्ययनों से दोनों murine प्रयोगात्मक फंगल संक्रमण में विवो में और ऐंटिफंगल प्रतिरक्षा 6, 7 की इन विट्रो मूल्यांकन में चमक conidia का उपयोग करने का भी अतिरिक्त मूल्य का प्रदर्शन किया है। इस अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक के साथ चमक conidia के संयोजन इन विट्रो में गतिशील बातचीत के दौरान अलग-अलग conidia की व्यवहार्यता को मापने के लिए एक सेटअप के लिए अनुमति देता है।
वर्णित विधि संभावित उनके ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं पर विशिष्ट भूमिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कुछ कोशिकीय प्रक्रियाओं के महत्व की जांच के लिए है। इसके अलावा, से पीड़ित विशिष्ट रोगियों से फ़ैगोसाइट की ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाएंउनकी प्रतिरक्षा प्रणाली में परिभाषित एकल घटक दोष अधिक विस्तार में मूल्यांकन किया जा सकता। बहुत जल्दी और प्रारंभिक ऐंटिफंगल प्रतिक्रियाओं निरंतर इमेजिंग के 6 घंटे से अधिक महान विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है। , Internalization दरों, कवकनाशी घटनाओं 12 है, जो पारंपरिक phagocytosis तरीकों का उपयोग कर समाधान के अयोग्य हो जाएगा की गतिशीलता इस तरह के कवक की ओर भक्षककोशिकीय प्रवास के वेग के रूप में, यहां तक कि सूक्ष्म अंतर का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है।
किसी भी प्रकार की कोशिका इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है; क्योंकि इन फ़ैगोसाइट ए fumigatus 13 के खिलाफ मानव वायुमार्ग में रक्षा की पहली और दूसरी लाइनों का गठन सेल यहां इस्तेमाल किया प्रकार चयन किया गया था। दिलचस्प बात यह है बहुत स्पष्ट मतभेद कैसे monocytes और न्यूट्रोफिल आराम और सूजन conidia और हाईफे के साथ संलग्न के बीच मनाया जा सकता है। Monocytes शायद ही जबकि न्यूट्रोफिल और अधिक प्रवासी गतिविधि प्रदर्शित, conidia के लिए चले जाते हैं। अतिरिक्त फ्लोरोसेंट मार्चइस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर लाइव मृत मार्कर के रूप में kers भक्षककोशिकीय अस्तित्व एस्परजिलस के साथ बातचीत निम्नलिखित में अंतर्दृष्टि प्रदान करने परख में शामिल किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए दिलचस्प संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों विभिन्न प्रकार मेजबान सेल के सह संस्कृति, ऐंटिफंगल प्रतिक्रिया के लिए परिणाम शामिल हैं (उदाहरण के लिए, एक उपकला monolayer, monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान न्यूट्रोफिल के साथ एक साथ कोशिकाओं पर मैक्रोफेज), और प्रतिक्रियाशील के वास्तविक समय माप ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन या न्युट्रोफिल कोशिकी जाल गठन एस्परजिलस साथ उत्तेजना के बाद।
एक औंधा चरण के साथ एक खुर्दबीन, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पर्यावरण कक्ष स्थिर, और उत्तेजना / dsRed (532/561 एनएम) और AF633 (के लिए उत्सर्जन फिल्टर: कुछ अंक इस प्रोटोकॉल, सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगशाला आवश्यक सेटअप का उपयोग करने पर ध्यान दिया जाना करने की जरूरत है 633 एनएम)। माइक्रोस्कोप की क्षमता मीटर के दौरान विशेष रूप से प्रासंगिक ध्यान में कोशिकाओं रखने के लिए और तेल विसर्जन बनाए रखने के लिए (ulti सूत्री अधिग्रहण) इमेजिंग की लंबी अवधि के कारण समय-समय पर निगरानी की जानी चाहिए। कवकनाशी गतिविधि की मात्रा के लिए प्रवाह cytometry सुविधाओं की आवश्यकता है। साथ ही, उचित संस्थागत और नैतिक अनुमोदन जगह स्वस्थ दाता और रोगी व्युत्पन्न रक्त के नमूनों और आनुवंशिक रूप से चालाकी से कवक के साथ काम करने में होने की जरूरत है। यह दृढ़ता से ताजा रक्त के नमूने (एक ही दिन में उपयोग) का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए और कार्यक्षमता संरक्षित करने के लिए सिफारिश की है। आदर्श रूप में, कोशिकाओं के अलगाव रक्त के नमूने ड्राइंग के तुरंत बाद किया जाता है और neutrophils अलगाव के बाद तुरंत imaged कर रहे हैं।
अंत में, एक अगली पीढ़ी को लाइव सेल इमेजिंग तकनीक काफी विस्तार भक्षककोशिकीय ऐंटिफंगल गतिविधि में आकलन करने के लिए के खिलाफ ए fumigatus वर्णन किया गया है। यह तकनीक एस्परजिलस के खिलाफ जल्दी सहज प्रतिरक्षा गढ़ में अलग-अलग सेल कवक बातचीत में एक अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
मेडिकल माइकोलॉजी फफूंद इम्यूनोलॉजी (SFB, जेएमबी, जे, ऐडवर्ड्स) – यह काम एमआरसी और एबरडीन विश्वविद्यालय (मेडिकल माइकोलॉजी के लिए एमआरसी केंद्र) द्वारा और वेलकम ट्रस्ट सामरिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है। एक विशेष धन्यवाद क्लो निधि से समर्थन करने के लिए दिया जाता है। टीएमएच स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (एनआईएच, कोड RO1 093,808) और मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर से अनुदान एनआईएच अनुदान P30 CA008748 द्वारा समर्थित है द्वारा समर्थित है। साथ ही, टीएमएच संक्रामक रोग के रोगजनन बरोज़ वेलकम फंड द्वारा समर्थित में एक अन्वेषक है। हम उनकी मदद और समर्थन के लिए एबरडीन माइक्रोस्कोपी और प्रोटोकॉल सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
15 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
50 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |