Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma antisvampaktivitet av primära humana immunceller i realtid med hjälp av fluorescerande Aspergillus reporter konidier i samband med live-cell video mikroskopi och flödescytometri. Genererade data ge insikt i värd cell- Aspergillus interaktioner såsom fungicid aktivitet, fagocytos, cellmigration och inhibition av svamptillväxt.
Aspergillus fumigatus är en opportunistisk svamppatogen orsakar invasiva infektioner hos immunförsvagade värdar med hög case-dödlighet. Forskning undersöker immunologiska svar mot A. fumigatus har begränsats av bristen på enhetliga och tillförlitliga analyser för mätning av den antifungala aktiviteten av specifika immunceller in vitro. En ny metod beskrivs för att bedöma den antifungala aktiviteten hos primära monocyter och neutrofiler från humana donatorer mot A. fumigatus användning av fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) konidier. Dessa konidier innehålla en genetiskt kodad dsRed reporter, som konstitutivt uttrycks av levande FLARE konidier, och är utvändigt märkt med Alexa Fluor 633, som är resistent mot nedbrytning i fagolysosomen, vilket möjliggör en distinktion mellan levande och döda A. fumigatus konidier. Video mikroskopi och flödescytometri därefter används för att visualisera Interactjon mellan konidier och medfödda immunceller, bedöma fungicid aktivitet samtidigt som den ger en mängd information om fagocyt migration, fagocytos och inhiberingen av svamptillväxt. Denna nya teknik har redan nya spännande insikter i värd patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus. Det är viktigt att notera laboratoriet installation krävs för att utföra denna analys, inklusive nödvändiga mikroskopi och flödescytometri möjligheter och förmåga att arbeta med mänskliga givarblod och genmanipulerade svampar. Emellertid är denna analys med förmåga att generera stora mängder data och kan avslöja detaljerade insikter i det svampmotverkande svar. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att studera värd-patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus.
Det är viktigt att notera laboratoriet installation krävs för att utföra denna analys, inklusive nödvändig mikroskopi och flödescytometri facilities, och förmåga att arbeta med mänskliga givarblod och genmanipulerade svampar. Emellertid är denna analys med förmåga att generera stora mängder data och kan avslöja detaljerade insikter i det svampmotverkande svar. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att studera värd-patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus.
Aspergillus fumigatus är en opportunistisk svamp patogen och den vanligaste svamp orsaken till invasiva lunginfektioner i immunförsvagade värden 1, 2. Att förstå hur värdimmunceller känner igen och eliminera Aspergillus är ett viktigt område för svamp forskning, men de för närvarande tillgängliga svampdödande analyser har betydande begränsningar. Vanligen använda metoder för mätning av fungicid aktivitet inkluderar kolorimetriska analyser och bestämning av kolonibildande enheter 3, 4. Emellertid sådana metoder ger information om svamp viabilitet vid en enda tidpunkt i stället för att visa det dynamiska samspelet mellan värd och patogen. Således kan dessa metoder inte tar hänsyn till om en svamp har dödats eller helt enkelt (tillfälligt) begränsad tillväxt eller metabolisk aktivitet. Vi har utvecklat en metod som kan observera fungicidal aktivitet direkt samtidigt fånga detaljerad information om fagocytos, fagocyt migration och hämning av svamptillväxt.
Tidigare var ett protokoll publicerades med hjälp realtidsavbildning som ett medel för att mäta fagocytos av Candida albicans medelst en musmakrofagcellinje 5. Detta koncept har nu utvecklats ytterligare för att ta itu med kunskapsklyftan i vår förståelse av Aspergillus interaktioner med immunceller genom att använda fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) conidia 6, 7, 8. Dessa konidier uttrycka en röd fluorofor (dsRed) och är märkta med en andra fluorofor (Alexa Fluor 633). En gång i FLARE konidium dödas, slutar det producerande dsRed och resterande dsRed bleknar, medan AF633 förblir fluorescerande och bundna till konidier. Detta skapar en tydlig åtskillnad mellan levande och döda fuNGAL celler under levande cell imaging och flödescytometri, och möjliggör spårning av ödet för individuella konidier efter deras interaktion med immunceller.
De beskrivna analyser tillhandahåller en effektiv metod för att visualisera interaktionen mellan värdimmunceller och Aspergillus och kommer att vara av betydande värde vid unraveling de cellulära signalvägar som är ansvariga för antifungala effektormekanismer i medfödda immunceller. Andra användningsområden är att visualisera hur förändringar i Aspergillus tillväxt, såsom övergången från vilande till svullna conidia, eller från svullen konidier till hyfer, påverkar fagocyter igenkänning och funktion.
Följande protokoll beskriver i detalj hur man erhålla humana monocyter och neutrofiler; hur man förbereder FLARE konidier; och hur man fångar sina svar med video mikroskopi och flödescytometri. Även om användningen av humana immunceller isolerade från givarblod beskrivs här, dettateknik har visat lika effektiva med hjälp av olika murina cellpopulationer.
Denna metod beskriver en innovativ metod in vitro för att studera den antifungala aktiviteten hos humana primära fagocyter mot A. fumigatus användning av fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) konidier, levande cell imaging och flödescytometri. Tidigare studier har visat den adderade värdet av att använda FLARE konidier både in vivo i murin experimentell svampinfektion och in vitro bedömning av svampmotverkande immunitet 6, 7. Kombinering FLARE konidier med denna nästa generation levande cell imaging teknik medger en setup för att mäta viabiliteten hos individuella konidier under dynamiska interaktioner in vitro.
Det beskrivna förfarandet har potential för att undersöka de specifika roller och betydelsen av vissa cellulära processer av immunceller på deras antifungala responser. Dessutom svampdödande svar fagocyter från specifika patienter som lider avdefinierade enstaka defekter komponent i deras immunsystem kan bedömas i större detalj. Mycket kan studeras tidiga och initiala antifungala responser i detalj under 6 h av kontinuerlig avbildning. Detta möjliggör även subtila skillnader som skall detekteras, såsom hastigheten hos fagocytsystemet migrering mot svampen, internalisehastigheter, dynamik fungicida händelser 12, vilket skulle vara undistinguishable användning av konventionella fagocytos metoder.
Alla celltyper skulle kunna användas med denna metod; de celltyper som används här valdes ut eftersom dessa fagocyter utgör de första och andra försvarslinjerna i de humana luftvägarna mot A. fumigatus 13. Intressant nog kan observeras mycket tydliga skillnader mellan hur monocyter och neutrofiler samarbeta med vila och svullen konidier och hyfer. Monocyter knappast migrera till konidier, medan neutrofiler uppvisar mycket flyttande aktivitet. Ytterligare fluorescerande markers såsom levande-död markörer på immunceller kan inkluderas i analysen för att ge insikter i fagocyt överlevnad efter interaktioner med Aspergillus. Intressanta potentiella framtida tillämpningar för denna teknologi inkluderar samodling av olika värdcelltyper, konsekvenserna för antifungala responser (t ex makrofager på ett epitelialt monoskikt, monocythärledda dendritiska celler tillsammans med neutrofiler), och realtids-mätning av reaktiv syreproduktion art eller neutrofil extracellulär fälla bildning efter stimulering med Aspergillus.
Några punkter måste noteras att använda detta protokoll, främst laboratoriet installation krävs: ett mikroskop med en inverterad stadium, en miljökammare stabil vid 37 ° C, och excitation / emissionsfilter för dsRed (532/561 nm) och AF633 ( 633 nm). Förmågan hos mikroskopet för att hålla cellerna i fokus och kvarhålla oljeimmersion (särskilt relevant under multi-punkt förvärv) bör kontrolleras periodiskt på grund av den långa varaktigheten av avbildning. För kvantifiering av svampdödande aktivitet flödescytometri anläggningar krävs. Dessutom lämpliga institutionella och etiska godkännanden måste vara på plats för att arbeta med frisk donator och patient härrör blodprov och genmanipulerade svampar. Det rekommenderas starkt att använda färska blodprover (använd samma dag) för att öka cellernas livskraft och bevara funktionalitet. Idealt, är isolering av celler utförs omedelbart efter dragning blodproven och neutrofiler avbildas omedelbart efter isoleringen.
Avslutningsvis, till ett nästa generations levande cell avbildningsteknik bedöma i detalj fagocyt antimykotisk aktivitet mot A. fumigatus beskrivs. Denna teknik kan ge en unik inblick i enskilda cellsvamp interaktioner i tidiga medfödda immunförsvar mot Aspergillus.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har stötts av MRC och University of Aberdeen (MRC Centrum för medicinsk mykologi) och Wellcome Trust Strategic Award – Medicinsk mykologi Svamp Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Ett särskilt tack ges till stöd från Chloe fonden. TMH stöds av ett bidrag från National Institute of Health (NIH, kod RO1 093.808) och Memorial Sloan Kettering Cancer Center stöds av NIH bidrag P30 CA008748. Dessutom är TMH en utredare i patogenesen av Smittskydds stöds av Burroughs Wellcome Fund. Vi vill tacka Aberdeen mikroskopi och histologi Facility för deras hjälp och stöd.
Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
15 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
50 ml Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |