Summary
Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.
Abstract
Fluorescentiemicroscopie (LSFM), in combinatie met chemische clearingprotocollen, is de gouden standaard geworden voor het analyseren van fluorescent gelabelde structuren in grote biologische proefpersonen, en is van toepassing op cellulaire resolutie. De constante verfijning van de onderliggende protocollen en de verbeterde beschikbaarheid van gespecialiseerde commerciële systemen maken ons in staat om de microstructuur van hele muisorganen te onderzoeken en zelfs de karakterisering van cellulaire gedrag in verschillende live-imaging benaderingen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een protocol voor de ruimtelijke full-mount visualisatie en kwantificering van de CD45 + leukocytenpopulatie in ontstoken muisharten. De methode maakt gebruik van een transgene muisstam (CD11c.DTR) die recentelijk is aangetoond dat het een robuust, inducerend model is voor de studie van de ontwikkeling van fulminante fatale myocarditis, gekenmerkt door dodelijke hartritmestoornissen. Dit protocol omvat myocarditis inductie, intravitusAl antilichaamgemedieerde celkleuring, orgaanbereiding en LSFM met daaropvolgende computerondersteunde beeldbehandeling. Hoewel het voorgesteld is als een zeer aangepaste methode voor onze specifieke wetenschappelijke vraag, is het protocol de blauwdruk van een gemakkelijk verstelbaar systeem dat ook volledig andere fluorescerende structuren in andere organen en zelfs in andere soorten kan richten.
Introduction
Tijdens de evolutie van lichtmicroscopie verschenen er vele gespecialiseerde vormen, allemaal ontwikkeld om beperkingen in het visualisatieproces voor bepaalde exemplaren te minimaliseren. Een dergelijke methode is fluorescentiemicroscopie (LSFM) met lichte lak. Vooropgesteld in 1903 door Siedentopf en Zsigmondy 1 en het vinden van zijn eerste fundamentele biologische toepassingen in de vroege jaren negentig 2 , is LSFM uitgegroeid tot het meest krachtige microscopische hulpmiddel tot op heden voor het visualiseren van grote specimens, zoals intacte muisorganen, met een fluorescentie signaalresolutie Naar het cellulaire niveau. Vanwege deze voordelen, in combinatie met het potentieel voor live-celbeelden, noemden Nature Methods LSFM de "Method of the Year 2014 3. "
Zoals de naam suggereert, wordt de steekproefverlichting in een LSFM uitgevoerd door lichte lakens, die loodrecht op de as van de gebruikte doel f zijn gerichtOf emissie-licht collectie en daaropvolgende beeldvorming. Het lichtvel wordt gewoonlijk gegenereerd door middel van brede, gecollimeerde laserbundels met een cilindrische lens of door de snelle zijwaartse beweging van smalle, gefocusseerde laserstralen in slechts één horizontaal of verticaal vlak 4 , 5 . Op deze manier wordt alleen het brandpunt van de beeldende optica verlicht, typisch met een dikte van 1-4 μm. Bijgevolg worden voor het in het verlichtingsvlak geplaatste fluorescerende monster zowel de opwekking van verstrooid licht als de effecten van fotobladen uit gebieden boven of onder het brandpuntsvlak geëlimineerd of sterk onderdrukt 6 , 7 . Aangezien alle out-of-focus vliegtuigen niet worden verlicht, worden fotoboekeffecten in deze gebieden weggelaten. In tegenstelling tot standaard confocal- of multi-fotonmicroscopie zijn de paden van verlicht en uitgestraald licht van elkaar gescheiden, zodat de uiteindelijke beeldkwaliteit Het is niet afhankelijk van de perfecte focus van de excitatie lichtbundel door de doelstellingen. Afhankelijk van de onderliggende vraag is het dus mogelijk om doelstellingen met een enorm gezichtsveld (FOV) te gebruiken, zodat het grootste mogelijk gebied van het verlichte vliegtuig kan worden afgebeeld zonder dat onderdelen in de xy-richting bewegen.
In moderne LSFM-systemen wordt een fluorescerend beeld van de gegenereerde optische sectie vastgelegd op een zeer gevoelige lading-gekoppelde apparaat (CCD) of complementaire metalen oxide-halfgeleider (CMOS) camera's die het gehele gezichtsveld (FOV) kunnen verwerven In microseconden. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen en door het verkrijgen van afbeeldingen bij gedefinieerde z-stappen, is het dus mogelijk om de volledige 3D-informatie van een monster in een redelijke hoeveelheid tijd 8 , 9 te verkrijgen, waardoor deze techniek van toepassing is op levende cellen Studies 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Niettegenstaande, hoewel LSFM een snelle, gevoelige en fluorescentie-vriendelijke methode biedt, is lichtoverdracht door het monster nog steeds een belangrijk probleem, vooral wanneer grote biologische monsters het doel zijn voor een 3D-analyse. Lichte transmissie wordt kritisch aangepast door fysieke aspecten van absorptie en door licht verstrooiing bij interfaces van structuren met verschillende brekingsindexen 13 . Daarom, wanneer beeldvorming meerdere millimeters groot is, wordt LSFM meestal gecombineerd met clearingprotocollen om de monsters optisch transparant te maken. Deze technieken zijn gebaseerd op het idee om water uit het respectievelijke biologische weefsel te verwijderen en uit te wisselen met water- of (organisch) op oplosmiddel gebaseerde immersiemiddelen, die worden gekozen om de brekingsindexen van de specifieke doelweefselcomponenten nauwkeurig aan te passen. Als gevolg hiervan wordt laterale lichtverstrooiing geminimaliseerd, en alle golflengtenVan het licht kan veel efficiënter door het weefsel 13 passeren. In veel gevallen lijken biologische monsters op deze manier macroscopisch kristalhelder, waardoor LSFM kan worden uitgevoerd, zelfs op hele muisorganen, met behulp van lange werkafstand, lage vergrotingsdoelstellingen.
Hier presenteren we een voorbereidingsprotocol voor grootbeeldbeeldvorming in een lakvelmicroscoop (zie de tabel van materialen), die we hebben vastgesteld om het cellulaire hartinfarct te onderzoeken in een murine model van myocarditis 15 . CD11c.DTR muizen verdrijven de primaat difterie toxine receptor (DTR) onder de controle van de CD11c promotor 16 . Bijgevolg worden cellen in deze muizen die CD11c samen met de DTR uitdrukken gevoelig gemaakt voor het exotoxine van Corynebacterium difterie (difterietoxine, DTX); De systemische behandeling van deze dieren met DTX resulteert in een uitputting van alle CD11c + ceLLS. CD11c is een integrin en is als celoppervlakreceptor voor een verscheidenheid van verschillende oplosbare factoren betrokken bij activatie- en rijpingsprocessen, hoofdzakelijk in cellen van de monocytische lijn 17 . Bijgevolg is het CD11c.DTR muismodel intensief gebruikt om de rol van dendritische cellen en macrofaag subsets te bestuderen in het kader van vele verschillende immunologische vragen. Na verloop van tijd is gemeld dat CD11c.DTR-muizen die systemisch met DTX behandeld zijn, nadelige bijwerkingen kunnen ontwikkelen en sterk verhoogde sterftecijfers 18 , 19 kunnen weergeven. Onlangs konden we de onderliggende oorzaak van de dood identificeren 15 , waarin de ontwikkeling van fulminante myocarditis na de intratracheale DTX-toepassing in deze dieren werd beschreven. De toxine-uitdaging veroorzaakte cellulaire vernietiging, inclusief in de centrale delen van het stimulusoverdrachtssysteem in het hart. Dit ging gepaard met massale CD45+ Infiltratie van leukocyten, wat uiteindelijk leidt tot dodelijke hartritmestoornissen. In dit geval was niet alleen het uiterlijk van de leukocytenpopulatie belangrijk, maar ook de ruimtelijke verdeling in het hart. Deze experimentele vraag is een uitdaging voor moderne microscopische beeldvorming, die we hebben opgelost door middel van een microscopische aanpak van lichte lakens die wordt ondersteund door intravitale antilichamenverf en een optisch clearingprotocol op basis van organisch oplosmiddel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de EU-richtlijnen en werden goedgekeurd door de relevante lokale autoriteiten in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Duitsland). De dieren werden gebruikt en gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije (SPF) condities.
1. Inductie van Myocarditis door Difterie Toxine (DTX)
- Bereid de DTX oplossing voor de inductie van myocarditis door de DTX voorraadoplossing te verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1 μg / mL werkoplossing.
- Voeg 100 μl van deze oplossing intratracheaal toe (in 8 tot 10 weken oude CD11c.DTR muizen ( ongeveer 5 ng / g lichaamsgewicht (bw)), zoals blijkt uit Hasenberg et al. Voor het toepassen van een schimmelsporingsuspensie 20 .
OPMERKING: De intraperitoneale toediening van het toxine kan leiden tot een soortgelijke inductie vanFatale myocarditis. Deze aanpak zou echter eerst moeten worden gevalideerd.- Voor de toepassing anesthetiseren de dieren door een intraperitoneale (ip) injectie van 100 mg / kg bw ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine.
- Na het bereiken van diepe narcose (toonknijptest), intubeer de dieren door gebruik te maken van een 22 G inwendige veneuze katheter door de mondholte. Controleer de juiste positionering van de lensbuis door de dieren te ventileren met een ademhaling van kleine dieren met een snelheid van 250 ademhalingen per minuut en een inademingsvolume van 250 μL per adem, ook getoond door Hasenberg et. al. 20 .
OPMERKING: Bij correct positionering verandert de ademsnelheid van de dieren volgens de toegepaste ventilatie instellingen. - Ontkoppel het ventilatiesysteem en installeer de 100 μL DTX oplossing of een gelijke hoeveelheid PBS als een controle door de katheter in de long en blijf de dieren nog 1 minuut minder ventileren.
- Laat de dieren herstellen van de verdoving en monitor de algemene gezondheidsstatus en lichaamsgewichtverandering gedurende 4 dagen.
OPMERKING: Afhankelijk van de genetische achtergrond, de muisstamme of het begingewicht, kan de ernst en de aanvang van myocarditis variëren en moet eerst worden bepaald.
2. Voorbeeldvoorbereiding voor lichtevelmicroscopie
- 4 dagen na toxine applicatie verdoving de muizen door een inductie kamer te spoelen met een verdampte 2% isofluraan / zuurstof mengsel. Injecteer 15 μg van een direct gemerkt anti-CD45-antilichaam (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μl PBS intraveneus (iv) met behulp van de retro-orbitale toedieningsroute, die een zeer snelle en zeer nauwkeurige toepassing van de Juiste hoeveelheid antilichaam.
OPMERKING: De gewenste diepte van narcose is bereikt wanneer de muizen liggend zijn en reageren niet op het toetsen van de nippen. - Na 2 uur incubatie, offer de muizen door cervicale dislocatie anD de harten in situ perfuseren met 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
- Ontsteek het hart en injecteer de perfusieoplossing in de rechter ventrikel met behulp van een 21 G katheter. Perfuse met langzame, constante druk en zorg ervoor dat het bloed kan worden gedreineerd na het openen van de aorta.
OPMERKING: Deze transcardiale perfusie kan resulteren in kleine voorbereidingsartifacten, die de uiteindelijke 3D visualisatie van het orgaan kunnen storen. Daarom kunnen geavanceerde dierproeven de perfusie uitvoeren door middel van de inferieure vena cava, waarbij de abdominale aorta wordt uitgesneden.
- Ontsteek het hart en injecteer de perfusieoplossing in de rechter ventrikel met behulp van een 21 G katheter. Perfuse met langzame, constante druk en zorg ervoor dat het bloed kan worden gedreineerd na het openen van de aorta.
- Voor chemische fixatie, vul het hart door dezelfde uitsparing met 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA). Houd de katheter op zijn plaats en koppel gewoon een nieuwe spuit die met PFA is gevuld. Perfuse met langzame en constante druk.
OPMERKING: Paraformaldehydeis zeer giftig; Vermijd contact met de huid, ogen en andere slijmvliezen.- Pak het hart voorzichtig met getande tang; puLicht het een beetje naar boven; En snijd alle weefselverbindingen, inclusief de inkomende en uitgaande slagaders en aderen. Bewaar het orgaan nog eens 4 uur in 4% PFA voor verdere fixatie.
- Om het orgaan te dehydreren, incubeer het hart in een stijgende ethanol serie bij 50%, 70% en tweemaal bij 100%, elk voor 12 uur, bij 4 ° C in het donker. Gebruik hier zwarte 5 ml polypropyleen reactiebuizen, zodat ze constant in een buisrotor draaien, met behulp van een vertragingssnelheid om de luchtbellenvorming te voorkomen.
- Volledige monstervoorbereiding door chemische clearing. Om de harten transparant te maken, incubeer ze in 98% dibenzylether (DBE) terwijl u de nacht constant draait.
OPMERKING: DBE is irriterend voor de ogen, de huid en het ademhalingsstelsel.
3. Licht-microscopie
- Voer LSFM uit met behulp van de lakmicroscoop (zie de tabel van materialen). Plaats het monster op de standaard monsterhouder van de microscoop in de DBE-gevulde cuVette, die geschikt is voor specimens tot 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Houd het monster stevig vast tijdens de opname door gebruik te maken van gedroogde en verwijderde agarose blokken.
- Voor het bereiden van de agarose blokken, giet 2% gesmolten agarose in een mal (15 mm x 15 mm x 5 mm). Laat de agarose afkoelen tot het stevig is.
- Dehydrateer het in een stijgende ethanol serie (50%, 70% en tweemaal bij 100%). Incubeer de agarose blokken in de nacht in 98% DBE. Bewaar de agarose in DBE totdat het wordt gebruikt.
OPMERKING: Aangezien de agarose hoofdzakelijk uit water bestaat, kunnen de incubatietijden voor elke dehydratietrap worden verlengd, afhankelijk van de grootte van het blok.
OPMERKING: DBE is irriterend voor de ogen, de huid en de ademhalingswegen. - Wanneer nodig, snijd het bereid agarose blok naar de gewenste vorm met een scherpe scalpel. Typisch gesneden prisma- of wigvormige vormen om aan de randen van de monsteradapter te plaatsen.
OPMERKING: Aangezien de agarose blokken elastisch zijn,Het monster blijft op zijn plaats wanneer hij met weinig kracht wordt geduwd.
- Ontdek de fluorescentiesignalen van belang (hier, autofluorescentie en anti-CD45-antilichamenvervuiling) met de juiste instellingen voor excitatie- en emissiefilter.
- Voor de detectie van het verbindingsweefsel afgeleid autofluorescentie signaal, gebruik een 525/50 nm bandpas filter bij een excitatie golflengte van 488 nm (OPSL: 50 mW); CD45-kleuring met een AF647-gekoppeld antilichaam wordt gedetecteerd bij 668 nm (bandpasfilter: 680/30 nm) en bij een excitatiegolflengte van 647 nm (diode laser: 50 mW).
- Kies 4 μm als de afstand tussen de twee individuele z-vlakken.
4. Image Post-processing
OPMERKING: De verkregen digitale beeldgegevens werden verder verwerkt met een wetenschappelijke 3D / 4D beeldverwerkings- en analysesoftware (zie de tabel van materialen).
- Openen en vooraf aanpassen van de gegevensbestanden.
- Nadat u de analysesoftware hebt gestart, selecteert u de knop "Overslaan" in de linkerbovenhoek. Om de beeldstapels te openen, kies 'Bestand', 'Open' en selecteer een map die de gegevens bevat van het eerste verworven kanaal. Kies 'Bewerken' en 'Kanalen toevoegen' om verdere verworven kanalen toe te voegen.
OPMERKING: Afhankelijk van de gegevensgrootte en het computersysteem kan dit proces enkele minuten duren. Het gepresenteerde protocol toont alle stappen voor 2 acquisitiekanalen (autofluorescentie en AF647). - Corrigeer de dimensies x, y en z voxel door op "Bewerken" te klikken en "Beeldeigenschappen" te selecteren. Wanneer het nieuwe venster opent, past u de parameters aan.
OPMERKING: Deze stap hangt af van het werkende microscoopsysteem en het specifieke dataformaat. Correcte xyz-waarden zijn cruciaal voor latere afmetingen en afmetingen. In de meeste gevallen worden deze parameters opgeslagen als meta data in de micrograph bestanden. Echter, als het bestand foRmat kan niet door de analysesoftware correct geïnterpreteerd worden, het is belangrijk om de pixelgrootte handmatig in te voeren. De pixelgrootte in de x- en y-afmetingen is afhankelijk van de pixelgrootte van de camera, de potentieel toegepaste binning en de lens en objectieve vergroting. De pixelgrootte in z is gelijk aan de zelf gedefinieerde z-stap grootte ( bijv. 4 μm).
- Verplaats eerst het autofluorescentiesignaal naar grijstinten door de "Display-aanpassing" ("Bewerken" en "Weergave aanpassing van het display") te openen. In een nieuw venster worden alle geopende kanalen en de weergave-instellingen voor alle van hen weergegeven; Om de standaardkleur te wijzigen, selecteer het autofluorescentie kanaal en kies de "witte" weergavestijl. Klik op 'ok' om te solliciteren.
- Voor aanpassing op zwart niveau, ga terug naar "Beeld aanpassing" en stel de zwarte waarde in om ongewenste achtergrond signalen uit te sluiten die geen voorbeeldstructuur vertegenwoordigens.
- Om dit te doen, gebruik de bovenste linker driehoek op de balk en sleep het van links naar rechts.
OPMERKING: Wijzigingen worden onmiddellijk weergegeven. Zorg ervoor dat alleen signalen die niet van het monster afkomstig zijn, onderdrukken. Minimumwaarden op de achtergrond moeten nooit "0" zijn om pitch-black pixels te vermijden, aangezien de geluidssignalen nodig kunnen zijn voor aanvullende berekeningen. Zorg ervoor dat alle veranderingen op het zwarte niveau na het maken van een afbeelding worden uitgevoerd. Anders kan waardevolle voorbeeldinformatie verloren gaan. De black level aanpassing serveert alleen representatieve doeleinden. Om dezelfde beeldinstellingen over verschillende monsters te gebruiken, kunnen precieze waarden worden ingevoerd in het minimale numerieke veld onder de kanaallijst. Dit is zeer nuttig voor kwantitatieve analyses.
- Om dit te doen, gebruik de bovenste linker driehoek op de balk en sleep het van links naar rechts.
- Voer de intensiteitsinstelling uit, door de bovenste driehoek te gebruiken om de betreffende kanaalintensiteit aan te passen of door precieze waarden in het maximale numerieke veld onder de channe in te voerenL lijst
- Voer contrastinstelling uit door de onderste driehoek in het midden van de balk te slepen om de gamma-waarde te verhogen of te verlagen of de precieze waarden in te voeren.
- Pas het AF647 kanaal aan volgens het autofluorescentie kanaal. Als verschil, stel de visualisatie van het AF647 signaal in op een hittekaart kleur opzoek tafel. Doe dit door de kanaalmodus "brand" te kiezen in een aanpak die vergelijkbaar is met die in stap 4.2.1.
OPMERKING: Aangezien de totale signaalintensiteiten significant lager zijn dan het autofluorescentie kanaal, worden de zwarte niveaus meestal aangepast aan veel lagere waarden. Wat het autofluorescentie kanaal betreft, wordt de helderheid van dit kanaal gewoonlijk verhoogd. - Selecteer de "mix mode" om weefselstructuren in detail te visualiseren. Analyseer alle monsters uit één serie met dezelfde parameterwaarden.
- Om het orgaan voor de 3D-scene expo vrijwel te openenRt, gebruik een clipping plane op het gesmolten 3D object.
- Klik op het pictogram 'Knipperplan' (schaar) in de objectlijst. Binnen het beeldweergave verschijnt een geel kader en een manipulator (witte spindel). Draai de spindel aan het dunner einde met de muis, waardoor de oriëntatie van het knippervlak veranderd wordt en beweeg het dikker middelste deel van de spil om de gewenste diepte van de knipping te selecteren.
- Verberg het kader en de manipulator door de desbetreffende selectievakjes onder de objectlijst te vinken en de gewenste snapshots te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde LSFM benadering analyseert de leukocytenverdeling en hoeveelheid in muizenharten bij inductie van ernstige myocarditis. Figuur 1A legt het voorbehandelingsprotocol voor de transgene CD11c.DTR muizen voor myocarditis inductie uit. Deze stap vertegenwoordigt de noodzakelijke trigger voor de aanwerving van leukocyten aan het myocardium. Na een succesvolle DTX-toepassing ontwikkelen de dieren ernstige ziektebeelden, zoals algemene zwakte, anorexia en gewichtsverlies binnen het bereik van 2-4 dagen. Na 4 dagen worden leukocyten gekleurd door de iv . Toepassing van fluorochroom-gekoppeld anti-CD45 antilichaam voorafgaand aan transcardiale perfusie om het bloed uit de bloedsomloop te verwijderen. Als het succesvol wordt uitgevoerd, worden het hart en andere organen witterig. Vervolgens wordt het orgaan uitgesneden en wordt weefselwater met DBE uitgewisseld door een oplopende ethanolrij en een laatste incubatie in DBE. Figuur 1B toont het roosterVan de individuele incubatietrappen waarin het orgaan significante krimp vergt. Het chemisch gecontroleerde orgaan wordt dan overgebracht naar een DBE-gevulde beeldkamer op de standaardmicroscoop weefselhouder. Om het orgaan te stabiliseren tijdens 3D-beeldverwerving, wordt het door transparante agaroseblokken bevestigd. De gedetailleerde positionering van het monster wordt in figuur 2 weergegeven. De overname van een hele beeldstapel, bestaande uit 2 kanalen (autofluorescentie en anti-CD45) duurt ongeveer 20-30 minuten en genereert een gegevensbestand van ongeveer 16 GB. Tenslotte worden de resulterende gegevens geanalyseerd als kunstmatige 3D-weergave waarin de leukocytenverdeling in een warmmapweergave wordt weergegeven. In Figuur 3 (bovenste rij) kunnen de sterk ontstoken gebieden van een hart van een DTX behandeld dier worden gezien door hun roodachtige / witterige uitstraling. Een meer gedetailleerde studie van het 3D-model onthult de leukocytconcentratie, vooral in gebieden van het hartgeleidingssysteem, zoals de atriovent Ricular bundel en de Purkinje vezels. In tegenstelling hiermee tonen harten van PBS-behandelde dieren dit ontstekingspatroon helemaal niet (onderste rij).
Figuur 1: Schema van Inductie en Voorbeeld Bereiding van Difteria Toxine-Geïnduceerde Myocarditis. ( A ) Myocarditis ontwikkeling werd geïnduceerd door het . Toepassing van difterietoxine (100 ng / dier). Na 4 dagen was myocarditis volledig ontwikkeld en werd een AF647-gekoppeld anti-CD45-antilichaam (15 μg / dier) geïnjecteerd iv . Opsporen van CD45 + leukocyten. Dieren werden 2 uur later door cervicale dislocatie geofferd en de harten werden geperfereerd met PBS / EDTA (5 mM) gevolgd door 4% PFA. ( B ) Na verwijdering werd het orgaan gedehydrateerd met een stijgende ethanol serie en uiteindelijk gewist door incubatie in de nacht in dibenzylether..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van steekproefpositie in de microscoop. Het chemisch gecontroleerde transparante hart (4) werd op de monsterhouder (2 en 5) gepositioneerd en gestabiliseerd met behulp van gereserveerde agarose blokken (6). Dit construct werd vervolgens ondergedompeld in het DBE-gevulde glazen cuvette (3). Voor de aanschaf werd een 0,5 NA objectieflens (1) met een werkafstand van 5,5 mm gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve 3D-weergaven van geheel ofGan Light-sheet Microscopy. CD11c.DTR muizen werden intratracheaal behandeld met DTX (bovenste rij) of PBS (onderste rij). 4 dagen later werd de ontwikkeling van myocarditis, vertegenwoordigd door CD45 + leukocyteninfiltratie, geconfronteerd met fluorescentie lichte lakmicroscopie. Om de CD45 + cellen te vlek werd een anti-CD45 antilichaam gekoppeld aan AF647 geïnjecteerd iv 2 uur voordat de muizen opgeofferd werden. Het autofluorescentie signaal van bindweefsel wordt grijs weergegeven, terwijl de CD45 + infiltratie wordt weergegeven in warmmap kleuren (blauw: laag signaal, wit: hoog signaal). Elke rij bestaat uit 4 digitaal gescreepte 3D renderings, waarin de situatie in het orgaan wordt aangetoond. De clipping depth ten opzichte van het voorste gedeelte van het hart wordt boven de afzonderlijke afbeeldingen aangegeven. De figuur is gemodificeerd van Mann et al. 15 . Schaalbalk = 1 mm. Klik hier alsjeblieftOm een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de moderne levenswetenschappen speelt de microscopische visualisatie van biologische processen een steeds belangrijker rol. In deze context zijn er in de laatste twee eeuwen veel ontwikkelingen gerealiseerd die bijdragen tot het beantwoorden van vragen die niet tot dit punt kunnen worden aangepakt. Ten eerste is er een duidelijke neiging geweest om het resolutie vermogen van lichtmicroscopen fundamenteel te vergroten. Met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) 21 , 22 , gestimuleerde uitstoot (STED) microscopie 23 en foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) 24 , 25 of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) 26 , de eenmalig opgelegde resolutie beperking Om diffractie te lichten 27 was significant gebroken. De tweede vaak gerichte uitdaging was het zien van cellulaire gedrag in een omgeving die lijkt opDe natuurlijke conditie zo dicht mogelijk. In deze context werden de ontwikkelingen van in situ of in vivo beeldvormende benaderingen gedwongen. Om de beperkte lichtdoordringingsdiepte in complexe biologische weefsels te overwinnen heeft 2-fotonmicroscopie 28 , 29 nieuwe normen op dit onderzoeksveld gesteld.
Echter, een kenmerk dat al deze microscopietheorieën meestal delen, is het gebruik van hoge NA-doelstellingen om de optimale resolutie te waarborgen. Hoewel het microstructuren meer gedetailleerd oplost, beperkt het gebruik van hoge NA-doelstellingen het gezichtsveld en de werkafstand aanzienlijk. Als gevolg daarvan wordt de biologische context in termen van de omgevingsomgeving vaak niet in focus in de ware zin van het woord. Om deze kloof te sluiten heeft de ontwikkeling van LSFM onlangs belangstelling gekregen, met een microscopietegniek die fluorescerende structuren op cellulaire grootte kan oplossenMaar ook om de gehele 3D-informatie van een monster met een grootte van meer dan 1 cm gemakkelijk te beoordelen.
Het hier beschreven protocol bevat een methode van het gebruik van een ultramicroscoop om een cellulair leukocyt infiltraat te visualiseren in hele murine harten. Na de succesvolle inductie van steriele myocarditis in een CD11c.DTR muismodel 30 ontvangt het respectieve dier een IV-injectie van een fluorochroom-gekoppeld anti-CD45-antilichaam, dat circuleert gedurende 2 uur in het levende dier. In principe, door het uitvoeren van een post-mortem, zou het gehele antilichaam kleuring tussen organfiksatie en monsterdehydratie mogelijk moeten zijn. Helaas vraagt de gehele bergkleuren veel langere incubatietrappen en verhoogt daarom de tijd die nodig is voor het genereren van samples ( dwz 4-21 dagen) 6 , 31 massief. Bovendien is deze intravitale kleurbenadering niet alleen sneller, maar levert ookEffectievere weefselpenetratie van het antilichaam in vergelijking met een full-mount kleuring protocol 9 . Hoewel de absolute kleuring efficiëntie niet is gekwantificeerd, wordt verwacht dat een groot deel van de leukocytpopulatie gemerkt wordt, gezien het resulterende fluorescentiesignaal opmerkelijk sterk is. Zowel de fluorescerende proteïnen als de antilichamen die zichzelf in grote mate overleven, overleven het daaropvolgende clearingproces en lijken beide langdurig stabiel te zijn. Er dient ook op te worden gewezen dat een oplosmiddel gebaseerde agent wordt gebruikt voor weefselreiniging. Dit belemmert massaal een heldergebergte-aanpak volgens het clearingproces. Het op oplosmiddel gebaseerde weefselontruiming is een omkeerbaar fenomeen, zodat een overdracht van het gerecycleerde weefsel in een watergebaseerd medium (zoals PBS), die gewoonlijk gebruikt wordt voor standaard antilichamenvervuiling, zou resulteren in een niet-transparante monster. Daarom zouden niet-standaardkleuringprotocollen in organische oplosmiddelen moeten worden vastgesteld i Bij het verwijderen van een monster is het nodig om een full-mount staining procedure te hebben.
De volgende hart perfusie is absoluut noodzakelijk om zo veel mogelijk residueel bloed te elimineren, aangezien bloed in de volgende stappen slecht is gewist en de beeldvormingsresultaten verergerd wordt. Nadat het hart is verwijderd, wordt het weefselwater verwijderd in een stijgende ethanolronde. Deze stap kan worden beschouwd als het eerste deel van de chemische clearing. Het idee is het weefselwater te vervangen door een immersiemiddel dat beter overeenkomt met de gemiddelde brekingsindex (RI) van het gekozen model. DBE werd gekozen als het onderdompelingsmedium volgens het protocol van Ertuk et al. 32 , met enkele wijzigingen. DBE heeft een brekingsindex van 1,55 (nD20) en wanneer het werd vergeleken met andere clearingsmiddelen, zoals benzylalcohol: benzylbenzoaat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 of sucrose (RI (nD20) = 1,44 )F '> 13 heeft het de fluorescente labels die in dit protocol gebruikt worden, het beste bewaard. Een soortgelijk fluorescentiebehoud werd verkregen door gebruik te maken van ethylcinnamaat (ECI). We hebben het gebruik ervan beschreven in een studie over de geautomatiseerde kwantificering van glomeruli bij nephretische nieren 9 . Weefsel, die ooit werd geschat op een brekingsindex van 1.382 ± 0.004 33 , was even goed gewist met alle stoffen die we 9 hebben beoordeeld. Daarom was de cruciale factor voor de keuze van DBE het fluorescentiebehoud en niet het clearingpotentiaal. Verander naar dit passieve clearing protocol, het gebruik van een actieve methode, zoals CLARITY 34 , 35 , waar de verwijdering van lipiden met behulp van een elektroforetische stroom resulteert in sterk gecontroleerde weefsels, moet mogelijk zijn. In tegenstelling tot zo'n water Gebaseerde clearing methode, resulteert de DBE-clearing in een significante verhardingVan het weefsel, vergezeld van kleine krimpen. Dit zorgt voor een gemakkelijke afhandeling van de monsters en vereist geen verdere aanpassingen voor beeldvorming, zoals het inbedden van het monster in een agarose blok. Daarom zou de overdracht van dit protocol naar een methode zoals CLARITY uitdagend zijn, maar mensen hebben met succes de toepassing van de gekozen ultramicroscoop (zie de tabel van materialen) met deze aanpak aangetoond 3 . Het is belangrijk om de potentiële vernietiging van endogene fluorescentiesignalen door de clearingmethode van keuze te evalueren. Aangezien we nooit met CLARITY of andere actieve clearingprotocollen hebben gewerkt, kunnen we niet reageren op de fluorochroomreactie in deze systemen. Het ergste geval zou zijn dat een volgende full-mount antilichamen kleuring zou moeten worden uitgevoerd.
Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan andere organen, zoals murine longen; nieren; hersenen; En zelfs botten, zoals de femur, tibia of calvaria. Terwijl evaluatie Ng het toepassingspotentieel op nieuwe weefselgebieden en / of nieuwe fluorescerende etiketteringstrategieën, is de grootste uitdaging meestal het protocol op te stellen op een manier dat de fluorescentie in leven blijft. Het op oplosmiddel gebaseerde onderdompelingsmedium 13 en de uitdrogingsmiddelen 36 hebben een directe invloed op de integriteit van de fluorochromen. Het gebruik van AlexaFluurderivaten wordt aanbevolen, aangezien ze in verschillende protocollen vrij stabiel lijken te zijn. Echter, heel vaak moeten andere fluorochromen worden gebruikt. In dit geval is het zeker de moeite waard om het gebruik van andere clearingmiddelen te evalueren (bijvoorbeeld Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , methylsalicylaat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 en ECI 9 ) en andere uitdrogingsalternatieven (bijvoorbeeld methanol en tetrahydrofuraan 13 ).
Zoals bij veel andere LSFM-benaderingen, is het proces van positionering van het transparante hart onder de microscoop veeleisend. Commerciële systemen bieden voldoende ruimte voor het installeren van monsters van de grootte van de muisorganen, waaronder longlopen, nieren of harten. Op dit moment zijn er echter geen gestandaardiseerde monsterhouders voor deze monsters beschikbaar. Daarom moesten we een montageapparaat vaststellen door gebruik te maken van gehercoreerde en opnieuw gevormde agarose blokken. Toch moet een bepaald aantal beelddatasets wegens bewegingsartifacten weggegooid worden. Dit probleem is ook toegenomen door de lange aanwinstijd van de hier gebruikte microscoop. Potentieel zal de opwekking van grote datasets aanzienlijk profiteren van snellere systemen, maar we hebben nog geen kans gehad om nog een snellere microscoop te gebruiken. Onze microscoop (zie tabel oF materialen) werd gebouwd rond een zoommicroscooplichaam en was uitgerust met een lasermodule, een sCMOS-camera met een pixelgrootte van 6,5 x 6,5 mm 2 en detectie optica met een optisch vergrotingsbereik van 1.26X tot 12.6X. Het centrale deel van de detectie-optica was een 0,5 NA objectieflens met een werkafstand van 5,5 mm, waardoor de waarneming van een groot zichtveld varieerde tussen 1,7 en 17,6 mm diagonaal. Dit was groot genoeg om de optische doorsnede van gehele murine harten uit te voeren. De correctie van chromatische aberratie, tussen 400 en 800 nm, werd bereikt door de mechanische aanpassing van het doel. Waar nodig werden chromatische correcties verder uitgevoerd tijdens de computerbehoefte na verwerking. Sferische afwijkingen, ook in dikkere exemplaren, werden niet in dit systeem waargenomen en moesten derhalve niet worden gecorrigeerd.
Al met al presenteren we hier een robuust protocol voor de chemische clearing en analyse van ruimtelijke lEukocytenverdeling binnen muizenharten met behulp van lakvelmicroscopie. Op dit punt is het belangrijk om te benadrukken dat deze LSFM procedure nauwelijks in staat is om fijne weefselstructuren zoals capillairen op te lossen. In dit opzicht is deze LSFM geschikt om de algemene immuuncellenverdeling te karakteriseren en om mogelijke immuuncellenaccumulaties in het orgaan te beschrijven. Men moet er echter rekening mee houden dat LSFM in het algemeen niet de perfecte keuze is voor het analyseren en kwantificeren van cellulaire lokalisatie in sub-structuren van kleine organen, zoals de vasculatuur. Om dergelijke vragen te beantwoorden, moet LSFM worden aangevuld met andere methoden, zoals histologie of 2-foton microscopie. Verdere beperkingen van dit protocol omvatten de beperking tot maximaal 3-4 kleuren. Het blauwe kanaal is moeilijk te gebruiken voor andere signalen, behalve autofluorescentie, de beperking op vaste monsters en de maximale steekproefgrootte van 30 mm x 30 mm x 15 mm. Ook moet de sterke geur en de acute toxiciteit van DBE worden genomenN in rekening. Als het laatste punt problematisch is, kan ethylcinnamaat worden gebruikt als alternatief clearingmiddel 9 . Het grote voordeel van het kiezen van deze microscopietechniek is het vermogen om het gehele orgel tegelijk te analyseren. Bij conventionele analyses van hematoxyline- en eosine-gekleurde, formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde (FFPE) histologische weefselsecties is het zeer waarschijnlijk dat belangrijke ruimtelijke gebieden ontbreken, tenzij elke enkele sectie wordt geanalyseerd. Bovendien biedt lichte-microscopie niet alleen het virtuele snijden van het monster in elk driedimensionaal vliegtuig, maar biedt dit ook potentieel zonder het monster te vernietigen of snijartikelen te veroorzaken. Indien nodig zou het vaste orgaan later kunnen worden verwerkt voor verdere analyses, zoals een correlatieve licht- en elektronmicroscopie benaderingen voor het oplossen van bepaalde gebieden van belang. Een sjabloon voor zo'n studie kan worden gevonden in het werk van Karreman et al. , Waar de correlatie weddenschapWeen een 2-foton microscopie beeldstapel en drie-dimensionale elektronenmicroscopie data is succesvol weergegeven 41 . Een andere veelbelovende aanpak zou de combinatie van dit protocol kunnen zijn met de onlangs gepubliceerde uDISCO-methode die ook gebaseerd is op een organisch oplosmiddel en dat zou het mogelijk maken om veel grotere organen door een standaard LSFM 42 te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek in het Gunzerlaboratorium werd ondersteund door het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie nr. 0315590 AD) en door de Duitse Onderzoeksstichting (subsidie nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). We bedanken verder de IMCES voor technische ondersteuning en Sebastian Kubat voor hulp bij 3D-cartoonmodellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
