Summary
Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.
Abstract
Die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist in Kombination mit chemischen Clearing-Protokollen zum Goldstandard für die Analyse fluoreszenzmarkierter Strukturen in großen biologischen Proben geworden und liegt in der zellulären Auflösung. Mittlerweile ermöglichen die ständige Verfeinerung der zugrunde liegenden Protokolle und die erweiterte Verfügbarkeit von spezialisierten kommerziellen Systemen die Untersuchung der Mikrostruktur ganzer Mausorgane und ermöglichen sogar die Charakterisierung des zellularen Verhaltens in verschiedenen lebenszykologischen Bildgebungsansätzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die räumliche Vollmontage Visualisierung und Quantifizierung der CD45 + Leukozytenpopulation in entzündeten Mausherzen. Das Verfahren verwendet einen transgenen Mausstamm (CD11c.DTR), der vor kurzem als ein robustes, induzierbares Modell für die Untersuchung der Entwicklung einer fulminanten tödlichen Myokarditis, gekennzeichnet durch tödliche Herzrhythmusstörungen, gezeigt wurde. Dieses Protokoll enthält Myokarditis Induktion, intravitAl-Antikörper-vermittelte Zellfärbung, Organpräparation und LSFM mit anschließender computergestützter Bildnachbearbeitung. Obwohl es als hoch angepasstes Verfahren für unsere besondere wissenschaftliche Frage dargestellt ist, stellt das Protokoll die Blaupause eines leicht einstellbaren Systems dar, das auch ganz andere fluoreszierende Strukturen in anderen Organen und sogar in anderen Spezies ansprechen kann.
Introduction
Während der Evolution der Lichtmikroskopie erschienen viele spezialisierte Formen, die alle entwickelt wurden, um Einschränkungen im Visualisierungsprozess für bestimmte Exemplare zu minimieren. Ein solches Verfahren ist die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Erstmals im Jahre 1903 von Siedentopf und Zsigmondy 1 entwickelt und Anfang der 90er Jahre 2 erste biologische Grundanwendungen gefunden, ist LSFM bis heute zum leistungsstärksten mikroskopischen Werkzeug für die Visualisierung von großen Exemplaren wie intakten Mausorganen mit Fluoreszenzsignalauflösung geworden Bis auf zellulare Ebene. Aufgrund dieser Vorteile, in Kombination mit seinem Potenzial für Live-Zell-Bildgebung, Nature Methods namens LSFM die "Methode des Jahres 2014 3 ".
Wie der Name schon sagt, wird die Probenbeleuchtung in einem LSFM durch leichte Blätter durchgeführt, die senkrecht zur Achse des verwendeten Objektivs orientiert sindOder Emissionslicht-Sammlung und anschließende Bilderzeugung. Das Lichtbogen wird gewöhnlich entweder durch Fokussieren von breiten, kollimierten Laserstrahlen mit einer zylindrischen Linse oder durch die schnelle Seitwärtsbewegung von schmalen, fokussierten Laserstrahlen in nur einer horizontalen oder vertikalen Ebene 4 , 5 erzeugt . Auf diese Weise wird nur die Brennebene der Abbildungsoptik beleuchtet, typischerweise mit einer Dicke von 1-4 μm. Folglich werden für eine in der Beleuchtungsebene platzierte Fluoreszenzprobe sowohl die Erzeugung von Streulicht als auch die Effekte des Photobleichens aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Brennebene eliminiert oder stark unterdrückt 6 , 7 . Da alle Out-of-Focus-Flugzeuge nicht beleuchtet sind, werden in diesen Bereichen Photobleicheffekte weggelassen. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie sind die Wege des beleuchteten und emittierten Lichts voneinander getrennt, so dass das endgültige Bild qual Nicht von der perfekten Fokussierung des Anregungslichtstrahls durch die Ziele abhängt. Abhängig von der zugrundeliegenden Frage ist es daher möglich, Ziele mit einem enormen Sichtfeld (FOV) zu verwenden, so dass die größtmögliche Fläche der beleuchteten Ebene ohne irgendwelche in xy-Richtung bewegenden Bauteile abgebildet werden kann.
In modernen LSFM-Systemen wird ein Fluoreszenzbild des erzeugten optischen Abschnitts auf einer hochempfindlichen ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) oder komplementären Metalloxid-Halbleiter- (CMOS-) Kameras erfasst, die in der Lage sind, das gesamte Sichtfeld (FOV) zu erfassen, In Mikrosekunden. Daher ist es möglich, durch Bewegen der Probe durch das Lichtblatt und durch Erfassen von Bildern in definierten z-Schritten die vollständige 3D-Information einer Probe in einer angemessenen Zeitspanne 8 , 9 zu erhalten , wodurch diese Technik für die lebende Zelle anwendbar ist Studien 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Dennoch, obwohl LSFM eine schnelle, empfindliche und fluoreszenzfreundliche Methode anbietet, ist die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe immer noch ein wichtiges Thema, besonders wenn große biologische Proben das Ziel für eine 3D-Analyse sind. Die Lichtdurchlässigkeit wird durch physikalische Aspekte der Absorption und durch Lichtstreuung an Grenzflächen von Strukturen mit unterschiedlichen Brechungsindizes kritisch modifiziert 13 . Wenn daher Proben mehrere Millimeter groß sind, wird LSFM meist mit Clearing-Protokollen kombiniert, um die Proben optisch transparent zu machen. Diese Techniken basieren auf der Idee, Wasser aus dem jeweiligen biologischen Gewebe zu entfernen und es mit wasser- oder (organischen) lösemittelbasierten Immersionsmedien auszutauschen, die so gewählt sind, dass sie die Brechungsindizes der jeweiligen Zielgewebekomponenten eng anpassen. Als Ergebnis wird die laterale Lichtstreuung minimiert und alle Wellenlängen werden minimiertVon Licht kann viel effizienter durch das Gewebe 13 gehen . In vielen Fällen erscheinen die so behandelten biologischen Proben makroskopisch kristallklar, was es ermöglicht, dass LSFM auch auf ganzen Mausorganen mit langen Arbeitsabständen mit geringem Vergrößerungsgrad durchgeführt wird.
Hier stellen wir ein Vorbereitungsprotokoll für die Großprobenabbildung in einem Lichtbogenmikroskop vor (siehe Tabelle der Materialien), das wir zur Untersuchung des zellulären Herzinfiltrums in einem Mausmodell der Myokarditis 15 etabliert haben. CD11c.DTR-Mäuse exprimieren den Primaten-Diphtherie-Toxinrezeptor (DTR) unter der Kontrolle des CD11c-Promotors 16 . Folglich werden Zellen in diesen Mäusen, die CD11c zusammen mit dem DTR exprimieren, gegenüber dem Exotoxin von Corynebacterium diphtheria (Diphtherietoxin, DTX) empfindlich gemacht ; Die systemische Behandlung dieser Tiere mit DTX führt zu einer Erschöpfung aller CD11c + ceLl CD11c ist ein Integrin und ist als Zelloberflächenrezeptor für eine Vielzahl unterschiedlicher löslicher Faktoren in Aktivierungs- und Reifungsprozessen vor allem in Zellen der monozytischen Linie 17 involviert. Folglich wurde das CD11c.DTR-Mausmodell intensiv verwendet, um die Rolle der dendritischen Zellen und Makrophagen-Teilmengen im Kontext vieler verschiedener immunologischer Fragen zu untersuchen. Im Laufe der Zeit wurde berichtet, dass CD11c.DTR-Mäuse, die systemisch mit DTX behandelt wurden, nachteilige Nebenwirkungen entwickeln und stark erhöhte Mortalitätsraten aufweisen können 18 , 19 . In letzter Zeit konnten wir die zugrunde liegende Todesursache 15 identifizieren, die die Entwicklung einer fulminanten Myokarditis nach intratrachealer DTX-Anwendung bei diesen Tieren beschreibt. Die Toxin-Herausforderung verursachte zelluläre Zerstörung, auch in zentralen Teilen des Stimulus-Übertragungssystems im Herzen. Dies wurde von massiven CD45 begleitet+ Leukozyten infiltrieren, schließlich führt zu tödlichen Herzrhythmusstörungen. In diesem Fall war nicht nur das Aussehen der Leukozytenpopulation wichtig, sondern auch ihre räumliche Verteilung im Herzen. Diese experimentelle Frage stellt eine Herausforderung für die moderne mikroskopische Bildgebung dar, die wir durch einen Lichtbogenmikroskopieansatz gelöst haben, der durch intravitale Antikörperfärbung und ein organisches Lösemittelbasiertes optisches Clearingprotokoll unterstützt wird.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden gemäß den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von den zuständigen örtlichen Behörden in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Deutschland) genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten pathogenfreien (SPF) Bedingungen verwendet und untergebracht.
1. Induktion der Myokarditis durch Diphtherie Toxin (DTX)
- Bereiten Sie die DTX-Lösung für die Induktion von Myokarditis vor, indem Sie die DTX-Stammlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine 1 μg / ml Arbeitslösung verdünnen.
- Tragen Sie 100 μl dieser Lösung intratracheal (it) in 8 bis 10 Wochen alte CD11c.DTR-Mäuse ( ca. 5 ng / g Körpergewicht (bw)), wie von Hasenberg et al. Für die Anwendung einer Pilzsporen-Suspension 20 .
HINWEIS: Die intraperitoneale Anwendung des Toxins kann zu einer ähnlichen Induktion führenTödliche Myokarditis Dieser Ansatz müsste aber zunächst validiert werden.- Für sie Anwendung, betäubt die Tiere durch eine intraperitoneale (ip) Injektion von 100 mg / kg bw Ketamin und 10 mg / kg bw Xylazin.
- Nach dem Erreichen einer tiefen Narkose (Zehen-Prise-Test), intubieren Sie die Tiere mit einem 22 G Indwelt Venenkatheter durch die Mundhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung des Objektivrohres, indem Sie die Tiere mit einem kleinen Atemschutzgerät mit einer Rate von 250 Atemnoten pro Minute und einem Inhalationsvolumen von 250 μl pro Atem belüften, auch von Hasenberg et. Al. 20
HINWEIS: Wenn Sie richtig positioniert sind, ändert sich die Atemfrequenz der Tiere entsprechend den angelegten Belüftungseinstellungen. - Trennen Sie das Belüftungssystem und trennen Sie die 100 μl DTX-Lösung oder eine gleiche Menge PBS als Kontrolle durch den Katheter in die Lunge und belüften Sie die Tiere für 1 zusätzliche Min.
- Lassen Sie die Tiere sich von der Anästhesie erholen und überwachen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand und die Körpergewichtsänderung für 4 Tage.
HINWEIS: Je nach genetischem Hintergrund, Mäusestamm oder Anfangsgewicht kann die Schwere und der Beginn der Myokarditis variieren und sollte zuerst bestimmt werden.
2. Probenvorbereitung für die Lichtbogenmikroskopie
- 4 Tage nach Toxin-Applikation die Mäuse durch Spülen einer Induktionskammer mit einer verdampften 2% Isofluran / Sauerstoff-Mischung anästhesieren. In etwa 50 μl eines direkt markierten Anti-CD45-Antikörpers (Klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μl PBS intravenös (iv) unter Verwendung des retro-orbitalen Applikationsweges injizieren, was eine sehr schnelle und hochgenaue Applikation der Korrekte Menge an Antikörper.
HINWEIS: Die gewünschte Tiefe der Narkose wurde erreicht, wenn die Mäuse liegend sind und nicht auf Zehenstichprüfung reagieren. - Nach 2 h Inkubation, opfer die Mäuse durch zervikale Versetzung anD dauert die Herzen in situ mit 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
- Das Herz aussetzen und die Perfusionslösung mit einem 21 G-Katheter in den rechten Ventrikel einspritzen. Perfund mit langsamem, konstantem Druck und stellen Sie sicher, dass das Blut nach dem Schneiden der Aorta entleert werden kann.
HINWEIS: Diese transkardiale Perfusion kann zu kleinen Vorbereitungsartefakten führen, die die endgültige 3D-Visualisierung des Organs stören könnten. Daher konnten fortgeschrittene Tierversucher die Perfusion durch die untere Hohlvene durchführen und die Bauchaorta ausgleichen.
- Das Herz aussetzen und die Perfusionslösung mit einem 21 G-Katheter in den rechten Ventrikel einspritzen. Perfund mit langsamem, konstantem Druck und stellen Sie sicher, dass das Blut nach dem Schneiden der Aorta entleert werden kann.
- Zur chemischen Fixierung wird das Herz durch die gleiche Vertiefung mit 5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) perfundiert. Halten Sie den Katheter an Ort und legen Sie einfach eine neue Spritze mit PFA gefüllt. Perfund mit langsamem und konstantem Druck
HINWEIS: Paraformaldehyd stark toxisch; Vermeiden Sie Kontakt mit der Haut, Augen und anderen Schleimhaut.- Vorsichtig das Herz mit gezackter Pinzette ergreifen; PuLl es etwas nach oben; Und schneiden alle Gewebeverbindungen, einschließlich der eingehenden und ausgehenden Arterien und Venen. Die Orgel für weitere 4 h in 4% PFA zur weiteren Fixierung aufbewahren.
- Um das Organ zu dehydrieren, das Herz in einer aufsteigenden Ethanolreihe mit 50%, 70% und zweimal bei 100%, jeweils für 12 h, bei 4 ° C im Dunkeln zu inkubieren. Verwenden Sie hier schwarze 5-ml-Polypropylen-Reaktionsrohre, so dass sie sich ständig in einem Rohrrotator mit einer langsamen Drehzahl drehen können, um eine Luftblasenbildung zu verhindern.
- Komplette Probenvorbereitung durch chemisches Clearing. Um die Herzen transparent zu machen, inkubieren sie sie in 98% Dibenzylether (DBE), während sie sich ständig über Nacht drehen.
HINWEIS: DBE reizt Augen, Haut und Atemwege.
3. Lichtbogen-Mikroskopie
- LSFM mit dem Lichtbogenmikroskop durchführen (siehe Materialliste). Legen Sie die Probe auf den Standardprobenhalter des Mikroskops in die DBE-gefüllte cuVette, die für Proben bis 30 mm x 30 mm x 15 mm geeignet ist.
- Halten Sie die Probe während der Bildaufnahme mit dehydrierten und gelöschten Agaroseblöcken fest.
- Zur Herstellung der Agaroseblöcke 2% geschmolzene Agarose in eine Form geben (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis sie erstarrt.
- Dehydrieren Sie es in einer aufsteigenden Ethanol-Serie (50%, 70% und zweimal bei 100%). Inkubieren Sie die Agaroseblöcke über Nacht in 98% DBE. Lagern Sie die Agarose in DBE, bis sie verwendet wird.
HINWEIS: Da die Agarose hauptsächlich aus Wasser besteht, können die Inkubationszeiten für jeden Dehydratisierungsschritt je nach Größe des Blocks verlängert werden.
HINWEIS: DBE reizt die Augen, die Haut und die Atemwege. - Wenn nötig, schneide den vorbereiteten Agarose-Block auf die gewünschte Form mit einem scharfen Skalpell. Typischerweise schneiden sie prisma- oder keilförmige Formen, um an den Kanten des Probenadapters zu platzieren.
HINWEIS: Da die Agarose-Blöcke elastisch sind,Die Probe bleibt bei einer geringen Kraft an Ort und Stelle.
- Erfassen Sie die interessierenden Fluoreszenzsignale (hier Autofluoreszenz- und Anti-CD45-Antikörper-Färbung) mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfilter-Einstellungen.
- Für den Nachweis des Bindegewebs-abgeleiteten Autofluoreszenzsignals verwenden Sie ein 525/50 nm Bandpassfilter bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm (OPSL: 50 mW); Die CD45-Färbung mit einem AF647-gekoppelten Antikörper wird bei 668 nm (Bandpassfilter: 680/30 nm) und bei einer Anregungswellenlänge von 647 nm (Diodenlaser: 50 mW) nachgewiesen.
- Wählen Sie 4 μm als Abstand zwischen den beiden einzelnen Z-Ebenen.
4. Bild Nachbearbeitung
HINWEIS: Die erfassten digitalen Bilddaten wurden mit einer wissenschaftlichen 3D / 4D Bildverarbeitungs- und Analysesoftware weiterverarbeitet (siehe Tabelle).
- Öffnen und Voreinstellung der Datendateien.
- Nach dem Start der Analysesoftware wählen Sie die "Surpass" -Taste in der oberen linken Ecke. Um die Bildstapel zu öffnen, wählen Sie "Datei", "Öffnen" und wählen Sie einen Ordner aus, der die Daten aus dem ersten erworbenen Kanal enthält. Wählen Sie "Bearbeiten" und "Hinzufügen von Kanälen", um weitere erworbene Kanäle hinzuzufügen.
HINWEIS: Abhängig von der Datengröße und dem Computersystem kann dieser Vorgang einige Minuten dauern. Das vorgestellte Protokoll zeigt alle Schritte für 2 Erfassungskanäle (Autofluoreszenz und AF647). - Korrigieren Sie die x-, y- und z-Voxel-Maße, indem Sie auf "Bearbeiten" klicken und "Bildeigenschaften" auswählen. Wenn das neue Fenster öffnet, passen Sie die Parameter an.
HINWEIS: Dieser Schritt hängt vom eingesetzten Mikroskopsystem und dem jeweiligen Datenformat ab. Richtige xyz-Werte sind für die nachfolgende Größe und die entfernten Messungen kritisch. In den meisten Fällen werden diese Parameter als Metadaten in den Mikrographen-Dateien gespeichert. Allerdings, wenn die Datei foRmat kann von der Analysesoftware nicht korrekt interpretiert werden, es ist wichtig, die Pixelgröße manuell einzugeben. Die Pixelgröße in den x- und y-Dimensionen hängt von der Kamerapixelgröße, dem potentiell angewandten Binning und der Linse und der Objektivvergrößerung ab. Die Pixelgröße in z entspricht der selbst definierten z-Schrittgröße ( zB 4 μm).
- Zuerst das Autofluoreszenzsignal in Graustufen umwandeln, indem du die "Display-Einstellung" ("Edit" und "Show Display Adjustment") öffnest. Ein neues Fenster listet alle geöffneten Kanäle und die Anzeigeeinstellungen für alle von ihnen auf; Um die Standardfarbe zu ändern, den Autofluoreszenzkanal auszuwählen und den "weißen" Displaystil auszuwählen. Klicken Sie auf "OK", um sich zu bewerben.
- Für die Schwarzpegel-Einstellung gehen Sie zurück auf "Display-Einstellung" und stellen Sie den Schwarzpegelwert ein, um unerwünschte Hintergrundsignale auszuschließen, die keine Musterstruktur darstellenS.
- Verwenden Sie dazu das obere linke Dreieck auf der Kanalleiste und ziehen Sie es von links nach rechts.
HINWEIS: Änderungen werden sofort visualisiert. Achten Sie darauf, nur Signale zu unterdrücken, die nicht aus dem Sample stammen. Minimalwerte im Hintergrund sollten niemals "0" sein, um pechschwarze Pixel zu vermeiden, da die Rauschsignale für zusätzliche Berechnungen benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Schwarzniveauänderungen nach der Bilderfassung durchgeführt werden. Andernfalls können wertvolle Beispielinformationen verloren gehen. Die Black-Level-Einstellung dient nur repräsentativen Zwecken. Um die gleichen Anzeigeeinstellungen über verschiedene Samples zu verwenden, können präzise Werte in das "min" numerische Feld unterhalb der Kanalliste eingegeben werden. Das ist sehr hilfreich für quantitative Analysen.
- Verwenden Sie dazu das obere linke Dreieck auf der Kanalleiste und ziehen Sie es von links nach rechts.
- Führen Sie die Intensitätseinstellung durch, indem Sie das obere rechte Dreieck verwenden, um die jeweilige Kanalintensität einzustellen oder indem Sie präzise Werte in das "max" numerische Feld unterhalb der Channe eingebenL Liste.
- Führen Sie die Kontrasteinstellung durch, indem Sie das untere Dreieck in der Mitte der Kanalleiste ziehen, um den Gamma-Wert zu erhöhen oder zu verringern oder indem Sie die genauen Werte eingeben.
- Stellen Sie den AF647-Kanal entsprechend dem Autofluoreszenzkanal ein. Als Differenz setzen Sie die Visualisierung des AF647-Signals auf eine Hitzekarte-Farb-Nachschlagetabelle. Tun Sie dies, indem Sie den Kanalmodus "Feuer" in einem ähnlichen Ansatz wie in Schritt 4.2.1 wählen.
HINWEIS: Da die Gesamtsignalintensitäten im Vergleich zum Autofluoreszenzkanal deutlich niedriger sind, werden die Schwarzpegel in der Regel auf viel niedrigere Werte eingestellt. Für den Autofluoreszenzkanal wird die Helligkeit dieses Kanals gewöhnlich erhöht. - Wählen Sie den "Blend-Modus", um Gewebestrukturen im Detail zu visualisieren. Analysiere alle Samples aus einer Serie mit den gleichen Parameterwerten.
- Um die Orgel vor der 3D-Szene explizit zu schneidenRt, eine Clipping-Ebene auf das gerenderte 3D-Objekt anwenden.
- Klicken Sie in der Objektliste auf das Symbol "Clipping Plane" (Schere). Innerhalb der Bildansicht erscheint ein gelber Rahmen und ein Manipulator (weiße Spindel). Drehen Sie die Spindel am dünneren Ende mit der Maus, indem Sie die Ausrichtung der Clipping-Ebene ändern und bewegen Sie den dickeren Mittelteil der Spindel, um die gewünschte Tiefe des Clips auszuwählen.
- Verbergen Sie den Rahmen und den Manipulator, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen unterhalb der Objektliste deaktivieren und die gewünschten Schnappschüsse erstellen.
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Representative Results
Der vorgestellte LSFM-Ansatz analysiert die Leukozytenverteilung und die Menge in murinen Herzen bei der Induktion einer schweren Myokarditis. Abbildung 1A erklärt das Vorbehandlungsprotokoll für die transgenen CD11c.DTR-Mäuse zur Myokarditis-Induktion. Dieser Schritt stellt den notwendigen Auslöser für die Rekrutierung von Leukozyten zum Myokard dar. Nach erfolgreicher DTX-Anwendung entwickeln die Tiere schwere Krankheitssymptome wie allgemeine Schwäche, Anorexie und Gewichtsverlust im Bereich von 2-4 Tagen. Nach 4 Tagen werden die Leukozyten von der iv . Anwendung von Fluorochrom-gekoppeltem Anti-CD45-Antikörper vor der transkardialen Perfusion, um das Blut aus dem Kreislauf zu entfernen. Wenn sie erfolgreich durchgeführt werden, drehen sich das Herz und andere Organe weißlich. Anschließend wird das Organ herausgeschnitten und das Gewebewasser wird mit DBE durch eine aufsteigende Ethanolreihe und eine endgültige Inkubation in DBE ausgetauscht. Abbildung 1B zeigt den FahrplanDer einzelnen Inkubationsschritte, in denen das Organ eine erhebliche Schrumpfung erfährt. Das chemisch freigewordene Organ wird dann auf eine DBE-gefüllte Abbildungskammer auf dem Standard-Mikroskop-Gewebehalter übertragen. Zur Stabilisierung des Organs während der 3D-Bilderfassung wird es durch transparente Agaroseblöcke fixiert. Die detaillierte Positionierung der Probe ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Erfassung eines ganzen Bildstapels, bestehend aus 2 Kanälen (Autofluoreszenz und Anti-CD45), dauert ca. 20-30 Minuten und erzeugt eine Datendatei von ca. 16 GB. Schließlich werden die resultierenden Daten als künstliches 3D-Rendering analysiert, bei dem die Leukozytenverteilung in einer Wärmeabbildungsansicht angezeigt wird. In Abbildung 3 (obere Reihe) können die stark entzündeten Bereiche eines Herzens eines DTX-behandelten Tieres durch ihre rötlich-weißliche Erscheinung wahrgenommen werden. Eine detailliertere Untersuchung des 3D-Modells zeigt die Leukozytenkonzentration, insbesondere in Bereichen des Herzleitungssystems, wie der Atriovent Rikuläres Bündel und die Purkinje Fasern. Im Gegensatz dazu zeigen die Herzen von PBS-behandelten Tieren dieses Entzündungsmuster überhaupt nicht (untere Reihe).
Abbildung 1: Schema der Induktion und Probenvorbereitung der Diphtherie-Toxin-induzierten Myokarditis. ( A ) Die Entwicklung der Myokarditis wurde durch sie verursacht . Anwendung von Diphtherietoxin (100 ng / Tier). Nach 4 Tagen war die Myokarditis vollständig entwickelt und ein AF647-gekoppelter Anti-CD45-Antikörper (15 μg / Tier) wurde injiziert . Um CD45 + Leukozyten zu detektieren. Die Tiere wurden 2 Stunden später durch zervikale Versetzung geopfert, und die Herzen wurden mit PBS / EDTA (5 mM) gefolgt von 4% PFA perfundiert. ( B ) Nach der Entfernung wurde das Organ mit einer aufsteigenden Ethanolreihe dehydratisiert und schließlich durch Nachtinkubation in Dibenzylether gereinigt..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schema der Probenpositionierung im Mikroskop. Das chemisch gereinigte, transparente Herz (4) wurde auf dem Probenhalter (2 und 5) positioniert und mit Hilfe von gereinigten Agaroseblöcken (6) stabilisiert. Dieses Konstrukt wurde dann in die DBE-gefüllte Glasküvette (3) getaucht. Zur Erfassung wurde eine 0,5 NA Objektivlinse (1) mit einem Arbeitsabstand von 5,5 mm eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative 3D-Renderings von Ganz-oderGan Light-Sheet-Mikroskopie. CD11c.DTR-Mäuse wurden intratracheal mit DTX (obere Reihe) oder PBS (untere Reihe) behandelt. 4 Tage später wurde die Entwicklung der Myokarditis, dargestellt durch CD45 + Leukozyteninfiltration, durch Fluoreszenz-Licht-Blatt-Mikroskopie sichtbar gemacht. Um die CD45 + -Zellen zu färben, wurde ein Anti-CD45-Antikörper, der an AF647 gekoppelt war, iv 2 h injiziert, bevor die Mäuse geopfert wurden. Das Autofluoreszenzsignal des Bindegewebes wird grau dargestellt, während das CD45 + Infiltrat in Wärmeformfarben (blau: low signal; white: high signal) dargestellt wird. Jede Zeile besteht aus 4 digital abgeschnittenen 3D-Renderings und zeigt die Situation innerhalb der Orgel. Die Clipping-Tiefe relativ zum vorderen Teil des Herzens ist über den einzelnen Bildern deklariert. Die Figur wurde von Mann et al. 15 Maßstab = 1 mm. Klicken Sie bitte hierUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In der modernen Life Science spielt die mikroskopische Visualisierung biologischer Prozesse eine immer wichtigere Rolle. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten zwei Jahrhunderten viele Entwicklungen erreicht, die helfen, Fragen zu beantworten, die bis zu diesem Punkt nicht adressierbar sind. Erstens hat es eine deutliche Tendenz gegeben, die Auflösungsfähigkeit von Lichtmikroskopen grundsätzlich zu erhöhen. Mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) 21 , 22 , stimulierter Emissionsverarmung (STED) -Mikroskopie 23 und photoaktivierter Lokalisierungsmikroskopie (PALM) 24 , 25 oder stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) 26 ist die einmal postulierte Auflösung begrenzt Die Lichtbeugung 27 war deutlich gebrochen. Die zweite häufig gezielte Herausforderung bestand darin, das zelluläre Verhalten in einer Umgebung zu beobachtenDer natürliche Zustand so genau wie möglich. In diesem Zusammenhang wurde die Entwicklung von In-situ- oder In-vivo -Bildgebungsansätzen gezwungen. Um die begrenzte Lichtdurchdringungstiefe in komplexen biologischen Geweben zu überwinden, hat die 2-Photonenmikroskopie 28 , 29 neue Maßstäbe in diesem Forschungsfeld gesetzt.
Allerdings ist ein Merkmal, dass alle diese Mikroskopie Techniken in der Regel teilen ist die Verwendung von High-NA-Ziele, um eine bestmögliche Auflösung zu gewährleisten. Obwohl es Mikrostrukturen genauer behebt, beschränkt der Einsatz von High-NA-Zielen das Sichtfeld sowie den Arbeitsabstand erheblich. Infolgedessen wird der biologische Kontext in Bezug auf die Umwelt oft im wahrsten Sinne des Wortes unscharf. Um diese Lücke zu schließen, hat die LSFM-Entwicklung vor kurzem Interesse erlangt und bietet eine Mikroskopie-Technik, die in der Lage ist, fluoreszierende Strukturen bei zellulärer Größe zu lösenSondern auch die gesamte 3D-Information eines Exemplars mit einer Größe von mehr als 1 cm bequem zu beurteilen.
Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Methode dar, wie man ein Ultramikroskop einsetzt, um ein zelluläres Leukozyten-Infiltrat in ganzen murinen Herzen zu visualisieren. Nach der erfolgreichen Induktion der sterilen Myokarditis in einem CD11c.DTR-Mausmodell 30 erhält das jeweilige Tier eine iv-Injektion eines fluorochromgekoppelten Anti-CD45-Antikörpers, der für 2 h im lebenden Tier zirkuliert. Grundsätzlich sollte durch die Durchführung eines Post-mortem die Voll-Mount-Antikörper-Färbung zwischen Organ-Fixierung und Proben-Dehydratation möglich sein. Unglücklicherweise verlangt die Vollmontage-Färbung viel längere Inkubationsschritte und erhöht damit die für die Probenerzeugung benötigte Zeit ( dh um 4-21 Tage) 6 , 31 . Darüber hinaus ist dieser intravitale Färbeansatz nicht nur schneller, sondern liefert auchWirksamere Gewebepenetration des Antikörpers im Vergleich zu einem Voll-Färbeprotokoll 9 . Obwohl die absolute Färbeeffizienz nicht quantifiziert wurde, wird erwartet, dass ein großer Teil der Leukozytenpopulation markiert wird, da das resultierende Fluoreszenzsignal bemerkenswert stark ist. Sowohl die fluoreszierenden Proteine als auch die Antikörper-Markierung selbst überleben weitgehend den nachfolgenden Clearing-Prozess, und beide scheinen für eine lange Zeitspanne stabil zu sein. Es sollte auch angemerkt werden, dass ein Lösungsmittel-basiertes Mittel für das Gewebe-Clearing verwendet wird. Dies beeinträchtigt nach dem Clearing-Prozess einen ganzheitlichen Färbeansatz. Das lösungsmittelbasierte Gewebe-Clearing ist ein reversibles Phänomen, so dass eine Übertragung des gereinigten Gewebes in ein wasserbasiertes Medium (wie PBS), das üblicherweise für die Standard-Antikörper-Färbung verwendet wird, zu einer nicht transparenten Probe führen würde. Daher müssten nicht standardmäßige Färbeprotokolle in organischen Lösungsmitteln hergestellt werden Bei der Probenreinigung ist ein Voll-Färbeverfahren erforderlich.
Die anschließende Herzperfusion ist absolut notwendig, um so viel Restblut wie möglich zu eliminieren, da Blut in den folgenden Schritten schlecht gereinigt wird und die bildgebenden Ergebnisse drastisch verschlechtert. Nach dem Ausscheiden des Herzens wird das Gewebewasser in einer aufsteigenden Ethanolreihe entfernt. Dieser Schritt kann als erster Teil des chemischen Clearing angesehen werden. Die Idee besteht darin, das Gewebewasser mit einem Immersionsmedium zu ersetzen, das besser dem mittleren Brechungsindex (RI) der Probe der Wahl entspricht. DBE wurde als Immersionsmedium nach dem Protokoll von Ertuk et al. 32 , mit einigen Modifikationen. DBE hat einen Brechungsindex von 1,55 (nD20) und wurde mit anderen Clearing-Mitteln wie Benzylalkohol: Benzylbenzoat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 oder Saccharose (RI (nD20) = 1,44 verglichen )Es wurde eine ähnliche Fluoreszenzkonservierung unter Verwendung von Ethylcinnamat (ECI) erhalten. Wir haben ihre Verwendung in einer Studie über die automatisierte Quantifizierung von Glomeruli in nephretischen Nieren beschrieben 9. Der Muskel Gewebe, einmal geschätzt, dass es einen Brechungsindex von 1,382 ± 0,004 33 hat , wurde mit allen Substanzen, die wir ausgewertet haben, gleich gut geklärt. Daher war der entscheidende Faktor für die Wahl der DBE die Fluoreszenzkonservierung und nicht das Clearingpotential Änderung dieses passiven Clearing-Protokolls, die Verwendung eines aktiven Verfahrens wie CLARITY 34 , 35 , wo die Entfernung von Lipiden mit Hilfe eines elektrophoretischen Stromes zu stark geklärten Geweben führt, sollte möglich sein. Im Gegensatz zu einem solchen Wasser -basierte Clearing-Methode führt das DBE-Clearing zu einer signifikanten HärtungDes Gewebes, begleitet von geringer Schrumpfung. Dies ermöglicht eine einfache Handhabung der Proben und erfordert keine weiteren Anpassungen für die Bildgebung, wie das Einbetten der Probe in einen Agaroseblock. Daher wäre die Übertragung dieses Protokolls auf eine Methode wie CLARITY anspruchsvoll, aber die Menschen haben die Verwendung des gewählten Ultramikroskops (siehe Tabelle der Materialien) mit diesem Ansatz erfolgreich demonstriert 3 . Es ist wichtig, die potentielle Zerstörung von endogenen Fluoreszenzsignalen sorgfältig anhand der Clearing-Methode der Wahl zu bewerten. Da wir noch nie mit CLARITY oder anderen Active-Clearing-Protokollen gearbeitet haben, können wir die Fluorochrom-Reaktion in diesen Systemen nicht kommentieren. Der schlimmste Fall wäre, dass eine nachfolgende Voll-Mount-Antikörper-Färbung durchgeführt werden müsste.
Diese Methode ist leicht auf andere Organe, wie z. B. murine Lungen, einstellbar. Nieren; Gehirne; Und sogar Knochen, wie der Femur, Tibia oder Calvaria. Während Auswertung Ng das Anwendungspotential auf neue Geweberegionen und / oder neue fluoreszierende Markierungsstrategien, die größte Herausforderung besteht in der Regel darin, das Protokoll so zu gestalten, dass die Fluoreszenz am Leben bleibt. Die lösungsmittelbasierten Immersionsmedien 13 und die Dehydratisierungsmittel 36 haben einen direkten Einfluss auf die Integrität der Fluorochrome. Die Verwendung von AlexaFluor-Derivaten wird empfohlen, da sie in verschiedenen Protokollen ziemlich stabil zu sein scheinen. Allerdings müssen sehr oft andere Fluorochrome eingesetzt werden. In diesem Fall ist es definitiv wert, die Verwendung anderer Clearing-Mittel ( z. B. Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , Methylsalicylat 40 , 3Disco 32 , BABB) zu bewertenLass = "xref"> 6 und ECI 9 ) und andere Dehydratationsalternativen ( zB Methanol und Tetrahydrofuran 13 ).
Wie bei vielen anderen LSFM-Ansätzen ist der Prozess der Positionierung des transparenten Herzens unter dem Mikroskop anspruchsvoll. Kommerzielle Systeme bieten genügend Platz für die Installation von Proben die Größe der Maus Organe, einschließlich Lungenlappen, Nieren oder Herzen. Im Moment stehen jedoch keine standardisierten Probenhalter für diese Proben zur Verfügung. Deshalb mussten wir eine Montagevorrichtung unter Verwendung von geklärten und neu geformten Agaroseblöcken herstellen. Dennoch musste eine gewisse Anzahl von Bilddatensätzen aufgrund von Bewegungsartefakten entsorgt werden. Dieses Problem wurde auch aufgrund der langen Erfassungszeit des hier verwendeten Mikroskops erhöht. Potenziell wird die Generierung von riesigen Datensätzen deutlich von schnelleren Systemen profitieren, aber wir hatten nicht die Chance, ein schnelleres Mikroskop zu verwenden. Unser Mikroskop (siehe Tabelle oF-Materialien) wurde um einen Zoom-Mikroskop-Körper gebaut und mit einem Lasermodul, einer sCMOS-Kamera mit einer Pixelgröße von 6,5 x 6,5 mm 2 und einer Detektionsoptik mit einem optischen Vergrößerungsbereich von 1,26x bis 12,6X ausgestattet. Der zentrale Teil der Detektionsoptik war ein 0,5 NA Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 5,5 mm, der die Beobachtung eines großen Sichtfeldes zwischen 1,7 und 17,6 mm diagonal erlaubte. Das war groß genug, um die optische Schnittdarstellung ganzer Herzherzen durchzuführen. Die Korrektur der chromatischen Aberration zwischen 400 und 800 nm wurde durch die mechanische Einstellung des Objektivs erreicht. Bei Bedarf wurden bei der computergestützten Nachbearbeitung chromatische Korrekturen durchgeführt. Die sphärische Aberration, auch in dickeren Exemplaren, wurde in diesem System nicht beobachtet und musste daher nicht korrigiert werden.
Alles in allem präsentieren wir hier ein robustes Protokoll für die chemische Reinigung und Analyse von räumlichen lEukozytenverteilung innerhalb von murinen Herzen mit Licht-Blatt-Mikroskopie. An dieser Stelle ist es wichtig zu betonen, dass dieses LSFM-Verfahren kaum feine Gewebestrukturen wie Kapillaren lösen kann. In dieser Hinsicht ist dieses LSFM gut geeignet, um die allgemeine Immunzellenverteilung zu charakterisieren und potenzielle Immunzellenansammlungen innerhalb des Organs zu beschreiben. Allerdings muss man bedenken, dass LSFM im Allgemeinen nicht die perfekte Wahl für die Analyse und Quantifizierung der zellulären Lokalisierung in kleinen Orgel-Sub-Strukturen, wie die Vaskulatur ist. Um diese Fragen zu beantworten, sollte LSFM mit anderen Methoden wie Histologie oder 2-Photonen-Mikroskopie ergänzt werden. Weitere Einschränkungen dieses Protokolls sind die Beschränkung auf maximal 3-4 Farben - der blaue Kanal ist für andere Signale außer der Autofluoreszenz schwer zu verwenden - die Beschränkung auf feste Proben und die maximale Stichprobengröße von 30 mm x 30 mm x 15 Mm Auch der starke Geruch und die akute Toxizität von DBE sollten genommen werdenN berücksichtigen. Wenn der letztere Punkt problematisch ist, kann Ethylcinnamat als alternatives Klärungsmittel 9 verwendet werden. Der große Vorteil der Auswahl dieser Mikroskopie-Technik ist die Fähigkeit, das gesamte Organ auf einmal zu analysieren. Bei konventionellen Analysen von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten, formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) histologischen Gewebeabschnitten besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, wichtige räumliche Bereiche zu fehlen, wenn nicht jeder einzelne Abschnitt analysiert wird. Darüber hinaus ermöglicht die Lichtbogenmikroskopie nicht nur ein virtuelles Schneiden der Probe in jeder dreidimensionalen Ebene, sondern bietet auch dieses Potenzial, ohne die Probe zu zerstören oder Schneideartefakte zu verursachen. Bei Bedarf kann das feste Organ anschließend für weitere Analysen verarbeitet werden, wie z. B. eine korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie, um bestimmte Regionen von Interesse zu lösen. Eine Vorlage für eine solche Studie findet sich in der Arbeit von Karreman et al. , Wo die Korrelation wetteWurde ein 2-Photonen-Mikroskopie-Bildstapel und dreidimensionale Elektronenmikroskopie-Daten erfolgreich gezeigt 41 . Ein weiterer vielversprechender Ansatz könnte die Kombination dieses Protokolls mit der kürzlich veröffentlichten uDISCO-Methode sein, die auch auf einem organischen Lösungsmittel basiert und das die Untersuchung von viel größeren Organen durch einen Standard-LSFM 42 ermöglichen würde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Forschung im Labor von Gunzer wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stipendium Nr. 0315590 n.Chr.) Und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) unterstützt. Wir danken dem IMCES für technische Unterstützung und Sebastian Kubat für die Hilfe bei der 3D-Karikaturmodellierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
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