Summary
Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.
Abstract
La microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM), in combinazione con i protocolli chimici di compensazione, è diventata la norma d'oro per l'analisi di strutture a marchio fluorescente in grandi campioni biologici e si riduce alla risoluzione cellulare. Nel frattempo, la costante raffinazione dei protocolli sottostanti e la maggiore disponibilità di sistemi commerciali specializzati ci permettono di indagare sulla microstruttura di interi organi del mouse e permetterebbe anche la caratterizzazione del comportamento cellulare in vari approcci di immagini a cellule vive. Qui descriviamo un protocollo per la visualizzazione spaziale spaziale e la quantificazione della popolazione leucocitaria CD45 + nei cuori infiammati del topo. Il metodo utilizza un ceppo di topi transgenici (CD11c.DTR) che è stato recentemente dimostrato di essere un modello robusto e indicibile per lo studio dello sviluppo di miocardite fatale fulminante caratterizzato da aritmie cardiache letali. Questo protocollo comprende l'induzione del miocardite, intravitColorazione delle cellule mediate dall'anticorpo, preparazione dell'organo e LSFM con successiva elaborazione post-elaborazione di immagini assistite da computer. Anche se presentato come metodo altamente adattato per la nostra particolare questione scientifica, il protocollo rappresenta il progetto di un sistema facilmente regolabile che può anche orientare completamente differenti strutture fluorescenti in altri organi e anche in altre specie.
Introduction
Durante l'evoluzione della microscopia leggera, sono apparse molte forme specializzate, tutte sviluppate per minimizzare le limitazioni nel processo di visualizzazione di particolari campioni. Uno di questi è la microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM). In primo luogo sviluppato nel 1903 da Siedentopf e Zsigmondy 1 e trovando le prime applicazioni biologiche fondamentali nei primi anni 1990 2 , LSFM è divenuto lo strumento microscopico più potente fino ad oggi per la visualizzazione di grandi esemplari, come gli organi del topo intasati, con una risoluzione del segnale di fluorescenza Fino al livello cellulare. A causa di questi vantaggi, in combinazione con il suo potenziale per l'imaging a cellule vive, i metodi di natura denominati LSFM sono "il metodo dell'anno 2014 3 ".
Come suggerisce il nome, l'illuminazione del campione in un LSFM è condotta da fogli leggeri, orientati perpendicolarmente all'asse dell'obiettivo utilizzatoO la raccolta di emissioni e la formazione di immagini successive. Il foglio leggero viene generalmente generato sia concentrandosi su ampie fasce laser collimate con una lente cilindrica o con il rapido movimento laterale di fasci laser concentrati e concentrati in un solo piano orizzontale o verticale 4 , 5 . In questo modo, solo il piano focale delle ottiche di imaging viene illuminato, tipicamente con uno spessore di 1-4 μm. Di conseguenza, per un campione fluorescente posizionato nel piano di illuminazione, sia la generazione di luce sparsa che gli effetti della fotolibrazione dalle regioni superiori o inferiori al piano focale vengono eliminati o soppressi in modo significativo 6 , 7 . Poiché tutti i piani fuori fuoco non sono illuminati, in questi settori vengono omessi effetti di fotocolorazione. In contrasto con la microscopia standard confocale o multi-fotonica, i percorsi della luce illuminata e emessa sono separati l'uno dall'altro, quindi l'immagine finale di qual La funzione non dipende dalla messa a fuoco perfetta del fascio luminoso di eccitazione attraverso gli obiettivi. A seconda della questione sottostante, è quindi possibile utilizzare obiettivi con un campo di visibilità enorme (FOV) in modo che la più grande area possibile del piano illuminato possa essere ripresa senza che parte dei componenti si muovano nella direzione xy.
Nei moderni sistemi LSFM, un'immagine fluorescente della sezione ottica generata viene catturata su un dispositivo di accoppiamento altamente sensibile (CCD) o da telecamere a semiconduttore metallico-ossidi metallici (CMOS) complementari che sono in grado di acquisire l'intero campo di visualizzazione (FOV) In microsecondi. Pertanto, spostando il campione attraverso il foglio di luce e acquisendo immagini a z-step definite, è possibile ottenere le informazioni 3D complete di un esemplare in una ragionevole quantità di tempo 8 , 9 , rendendo questa tecnica applicabile a cellule vive Studi 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Tuttavia, anche se LSFM offre un metodo rapido, sensibile e fluorescente, la trasmissione della luce attraverso il campione è ancora un problema importante, specialmente quando i grandi campioni biologici sono l'obiettivo di un'analisi 3D. La trasmissione della luce è criticamente modificata dagli aspetti fisici dell'assorbimento e dalla dispersione della luce nelle interfacce di strutture con differenti indici di rifrazione 13 . Pertanto, quando si esegue l'esame di campioni diversi millimetri di dimensioni, LSFM è per lo più combinato con protocolli di compensazione per rendere i campioni otticamente trasparenti. Queste tecniche si basano sull'idea di rimuovere l'acqua dal rispettivo tessuto biologico e scambiandola con mezzi di immersione a base di solventi a base di acqua o (organica), scelti per adattarsi strettamente agli indici di rifrazione dei particolari componenti del tessuto bersaglio. Di conseguenza, la dispersione della luce laterale viene minimizzata e tutte le lunghezze d'ondaDella luce può passare molto più efficacemente attraverso il tessuto 13 . In molti casi, i campioni biologici trattati in questo modo appaiono macroscopicamente cristallini, che consentono di condurre LSFM, anche su interi organi del mouse, utilizzando lunghi obiettivi di ingrandimento a distanza di lavoro e di basso livello.
Qui presentiamo un protocollo di preparazione per l'imaging di grandi dimensioni in un microscopio a foglio leggero (vedi tabella dei materiali), che abbiamo stabilito per indagare l'infiltrato cardiaco cellulare in un modello murino di miocardite 15 . I topi CD11c.DTR esprimono il recettore della tossina della difterite primata (DTR) sotto il controllo del promotore CD11c 16 . Di conseguenza, le cellule in questi topi, che esprimono CD11c insieme al DTR, sono rese sensibili all'esotossina della difterite di Corynebacterium (tossina della difterite, DTX); Il trattamento sistemico di questi animali con DTX comporta un esaurimento di tutti i CD11c + ceLLS. CD11c è un integrin e, come ricettore di superficie cellulare per una varietà di diversi fattori solubili, è coinvolto nei processi di attivazione e di maturazione principalmente nelle cellule del linfociti monocitico 17 . Di conseguenza, il modello del mouse del CD11c.DTR è stato intensamente utilizzato per studiare il ruolo delle cellule dendritiche e dei sottosettori di macrofagi nel contesto di molte domande immunologiche diverse. Nel tempo, è stato riportato che i topi CD11c.DTR trattati sistematicamente con DTX possono sviluppare effetti collaterali avversi e possono mostrare elevati tassi di mortalità 18 , 19 . Recentemente siamo stati in grado di identificare la causa di morte 15 che descrive lo sviluppo della miocardite fulminante dopo l'applicazione intratracheale di DTX in questi animali. La sfida della tossina ha causato la distruzione cellulare, anche nelle parti centrali del sistema di trasmissione dello stimolo nel cuore. Questo è stato accompagnato da un massiccio CD45+ Leucociti infiltrano, portando finalmente ad aritmie cardiache letali. In questo caso, non solo era importante l'aspetto della popolazione leucocitaria, ma anche la sua distribuzione spaziale all'interno del cuore. Questa domanda sperimentale è una sfida per la moderna imaging microscopica, che abbiamo risolto con un approccio microscopico a fogliame leggero, supportato da una colorazione anticorpale intravitale e da un protocollo di depurazione ottica a base solvente.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità agli orientamenti dell'UE e sono stati approvati dalle autorità locali competenti di Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germania). Gli animali sono stati utilizzati e alloggiati in condizioni specifiche senza patogeni (SPF).
1. Induzione della Myocardite da Tossina Difteria (DTX)
- Preparare la soluzione DTX per l'induzione della miocardite diluendo la soluzione di base DTX con soluzione salina fosfatizzata (PBS) a una soluzione di lavoro di 1 μg / mL.
- Applicare 100 μL di questa soluzione intratrachealmente in topi CD11c.DTR da 8 a 10 settimane ( circa 5 ng / g di peso corporeo), come mostrato da Hasenberg et al. Per l'applicazione di una sospensione spore fungina 20 .
NOTA: L'applicazione intraperitoneale della tossina potrebbe determinare una simile induzione diMiocardite fatale. Tuttavia, questo approccio dovrebbe prima essere convalidato.- Per questa applicazione, anestetizzano gli animali con un'iniezione intraperitoneale (ip) di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina bw.
- Dopo aver raggiunto la narcosi profonda (intestino gli animali utilizzando un catetere venoso indotto da 22 G attraverso la cavità orale. Controllare il corretto posizionamento del tubo dell'obiettivo ventilando gli animali con un respiratore di piccole animali a una velocità di 250 breath per min e un volume di inalazione di 250 μl per respiro, anche mostrato da Hasenberg et. al. 20 .
NOTA: quando viene posizionato correttamente, la frequenza di respirazione degli animali cambia in base alle impostazioni di ventilazione applicate. - Scollegare il sistema di ventilazione e infondere 100 μL di soluzione DTX o uguale quantità di PBS come un controllo attraverso il catetere nel polmone e continuare a ventilare gli animali per un ulteriore min.
- Lasciate che gli animali si riprendano da anestesia e controllino lo stato di salute generale e il cambiamento di peso corporeo per 4 giorni.
NOTA: A seconda dello sfondo genetico, del ceppo del mouse o del peso iniziale, la gravità e l'insorgenza della miocardite potrebbero variare e dovrebbero essere determinati in primo luogo.
2. Preparazione del campione per la microscopia a foglio leggero
- 4 giorni dopo l'applicazione della tossina, anestetizzano i topi sciacquando una camera di induzione con una miscela al 2% di isoflurano / ossigeno vaporizzato. Iniettare 15 μg di un anticorpo anti-CD45 direttamente etichettato (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μL di PBS per via endovenosa (iv) utilizzando il percorso di applicazione retro-orbitale, che assicura un'applicazione molto veloce ed altamente precisa Corretta quantità di anticorpi.
NOTA: La profondità desiderata di narcosi è stata raggiunta quando i topi sono recanti e non reagiscono al test di pizzicamento del piede. - Dopo 2 ore di incubazione, sacrifica i topi con dislocazione cervicaleD perfora i cuori in situ con 5 ml di PBS / EDTA (5 mM).
- Esporre il cuore e iniettare la soluzione di perfusione nel ventricolo destro usando un catetere 21 G. Perfuso con pressione lenta e costante e assicurarsi che il sangue possa essere scaricato dopo aver tagliato l'aorta aperta.
NOTA: Questa perfusione transcardica potrebbe causare manufatti di preparazione minori, che potrebbero disturbare la visualizzazione 3D finale dell'organo. Pertanto, sperimentatori animali avanzati potrebbero effettuare la perfusione attraverso la vena cava inferiore, escciando l'aorta addominale.
- Esporre il cuore e iniettare la soluzione di perfusione nel ventricolo destro usando un catetere 21 G. Perfuso con pressione lenta e costante e assicurarsi che il sangue possa essere scaricato dopo aver tagliato l'aorta aperta.
- Per la fissazione chimica, perfezionare il cuore attraverso lo stesso incavo con 5 ml di 4% di paraformaldeide (PFA). Tenere il catetere in posizione e collegare semplicemente una nuova siringa riempita con PFA. Perfuso con pressione lenta e costante.
NOTA: Paraformaldeide altamente tossico; Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e altre mucose.- Procuratevi delicatamente il cuore con le pinze dentate; puSarà lievemente in alto; E tagliare tutti i collegamenti tissutali, tra cui le arterie in entrata e in uscita e le vene. Conservare l'organo per altri 4 h nel 4% di PFA per ulteriori fissazioni.
- Per disidratare l'organo, incubare il cuore in una serie ascendente di etanolo a 50%, 70% e due volte al 100%, ognuno per 12 h, a 4 ° C al buio. Qui usate i tubi di reazione di polipropilene da 5 mL, permettendo loro di ruotare costantemente in un rotatore di tubi usando una velocità di rotazione lenta per evitare la formazione di bolle d'aria.
- Preparazione completa del campione mediante compensazione chimica. Per rendere trasparenti i cuori, incubarli nel 98% di etere dibenzilico (DBE) continuando a ruotare durante la notte.
NOTA: DBE è irritante per gli occhi, la pelle e il sistema respiratorio.
3. Microscopia a foglio chiaro
- Eseguire LSFM utilizzando il microscopio a foglio leggero (vedere la tabella dei materiali). Posizionare il campione sul supporto campione standard del microscopio nel sacchetto riempito DBEVette, adatto per campioni fino a 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Tenere il campione saldamente in posizione durante l'acquisizione di immagini utilizzando blocchi di agarosio disidratati e smaltiti.
- Per preparare i blocchi di agarosio, versare il 2% di agarosio fuso in uno stampo (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lasciare raffreddare l'agarosio fino a che non si solidifichi.
- Dehidrarlo in una serie ascendente di etanolo (50%, 70% e due volte al 100%). Incubare i blocchi di agarosio durante la notte in 98% di DBE. Conservare l'agarosio in DBE finché non viene utilizzato.
NOTA: poiché l'agarosio è costituito prevalentemente da acqua, i tempi di incubazione per ogni fase di disidratazione possono essere estesi, a seconda della dimensione del blocco.
NOTA: DBE è irritante per gli occhi, la pelle e il sistema respiratorio. - Se necessario, tagliare il blocco agarosio preparato alla forma desiderata utilizzando un bisturi tagliente. In genere, tagliare forme prismatiche o cunei a posizionarsi ai bordi dell'adattatore di esempio.
NOTA: Poiché i blocchi di agarosio sono elastici,Il campione rimane in posizione quando viene spinto con poca forza.
- Rileva i segnali di fluorescenza di interesse (qui, l'autofluorescenza e la colorazione degli anticorpi anti-CD45) con le appropriate impostazioni di eccitazione e filtro di emissione.
- Per la rilevazione del segnale di autofluorescenza derivato dal tessuto connettivo, utilizzare un filtro a banda da 525/50 nm a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm (OPSL: 50 mW); La colorazione CD45 con un anticorpo AF647-accoppiato viene rilevata a 668 nm (filtro a banda passante: 680/30 nm) e ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 647 nm (laser diodo: 50 mW).
- Scegliere 4 μm come la distanza tra i due singoli z-piani.
4. Immagine post-elaborazione
NOTA: I dati digitali acquisiti sono stati ulteriormente elaborati con un software scientifico di elaborazione e analisi 3D 3D / 4D (vedere la tabella dei materiali).
- Apertura e pre-regolazione dei file di dati.
- Dopo aver avviato il software di analisi, selezionare il pulsante "Superpass" nell'angolo superiore sinistro. Per aprire gli stack di immagini, scegli "File", "Apri" e seleziona una cartella contenente i dati dal primo canale acquisito. Scegli "Modifica" e "Aggiungi canali" per aggiungere altri canali acquisiti.
NOTA: a seconda della dimensione dei dati e del sistema informatico, questo processo può richiedere alcuni minuti. Il protocollo presentato mostra tutte le fasi per 2 canali di acquisizione (autofluorescenza e AF647). - Correggere le dimensioni x, y e z voxel facendo clic su "Modifica" e selezionando "Proprietà immagine". Quando si apre la nuova finestra, regolare i parametri.
NOTA: questa fase dipende dal sistema microscopico impiegato e dal particolare formato dati. I valori xyz corretti sono fondamentali per le dimensioni successive e le misurazioni remote. Nella maggior parte dei casi, questi parametri vengono memorizzati come metadati nei file micrograph. Tuttavia, se il file foRmat non può essere interpretato correttamente dal software di analisi, è importante immettere manualmente le dimensioni dei pixel. La dimensione dei pixel nelle dimensioni x e y dipende dalla dimensione del pixel della fotocamera, dal potenziamento della cartella potenzialmente applicata e dall'obiettivo e dall'aumento dell'obiettivo. La dimensione dei pixel in z equivale alla dimensione del passo z definita automaticamente ( ad esempio, 4 μm).
- Prima trasformare il segnale di autofluorescenza in scala di grigi aprendo "Regolazione schermo" ("Modifica" e "Mostra regolazione schermo"). Una nuova finestra elenca tutti i canali aperti e le impostazioni di visualizzazione per tutti; Per modificare il colore predefinito, selezionare il canale di autofluorescenza e scegliere lo stile di visualizzazione "bianco". Fai clic su "ok" per applicare.
- Per la regolazione del livello nero, tornare a "Regolazione della visualizzazione" e regolare il valore del livello nero per escludere i segnali di sfondo indesiderati che non rappresentano la struttura del campioneS.
- A tal fine, utilizzare il triangolo superiore sinistro della barra di canale e trascinarlo da sinistra a destra.
NOTA: le modifiche verranno visualizzate immediatamente. Assicurarsi di sopprimere solo i segnali che non derivano dal campione. I valori minimi in background non devono mai essere "0" per evitare i pixel di pitch-black, in quanto potrebbero essere necessari i segnali acustici per ulteriori calcoli. Assicurarsi che tutte le modifiche di livello nero siano eseguite dopo l'acquisizione di immagini. Altrimenti, potrebbero essere perse informazioni preziose sul campione. L'aggiustamento del livello nero serve solo a scopi rappresentativi. Per utilizzare le stesse impostazioni di visualizzazione su campioni diversi, i valori precisi possono essere inseriti nel campo numerico "min" sotto l'elenco dei canali. Questo è molto utile per analisi quantitative.
- A tal fine, utilizzare il triangolo superiore sinistro della barra di canale e trascinarlo da sinistra a destra.
- Eseguire la regolazione dell'intensità, usando il triangolo superiore destro per regolare la rispettiva intensità del canale oppure immettendo valori precisi nel campo numerico "max" sotto la cassaL elenco.
- Eseguire la regolazione del contrasto trascinando il triangolo inferiore al centro della barra del canale per aumentare o diminuire il valore della gamma o immettendo i valori precisi.
- Regolare il canale AF647 in base al canale di autofluorescenza. Come differenza, impostare la visualizzazione del segnale AF647 su una tabella di ricerca a colori del calore. Fai questo scegliendo il modo canale "fuoco" in un approccio simile a quello descritto nel passaggio 4.2.1.
NOTA: Poiché le intensità complessive del segnale sono significativamente inferiori rispetto al canale di autofluorescenza, i livelli neri vengono normalmente regolati a valori molto inferiori. Per quanto riguarda il canale di autofluorescenza, la luminosità di questo canale è solitamente aumentata. - Selezionare la "modalità di miscelazione" per visualizzare dettagliatamente le strutture dei tessuti. Analizzare tutti i campioni di una serie con gli stessi valori dei parametri.
- Per praticamente tagliare aprire l'organo prima dell'esposizione scena 3DRt, applicare un piano di ritaglio sull'oggetto 3D reso.
- Fai clic sull'icona "Clipping Plane" (forbici) nell'elenco degli oggetti. All'interno della vista dell'immagine apparirà un telaio giallo e un manipolatore (mandrino bianco). Ruotare il mandrino all'estremità più sottile con il mouse, modificando così l'orientamento del piano di ritaglio e spostare la parte più spessa del mandrino per selezionare la profondità di taglio desiderata.
- Nascondere il fotogramma e il manipolatore deselezionando le rispettive caselle di controllo sotto l'elenco degli oggetti e creando gli snapshot desiderati.
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Representative Results
L'approccio presentato LSFM analizza la distribuzione e la quantità di leucociti nei cuori murini dopo l'induzione di una mieloma grave. La figura 1A spiega il protocollo di pre-trattamento per i topi transgenici CD11c.DTR per l'induzione di miocardite. Questo passo rappresenta il trigger necessario per l'assunzione di leucociti nel miocardio. Dopo un'applicazione DTX di successo, gli animali sviluppano gravi sintomi di malattia, come la debolezza generale, l'anoressia e la perdita di peso entro 2-4 giorni. Dopo 4 giorni, i leucociti vengono macchiati con l'iv . L'applicazione di anticorpi anti-CD45 accoppiati con fluorochrome prima della perfusione transcardica per rimuovere il sangue dalla circolazione. Se si esegue con successo, il cuore e altri organi diventano biancastri. Successivamente, l'organo viene eliminato e l'acqua di tessuto viene scambiata con DBE da una fila ascendente di etanolo e un'incubazione finale in DBE. La figura 1B mostra il calendarioDelle singole fasi di incubazione in cui l'organo subisce un ritiro significativo. L'organo chimicamente eliminato viene poi trasferito in una camera di imaging riempita con DBE sul supporto di tessuto microscopio standard. Per stabilizzare l'organo durante l'acquisizione di immagini 3D, viene fissata da blocchi agarosi trasparenti. Il posizionamento dettagliato del campione viene visualizzato in Figura 2 . L'acquisizione di un intero stack di immagini, composto da 2 canali (autofluorescenza e anti-CD45), richiede circa 20-30 min e genera un file di dati di circa 16 GB. Infine, i dati risultanti vengono analizzati come rendering 3D artificiale in cui la distribuzione delle leucociti viene visualizzata in una vista di calore. Nella figura 3 (riga superiore), le aree fortemente infiammate di un cuore di un animale trattato con DTX possono essere percepite per l'aspetto rossastro / bianco. Uno studio più dettagliato del modello 3D rivela la concentrazione delle leucociti, in particolare nelle regioni del sistema di conduzione cardiaca, come l'atriovent Fascio ricardato e fibre Purkinje. Al contrario, i cuori degli animali trattati con PBS non mostrano affatto questo tipo di infiammazione (riga inferiore).
Figura 1: Schema di induzione e preparazione di campioni di difterite Mycardite indotta da tossina. ( A ) Lo sviluppo del miocardite è stato indotto da esso . Applicazione della tossina della difterite (100 ng / animale). Dopo 4 giorni, la miocardite era completamente sviluppata ed è stato iniettato un anticorpo anti-CD45 accoppiato con AF647 (15 μg / animale) iv . Per rilevare leucociti CD45 + . Gli animali sono stati sacrificati 2 h più tardi dalla dislocazione cervicale e i cuori sono stati perfusi con PBS / EDTA (5 mM) seguito dal PFA al 4%. ( B ) Dopo la rimozione, l'organo è stato disidratato con una serie ascendente di etanolo e finalmente eliminato da incubazione di notte in dibenzil etere..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di posizionamento del campione nel microscopio. Il cuore trasparente chimico (4) è stato posizionato sul supporto di campione (2 e 5) e stabilizzato con l'aiuto di blocchi di agarosio (6). Questo costrutto fu poi sommerso nella cuvetta di vetro piena (3) di DBE. Per l'acquisizione, è stata impiegata una lente obiettivo 0,5 NA (1) con una distanza di lavoro di 5,5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rendering 3D rappresentativi di intero oGan Microscopia a foglio lucido. I topi CD11c.DTR sono stati trattati intratrachealmente con DTX (riga superiore) o PBS (riga inferiore). 4 giorni dopo, lo sviluppo della miocardite, rappresentata dall'infiltrazione delle leucociti CD45 + , è stata visualizzata mediante microscopia a luce fluorescente a fluorescenza. Per macchiare le cellule CD45 + , un anticorpo anti-CD45 accoppiato ad AF647 è stato iniettato iv 2 h prima di sacrificare i topi. Il segnale di autofluorescenza del tessuto connettivo viene visualizzato in grigio, mentre l'infiltrato CD45 + viene mostrato in colori calore (blu: segnale basso, bianco: alto segnale). Ogni riga è composta da 4 rendering 3D tagliati in digitale, dimostrando la situazione all'interno dell'organo. La profondità di ritaglio rispetto alla parte anteriore del cuore è dichiarata sopra le singole immagini. La figura è stata modificata da Mann et al. 15 . Barra di scala = 1 mm. Per favore clicca quiPer visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nella scienza della vita moderna, la visualizzazione microscopica dei processi biologici svolge un ruolo sempre più importante. In questo contesto, negli ultimi due secoli sono stati raggiunti molti sviluppi che aiutano a rispondere a domande indesiderabili fino a questo punto,. In primo luogo, c'è stata una chiara tendenza ad aumentare fondamentalmente la capacità di risoluzione dei microscopi leggeri. Con microscopia strutturata microscopia (SIM) 21 , 22 , microscopia 23 stimolata per la riduzione delle emissioni (STED) e microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) 24 , 25 o microscopia ottica statalastica di ricostruzione (STORM) 26 , Alla diffrazione luminosa 27 era significativamente rotto. La seconda sfida spesso mirata era quella di osservare il comportamento cellulare in un ambiente simileLa condizione naturale quanto più possibile. In questo contesto, lo sviluppo di approcci di imaging in situ o in vivo è stato costretto. Per superare la profondità di penetrazione limitata della luce nei tessuti biologici complessi, la microscopia a 2 fotoni 28 , 29 ha fissato nuovi standard in questo campo di ricerca.
Tuttavia, una caratteristica che tutte queste tecniche di microscopia di solito condividono è l'utilizzo di obiettivi ad alto livello NA per garantire la migliore risoluzione possibile. Anche se risolve in modo più dettagliato le microstrutture, l'utilizzo di obiettivi ad alto livello NA limita notevolmente il campo di vista e la distanza di lavoro. Di conseguenza, il contesto biologico in termini dell'ambiente circostante spesso esce dal fuoco nel senso più vero della parola. Per chiudere questo divario, lo sviluppo di LSFM ha recentemente guadagnato interesse fornendo una tecnica di microscopia in grado di risolvere le strutture fluorescenti a dimensione cellulareMa anche per valutare convenientemente l'intera dimensione 3D di un esemplare di dimensioni superiori a 1 cm.
Il protocollo qui descritto presenta un metodo di come impiegare un ultramicroscopio per visualizzare un infiltrato di leucociti cellulare in interi cuori murini. Dopo l'induzione efficace della miokardite sterile in un modello di topo CD11c.DTR 30 , il rispettivo animale riceve un'iniezione IV di un anticorpo anti-CD45 accoppiato con fluorochrome, che circola per 2 ore nell'animale vivente. In linea di principio, eseguendo un post-mortem, è necessario rendere possibile la colorazione dell'anticorpo tra la fissazione dell'organo e la disidratazione del campione. Purtroppo, la colorazione a tutto sesto richiede lunghi passi di incubazione e quindi massiccia aumenta il tempo necessario per la generazione del campione ( cioè per 4-21 giorni) 6 , 31 . Inoltre, questo approccio di colorazione intravitale non solo è più veloce, ma offre anchePenetrazione più efficace del tessuto anticorpo rispetto ad un protocollo di colorazione integrale 9 . Sebbene l'efficienza di colorazione assoluta non sia stata quantificata, si prevede che una grande percentuale della popolazione leucocitaria sia etichettata, dato che il segnale di fluorescenza risultante è notevolmente forte. Sia le proteine fluorescenti che l'etichettatura dell'anticorpo in sé sopravvivono in gran parte al successivo processo di depurazione, e entrambi sembrano essere stabili per un lungo periodo di tempo. Va anche notato che un agente a base solvente viene utilizzato per la compensazione dei tessuti. Questo ostacola massicciamente un approccio di colorazione intero dopo il processo di compensazione. La compensazione dei tessuti a base solvente è un fenomeno reversibile, quindi un trasferimento del tessuto depurato in un mezzo a base acquosa (come PBS), che di solito viene impiegato per la colorazione anticorpale standard, provocherà un campione non trasparente. Pertanto, dovrebbero essere stabiliti protocolli di colorazione non standard nei solventi organici i Fa è necessaria una procedura di colorazione a tutto tondo dopo la radura di campionamento.
La successiva perfusione del cuore è assolutamente necessaria per eliminare il maggior numero possibile di sangue residuo, poiché il sangue è scarso nelle seguenti fasi e peggiora drasticamente i risultati dell'immagine. Dopo aver staccato il cuore, l'acqua del tessuto viene rimossa in una fila di etanolo ascendente. Questo passo può essere considerato come la prima parte della compensazione chimica. L'idea è di sostituire l'acqua di tessuto con un mezzo di immersione che meglio corrisponde all'indice di rifrazione medio (RI) del campione di scelta. DBE è stato scelto come mezzo di immersione seguendo il protocollo di Ertuk et al. 32 , con alcune modifiche. DBE ha un indice di rifrazione di 1,55 (nD20) e quando è stato confrontato con altri agenti di compensazione, come l'alcool benzilico: benzilbenzoato (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6,7 o saccarosio (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, è meglio conservare le etichette fluorescenti usate in questo protocollo, mentre una simile conservazione della fluorescenza è stata ottenuta usando cinnamato etilico (ECI), abbiamo descritto il suo utilizzo in uno studio sulla quantificazione automatizzata dei glomeruli nei reni nefriti 9. Il muscolo Il tessuto, una volta stimato ad avere un indice di rifrazione di 1,382 ± 0,004 33 , è stato ugualmente ben eliminato con tutte le sostanze che abbiamo valutato 9 , quindi il fattore cruciale per la scelta del DBE era la conservazione della fluorescenza e non il potenziale di compensazione. Cambiare in questo protocollo di compensazione passiva, l'uso di un metodo attivo come CLARITY 34 , 35 , in cui la rimozione dei lipidi con l'ausilio di una corrente elettroforetica può provocare tessuti fortemente depolverati, tuttavia, a differenza di tale acqua Basata sul metodo di compensazione, la compensazione del DBE comporta un forte indurimentoDel tessuto, accompagnato da un ritiro minore. Ciò consente di gestire facilmente i campioni e non richiede ulteriori adattamenti per l'imaging, ad esempio l'incorporazione del campione in un blocco di agarosio. Pertanto, il trasferimento di questo protocollo ad un metodo come la CLARITY sarebbe impegnativo, ma la gente ha dimostrato con successo l'uso dell'ultramicroscopio scelto (vedere la tabella dei materiali) 3 . È importante valutare attentamente la potenziale distruzione dei segnali di fluorescenza endogena mediante il metodo di compensazione scelta. Poiché non abbiamo mai lavorato con CLARITY o altri protocolli di clearing attivi, non possiamo commentare la reazione fluorocromatica in questi sistemi. Il caso peggiore sarebbe che una successiva colorazione anticorpi a tutto tondo doveva essere eseguita.
Questo metodo è facilmente regolabile ad altri organi, come i polmoni murini; reni; cervelli; E anche ossa, come il femore, la tibia o il calvaria. Mentre valutazioni Il potenziale applicativo sulle nuove aree tissutali e / o nuove strategie di etichettatura fluorescente, la sfida più grande è solitamente progettare il protocollo in modo tale che la fluorescenza sia mantenuta viva. I mezzi di immersione a base solvente 13 e gli agenti di disidratazione 36 hanno un impatto diretto sull'integrità dei fluorochromi. Si consiglia l'uso di derivati di AlexaFluor, in quanto sembrano essere abbastanza stabili in vari protocolli. Tuttavia, molto spesso, devono essere impiegati altri fluorochromi. In questo caso, vale la pena di valutare l'utilizzo di altri agenti di compensazione ( ad esempio, Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , metil salicilato 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 e ECI 9 ) e altre alternative di disidratazione ( es. Metanolo e tetraidrofurano 13 ).
Come in molti altri approcci LSFM, il processo di posizionamento del cuore trasparente sotto il microscopio è esigente. I sistemi commerciali forniscono spazio sufficiente per installare campioni la dimensione degli organi del mouse, inclusi i lobi del polmone, i reni oi cuori. Tuttavia, al momento, non sono disponibili titolari di campionamento standard per questi esemplari. Pertanto, abbiamo dovuto stabilire un apparecchio di montaggio usando blocchi agarosio eliminati e riformati. Tuttavia, un certo numero di set di dati di immagine dovevano essere scartati a causa di manufatti di movimento. Questo problema è stato anche aumentato a causa del lungo tempo di acquisizione del microscopio utilizzato qui. Potenzialmente, la generazione di set di dati enormi guadagnerà notevolmente da sistemi più veloci, ma non abbiamo avuto la possibilità di utilizzare ancora un microscopio più veloce. Il nostro microscopio (vedi tabella oF) è stato costruito attorno ad un corpo microscopio a zoom e dotato di un modulo laser, di una telecamera sCMOS con dimensioni di pixel di 6,5 x 6,5 mm2 e di ottica di rilevazione con un ingrandimento ottico da 1,26x a 12,6x. La parte centrale dell'ottica di rilevazione era una lente obiettivo 0,5 NA con una distanza di lavoro di 5,5 mm, che ha permesso di osservare un ampio campo visivo che va da 1,7 a 17,6 mm in diagonale. Questo era abbastanza grande per eseguire la sezione ottica di interi cuori murini. La correzione dell'aberrazione cromatica, compresa tra 400 e 800 nm, è stata ottenuta con la regolazione meccanica dell'obiettivo. Se necessario, le correzioni cromatiche sono state ulteriormente eseguite durante l'elaborazione post-elaborazione assistita da computer. L'aberrazione sferica, anche in campioni più spessi, non è stata osservata in questo sistema e pertanto non è necessario correggere.
Nel complesso, qui presentiamo un robusto protocollo per la compensazione chimica e l'analisi delle aree spazialiDistribuzione di eucociti all'interno dei cuori murini usando la microscopia a foglio leggero. A questo punto, è importante sottolineare che questa procedura LSFM è difficilmente in grado di risolvere strutture di tessuto fine come i capillari. A questo proposito, questo LSFM è ben adatto per caratterizzare la distribuzione generale delle cellule immunitarie e per descrivere le potenziali accumulazioni delle cellule immunitarie all'interno dell'organo. Tuttavia, si deve tenere presente che LSFM in generale non è la scelta perfetta per analizzare e quantificare la localizzazione cellulare nelle sottostrutture di piccoli organi, come la vasculatura. Per rispondere a tali domande, LSFM dovrebbe essere integrato con altri metodi, come l'istologia o la microscopia a 2 fotoni. Ulteriori restrizioni di questo protocollo includono la limitazione a un massimo di 3-4 colori: il canale blu è difficile da usare per altri segnali a parte l'autofluorescenza, la restrizione a campioni fissi e la dimensione massima del campione di 30 mm x 30 mm x 15 mm. Inoltre, l'odore forte e la tossicità acuta del DBE dovrebbero essere preseN in considerazione. Se quest'ultimo punto è problematico, il cinnamato etilico può essere utilizzato come agente di compensazione alternativo 9 . Il principale vantaggio della scelta di questa tecnica di microscopia è la capacità di analizzare contemporaneamente l'intero organo. Nelle analisi convenzionali di sezioni tissutali istologiche con tessuto istologico con fusione di ematoxilina e di eosin, fissate con formalina e paraffina, esiste un'alta probabilità di mancanza di spazi spaziali importanti a meno che non venga analizzata ogni singola sezione. Inoltre, la microscopia a foglio leggero non solo consente il taglio virtuale del campione in ogni piano tridimensionale, ma offre anche questo potenziale senza distruggere il campione o causare artefatti di taglio. Se necessario, l'organo fisso potrebbe successivamente essere elaborato per ulteriori analisi, come ad esempio una luce correlativa e microscopia elettronica approcci per risolvere altamente particolari regioni di interesse. Un modello di tale studio può essere trovato nel lavoro di Karreman et al. , Dove la scommessa di correlazioneSono stati mostrati con successo una pila di immagini a microscopia a 2 fotoni e dati tridimensionali di microscopia elettronica 41 . Un altro approccio promettente potrebbe essere la combinazione di questo protocollo con il metodo uDISCO di recente pubblicazione che si basa anche su un solvente organico e che consentirebbe l'indagine di organi molto più grandi da un LSFM standard 42 .
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca nel laboratorio di Gunzer è stata sostenuta dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca (sovvenzione n. 0315590 AD) e dalla Fondazione tedesca di ricerca (donazione GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Ringraziamo inoltre l'IMCES per il supporto tecnico e Sebastian Kubat per l'aiuto con la modellazione 3D dei cartoni animati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
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