Summary
Здесь мы опишем метод микроскопии легких листов для визуализации инфильтрата сердечного CD45 + лейкоцита в мышиной модели асептического молниеносного миокардита, который индуцируется внутритрахеальной терапией дифтерийным токсином мышей CD11c.DTR.
Abstract
Световая флуоресцентная микроскопия (LSFM) в сочетании с протоколами химического очищения стала золотым стандартом для анализа флуоресцентно меченых структур в крупных биологических образцах и доходит до клеточного разрешения. Между тем, постоянное совершенствование базовых протоколов и расширение доступности специализированных коммерческих систем позволяют нам исследовать микроструктуру целых органов мыши и даже учитывать характеристики поведения клеток в различных подходах к визуализации живых клеток. Здесь мы описываем протокол для пространственной визуализации целостного монтирования и количественной оценки популяции лейкоцитов CD45 + в воспаленных сердцах мыши. В этом методе используется трансгенный штамм мыши (CD11c.DTR), который недавно был показан как надежная, индуцибельная модель для изучения развития молниеносного фатального миокардита, характеризующегося летальными сердечными аритмиями. Этот протокол включает индукцию миокардита, интравитОпосредованное антителом антитело, окрашивание клеток, подготовка органов и LSFM с последующей последующей обработкой изображения с помощью компьютера. Несмотря на то, что он представлен как высоко адаптированный метод для нашего конкретного научного вопроса, протокол представляет собой схему легко регулируемой системы, которая может также нацеливаться на совершенно разные флуоресцентные структуры в других органах и даже на других видах.
Introduction
Во время эволюции световой микроскопии появилось много специализированных форм, все они были разработаны для минимизации ограничений в процессе визуализации для отдельных образцов. Одним из таких методов является световая флуоресцентная микроскопия (LSFM). Впервые разработанный в 1903 году Siedentopf и Zsigmondy 1 и находя свой первый фундаментальный биологический прием в начале 1990-х годов 2 , LSFM стал самым мощным микроскопическим инструментом на сегодняшний день для визуализации крупных образцов, таких как интактные органы мыши, с разрешением сигнала флуоресценции Вплоть до уровня сотовой связи. Из-за этих преимуществ, в сочетании со своим потенциалом для визуализации живых клеток, Методы Природы назвали LSFM «Метод года 2014 3» .
Как следует из названия, подсветка образца в LSFM проводится световыми листами, которые ориентированы перпендикулярно оси используемой цели fИли сбор светового излучения и последующее формирование изображения. Легкий лист обычно генерируется либо путем фокусировки широких, коллимированных лазерных лучей с цилиндрической линзой, либо путем быстрого бокового движения узких фокусированных лазерных лучей только в одной горизонтальной или вертикальной плоскости 4 , 5 . Таким образом, освещается только фокальная плоскость оптики изображения, обычно с толщиной 1-4 мкм. Следовательно, для флуоресцентного образца, помещенного в плоскость освещения, как генерация рассеянного света, так и эффекты фотообесцвечивания из областей выше или ниже фокальной плоскости устраняются или сильно подавляются 6 , 7 . Поскольку все плоскости вне фокуса не подсвечиваются, в этих областях отсутствуют эффекты фотообесцвечивания. В отличие от стандартной конфокальной или многофотонной микроскопии пути освещенного и излучаемого света отделены друг от друга, поэтому качество конечного изображения Не зависит от идеальной фокусировки пучка возбуждающего света через цели. Поэтому в зависимости от основного вопроса можно использовать цели с огромным полем обзора (FOV), чтобы можно было визуализировать максимально возможную площадь освещенной плоскости без каких-либо составных частей, движущихся в направлении xy.
В современных LSFM-системах флуоресцентное изображение генерируемого оптического участка захватывается на высокочувствительном устройстве с зарядовой связью (CCD) или дополнительными металлооксидными полупроводниковыми (CMOS) камерами, которые могут приобретать все поле зрения (FOV) В микросекундах. Поэтому, перемещая образец через световой лист и приобретая изображения с заданными z-ступенями, можно получить полную трехмерную информацию образца за разумное время 8 , 9 , что делает эту методику применимой к живым клеткам Исследования 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Тем не менее, хотя LSFM предлагает быстрый, чувствительный и удобный для флуоресценции метод, передача света через образец по-прежнему является серьезной проблемой, особенно когда большие биологические образцы являются объектом 3D-анализа. Передача света критически модифицируется физическими аспектами поглощения и рассеяния света на границах структур с различными показателями преломления 13 . Поэтому, когда изображения обрабатывают несколько миллиметров в размерах, LSFM в основном объединяется с протоколами очистки, чтобы сделать выборки оптически прозрачными. Эти методы основаны на идее удаления воды из соответствующей биологической ткани и обмена ее с водными или (органическими) растворителями на основе растворителя, которые выбираются так, чтобы они были в узком соответствии с показателями преломления конкретных компонентов ткани-мишени. В результате боковое рассеяние света минимизируется, и все длины волнСвета может намного более эффективно проходить через ткань 13 . Во многих случаях биологические образцы, обработанные таким образом, кажутся макроскопически кристально чистыми, что позволяет проводить LSFM даже на всех органах мыши с использованием длинных рабочих расстояний с небольшим увеличением.
Здесь мы представляем протокол подготовки изображений с большой выборкой в световом микроскопе (см. Таблицу материалов), который мы установили для исследования клеточного сердечного инфильтрата в мышиной модели миокардита 15 . Мыши CD11c.DTR экспрессируют рецептор дифтерийного токсина приматов (DTR) под контролем промотора 16 CD11c. Следовательно, клетки у этих мышей, которые экспрессируют CD11c вместе с DTR, чувствительны к экзотоксину Corynebacterium diphtheria (дифтерийный токсин, DTX); Системное лечение этих животных с помощью DTX приводит к истощению всего CD11c + ceLLS. CD11c является интегрином и в качестве рецептора клеточной поверхности для множества различных растворимых факторов участвует в процессах активации и созревания в основном в клетках моноцитарной линии 17 . Следовательно, модель мыши CD11c.DTR интенсивно использовалась для изучения роли дендритных клеток и подмножеств макрофагов в контексте многих различных иммунологических вопросов. Со временем сообщалось, что мыши CD11c.DTR, системно обработанные DTX, могут вызывать неблагоприятные побочные эффекты и могут демонстрировать значительно повышенную смертность 18 , 19 . Недавно мы смогли идентифицировать основную причину смерти 15 , описывая развитие молниеносного миокардита после применения внутритрахеального DTX у этих животных. Проблема токсина вызывала разрушение клеток, в том числе в центральных частях системы передачи стимулов в сердце. Это сопровождалось массивным CD45+ Инфильтрат лейкоцитов, что в конечном итоге приводит к летальным сердечным аритмиям. В этом случае важно не только появление популяции лейкоцитов, но и его пространственное распределение внутри сердца. Этот экспериментальный вопрос представляет собой проблему для современной микроскопической визуализации, которую мы решили методом светового микроскопа, который поддерживается окрашиванием подмышечных антител и протоколом оптического очищения на основе органического растворителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами ЕС и были одобрены соответствующими местными органами власти в Эссене (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germany). Животных использовали и размещали в особых условиях без патогенов (SPF).
1. Индукция миокардита дифтерийным токсином (DTX)
- Подготовьте раствор DTX для индукции миокардита путем разбавления исходного раствора DTX забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) до рабочего раствора 1 мкг / мл.
- Применяют 100 мкл этого раствора внутритрахеально (он) к 8-10-недельным мышам CD11c.DTR ( примерно 5 нг / г массы тела (bw)), как показано Hasenberg et al. Для его применения грибковой спорной суспензии 20 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Внутрибрюшинное применение токсина может привести к аналогичной индукцииСмертельный миокардит. Однако этот подход должен быть сначала проверен.- Для этого применяют анестезию животных путем внутрибрюшинной (ip) инъекции 100 мг / кг массы тела кетамина и 10 мг / кг массы тела ксилазина.
- После достижения глубокого наркоза (тест пальца на носок), интубируйте животных с помощью 22-градусного венозного катетера в полости рта. Проверьте правильность позиционирования трубки объектива, вентилируя животных респиратором небольшого животного с частотой 250 вдохов в минуту и объемом ингаляции 250 мкл на один вдох, также показанным Hasenberg et. и др. 20 .
ПРИМЕЧАНИЕ. При правильном позиционировании скорость дыхания животных изменяется в соответствии с установленными настройками вентиляции. - Отключите систему вентиляции и установите 100 мкл раствора DTX или равное количество PBS в качестве контроля через катетер в легкие и продолжайте вентиляцию животных в течение 1 дополнительной минуты.
- Позвольте животным оправиться от анестезии и следить за общим состоянием здоровья и изменением веса тела в течение 4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от генетического фона, мышечного напряжения или начального веса, тяжесть и начало миокардита могут меняться и должны определяться в первую очередь.
2. Подготовка образца для световой микроскопии
- Через 4 дня после применения токсина обезболивают мышей, промывая индукционную камеру испарением 2% смеси изофлуран / кислород. Инъецировать 15 мкг непосредственно меченого анти-CD45-антитела (клон 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) в 50 мкл PBS внутривенно (iv) с использованием ретро-орбитального маршрута нанесения, что обеспечивает очень быстрое и высокоточное применение Правильное количество антител.
ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая глубина наркоза была достигнута, когда мышей лежат и не реагируют на точечное тестирование. - Через 2 часа инкубации пожертвуйте мышами с помощью дислокации шейки матки иD перфузировать сердца in situ 5 мл PBS / EDTA (5 мМ).
- Выложить сердце и ввести перфузионный раствор в правый желудочек с помощью катетера 21 G. Перфузируйте с медленным, постоянным давлением и убедитесь, что кровь может быть слита после разрезания аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эта транскардиальная перфузия может привести к незначительным артефактам препарата, которые могут нарушить окончательную трехмерную визуализацию органа. Поэтому опытные экспериментаторы животных могли выполнять перфузию через нижнюю полость вены, вырезая брюшную аорту.
- Выложить сердце и ввести перфузионный раствор в правый желудочек с помощью катетера 21 G. Перфузируйте с медленным, постоянным давлением и убедитесь, что кровь может быть слита после разрезания аорты.
- Для химической фиксации, перфузируйте сердце через ту же самую выемку с 5 мл 4% параформальдегида (PFA). Держите катетер на месте и просто прикрепите новый шприц, заполненный PFA. Перфузируйте с медленным и постоянным давлением.
ПРИМЕЧАНИЕ. Параформальдегид очень токсичен; Избегайте контакта с кожей, глазами и другой слизистой оболочкой.- Аккуратно возьмите сердце с зубчатыми щипцами; о.е.Немного вверх; И разрезать все соединения ткани, включая входящие и исходящие артерии и вены. Храните орган еще на 4 часа в 4% PFA для дальнейшей фиксации.
- Чтобы обезводить орган, инкубируйте сердце в восходящей серии этанола при 50%, 70% и дважды при 100%, каждый в течение 12 ч, при 4 ° С в темноте. Здесь используют черные 5 мл полипропиленовые реакционные трубки, что позволяет им постоянно вращаться в ротаторе трубки с использованием медленной скорости вращения для предотвращения образования пузырьков воздуха.
- Полная подготовка образцов путем химической очистки. Чтобы сделать сердца прозрачными, инкубируйте их в 98% дибензиловом эфире (DBE), постоянно вращаясь в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: DBE раздражает глаза, кожу и респираторную систему.
3. Светометная микроскопия
- Проведите LSFM с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов). Поместите образец на стандартный образец держателя микроскопа в заполненный DBE cuVette, который подходит для образцов размером до 30 мм х 30 мм х 15 мм.
- Удерживайте образец на месте во время получения изображения, используя обезвоженные и очищенные блоки агарозы.
- Для приготовления агарозных блоков залейте 2% расплавленной агарозы в форму (15 мм × 15 мм × 5 мм). Пусть агароза остынет, пока не затвердеет.
- Обезвоживают его в восходящем этаноле (50%, 70% и дважды при 100%). Инкубируйте агарозные блоки в течение ночи в 98% DBE. Храните агарозу в DBE до тех пор, пока она не будет использована.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку агароза состоит в основном из воды, время инкубации для каждой стадии дегидратации может быть увеличено в зависимости от размера блока.
ПРИМЕЧАНИЕ: DBE раздражает глаза, кожу и респираторную систему. - При необходимости отрежьте подготовленный блок агарозы до желаемой формы с помощью острого скальпеля. Как правило, вырезать призменные или клиновидные формы для размещения по краям адаптера образца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку агарозные блоки эластичны,Образец остается на месте при толчке с небольшой силой.
- Определите интересующие флуоресцентные сигналы (здесь, окрашивание автофлуоресценции и анти-CD45-антитела) с соответствующими настройками фильтра возбуждения и излучения.
- Для обнаружения сигнала аутофлуоресценции соединительной ткани используйте полосовой фильтр 525/50 нм на длине волны возбуждения 488 нм (OPSL: 50 мВт); Окрашивание CD45 антителом, связанным с AF647, обнаруживается при 668 нм (полосовой фильтр: 680/30 нм) и на длине волны возбуждения 647 нм (диодный лазер: 50 мВт).
- Выберите 4 μm как расстояние между двумя отдельными z-плоскостями.
4. Обработка изображения после обработки
ПРИМЕЧАНИЕ. Полученные данные цифрового изображения были дополнительно обработаны научным программным обеспечением для обработки и анализа изображений 3D / 4D (см. Таблицу материалов).
- Открытие и предварительная настройка файлов данных.
- После запуска программного обеспечения для анализа выберите кнопку «Surpass» в верхнем левом углу. Чтобы открыть стеки изображений, выберите «Файл», «Открыть» и выберите папку, содержащую данные с первого приобретенного канала. Выберите «Изменить» и «Добавить каналы», чтобы добавить дополнительные каналы.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от размера данных и компьютерной системы этот процесс может занять несколько минут. Представленный протокол демонстрирует все этапы для двух каналов приема (автофлуоресценция и AF647). - Исправьте размеры x, y и z voxel, нажав «Изменить» и выбрав «Свойства изображения». Когда откроется новое окно, отрегулируйте параметры.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг зависит от используемой системы микроскопа и конкретного формата данных. Правильные значения xyz являются критическими для последующих размеров и дальних измерений. В большинстве случаев эти параметры сохраняются как метаданные в файлах микрофотографии. Однако, если файл foRmat не может быть правильно интерпретирован программным обеспечением анализа, важно вручную ввести размер пикселя. Размер пикселя в размерах x и y зависит от размера пикселя камеры, потенциально используемого биннинга и объектива и объективного увеличения. Размер пикселя в z эквивалентен самоопределяемому размеру z-шага ( например, 4 мкм).
- Сначала преобразуйте сигнал автофлуоресценции в оттенки серого, открыв «Регулировку дисплея» («Изменить» и «Показать настройку дисплея»). В новом окне будут перечислены все открытые каналы и настройки отображения для всех них; Для изменения цвета по умолчанию, выберите канал автофлуоресценции и выберите «белый» стиль отображения. Нажмите «ok», чтобы применить.
- Для регулировки уровня черного вернитесь к «Настройка дисплея» и отрегулируйте значение уровня черного, чтобы исключить нежелательные фоновые сигналы, которые не представляют собой структуру образцаs.
- Для этого используйте верхний левый треугольник на панели каналов и перетащите его слева направо.
ПРИМЕЧАНИЕ. Изменения будут визуализированы немедленно. Удостоверьтесь, что вы подавляете сигналы, не являющиеся результатом выборки. Минимальные значения в фоновом режиме никогда не должны быть «0», чтобы избежать пиксельных пикселей, поскольку шумовые сигналы могут потребоваться для дополнительных вычислений. Убедитесь, что все изменения уровня черного выполняются после получения изображения. В противном случае ценная информация о образцах может быть потеряна. Регулировка уровня черного просто служит представительным целям. Чтобы использовать одни и те же настройки дисплея по разным образцам, точные значения можно ввести в числовое поле «min» под списком каналов. Это очень полезно для количественного анализа.
- Для этого используйте верхний левый треугольник на панели каналов и перетащите его слева направо.
- Выполните настройку интенсивности, либо используя верхний правый треугольник, чтобы настроить соответствующую интенсивность канала, либо путем ввода точных значений в числовое поле «max» под каналомL список.
- Выполните настройку контрастности, перетащив нижний треугольник в середине полосы канала, чтобы увеличить или уменьшить значение гаммы или ввести точные значения.
- Отрегулируйте канал AF647 в соответствии с каналом автофлуоресценции. В качестве отличия установите визуализацию сигнала AF647 в таблицу цветного отображения тепла. Сделайте это, выбрав режим канала «огонь» в подходе, аналогичном описанному на шаге 4.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку общие интенсивности сигналов значительно ниже по сравнению с каналом автофлуоресценции, уровни черного обычно регулируются до гораздо более низких значений. Что касается канала автофлуоресценции, яркость этого канала обычно увеличивается. - Выберите «режим наложения», чтобы подробно просмотреть структуры ткани. Проанализируйте все образцы из одной серии с теми же значениями параметров.
- Чтобы фактически вырезать орган перед экспонированием 3D-сценыRt, примените плоскость отсечения на рендеринг 3D-объекте.
- Нажмите на значок «Обрезная плоскость» (ножницы) в списке объектов. Внутри изображения появится желтая рамка и манипулятор (белый шпиндель). Поверните шпиндель на более тонком конце с помощью мыши, тем самым изменив ориентацию плоскости отсечения и переместите более толстую среднюю часть шпинделя, чтобы выбрать желаемую глубину отсечения.
- Скройте рамку и манипулятор, сняв флажки под списком объектов и создав нужные снимки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный подход LSFM анализирует распределение и количество лейкоцитов в сердцах мыши при индукции тяжелого миокардита. Рисунок 1A объясняет протокол предварительной обработки для трансгенных мышей CD11c.DTR для индукции миокардита. Этот шаг представляет собой необходимый триггер для вербовки лейкоцитов в миокард. После успешного применения DTX у животных развиваются тяжелые симптомы заболевания, такие как общая слабость, анорексия и потеря веса в пределах 2-4 дней. Через 4 дня лейкоциты окрашиваются внутривенно . Применение флюорохромного антитела против CD45 до транскрипционной перфузии для удаления крови из кровообращения. Если выполнено успешно, сердце и другие органы становятся беловатыми. Затем орган вырезают, и тканевую воду обменивают с DBE по восходящему эталонному ряду и окончательную инкубацию в DBE. На рисунке 1B показано расписаниеИндивидуальных этапов инкубации, при которых орган подвергается значительной усадке. Химически очищенный орган затем переносят в заполненную DBE камеру для визуализации на стандартном держателе для микроскопа. Чтобы стабилизировать орган при получении 3D-изображения, он фиксируется прозрачными агарозными блоками. Детальное позиционирование образца показано на рисунке 2 . Приобретение всего пакета изображений, состоящего из двух каналов (автофлуоресценция и анти-CD45), занимает около 20-30 минут и генерирует файл данных размером около 16 ГБ. Наконец, полученные данные анализируются как искусственный 3D-рендеринг, в которых распределение лейкоцитов отображается в виде тепловой карты. На рисунке 3 (верхний ряд) сильно воспаленные области сердца обработанного DTX животным могут быть восприняты их красноватым / беловатым внешним видом. Более подробное исследование трехмерной модели показывает концентрацию лейкоцитов, особенно в областях системы сердечной проводимости, таких как атриуент Пучок жгутов и волокна Пуркинье. Напротив, сердца животных, обработанных PBS, вообще не показывают эту картину воспаления (нижний ряд).
Рисунок 1: Схема индукции и подготовки образцов миокарда, индуцированного дифтерией. ( A ) Развитие миокардита было вызвано этим . Применение дифтерийного токсина (100 нг / животное). Через 4 дня миокардит полностью развился и в него вводили AF647-антитело против CD45 (15 мкг / животное) . Для обнаружения CD45 + лейкоцитов. Животных умерщвляли через 2 часа путем диссекции шейки матки, и сердца перфузировали PBS / EDTA (5 мМ), а затем 4% PFA. ( B ) После удаления орган дегидратировали с помощью восходящей серии этанола и, наконец, очищали путем инкубации в течение ночи в дибензиловом эфире..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема позиционирования образца в микроскопе. Химически очищенное прозрачное сердце (4) помещалось на держатель образца (2 и 5) и стабилизировалось с помощью очищенных блоков агарозы (6). Затем эту конструкцию погружали в заполненную DBE стеклянную кювету (3). Для получения использовалось объектив с объективом 0,5 NA (1) с рабочим расстоянием 5,5 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные 3D визуализации целых илиGan Light-sheet Microscopy. Мышей CD11c.DTR обрабатывали intratracheally с помощью DTX (верхняя строка) или PBS (нижняя строка). Через 4 дня развитие миокардита, представленное инфильтрацией CD45 + лейкоцитов, визуализировалось с помощью флуоресцентной световой микроскопии. Чтобы окрашивать клетки CD45 + , антитело против CD45, связанное с AF647, вводили за 2 ч перед тем, как принести в жертву мышей. Сигнал аутофлуоресценции соединительной ткани отображается серым цветом, тогда как инфильтрат CD45 + показан в цветах тепловой карты (синий: низкий сигнал, белый: высокий сигнал). Каждая строка состоит из четырех цифровых визуализаций с цифровым обрезанием, демонстрирующих ситуацию внутри органа. Глубина отсечения относительно передней части сердца объявляется над отдельными изображениями. Этот рисунок был изменен от Mann et al. 15 . Шкала шкалы = 1 мм. Нажмите здесьДля просмотра увеличенной версии этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В современной науке о жизни микроскопическая визуализация биологических процессов играет все более важную роль. В этом контексте за последние два столетия было достигнуто много событий, которые помогают отвечать на вопросы, не адресуемые до этого момента. Во-первых, существует явная тенденция к фундаментальному увеличению разрешающей способности легких микроскопов. С помощью структурированной осветительной микроскопии (SIM) 21 , 22 , микроскопии стимулированного эмиссионного истощения (STED) 23 и фотоактивированной локализующей микроскопии (PALM) 24 , 25 или стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) 26 , Для легкой дифракции 27 был значительно нарушен. Второй часто целевой задачей было наблюдение за клеточным поведением в окружающей среде, напоминающейЕстественное состояние как можно ближе. В этом контексте были сделаны попытки создания подходов к визуализации in situ или in vivo . Чтобы преодолеть ограниченную глубину проникновения света в сложные биологические ткани, 2-фотонная микроскопия 28 , 29 установила новые стандарты в этой области исследований.
Однако особенностью, которой обычно пользуются все эти методы микроскопии, является использование целей высокого уровня NA для обеспечения наилучшего разрешения. Хотя он более подробно решает микроструктуры, использование целей высокого уровня NA значительно ограничивает поле зрения, а также рабочее расстояние. Как следствие, биологический контекст с точки зрения окружающей среды часто выходит из фокуса в прямом смысле этого слова. Чтобы закрыть этот пробел, развитие LSFM в последнее время приобрело интерес, предоставляя микроскопический метод, который способен разрешать флуоресцентные структуры при клеточном размереНо и для удобства оценки всей трехмерной информации образца размером более 1 см.
Протокол, описанный здесь, представляет собой способ использования ультрамикроскопа для визуализации клеточного лейкоцитарного инфильтрата в целых сердцах мыши. После успешной индукции стерильного миокардита в модели 30 мыши CD11c.DTR соответствующее животное получает внутривенную инъекцию антитела против CD45 с флюорохромом, которое циркулирует в течение 2 ч у живого животного. В принципе, выполняя посмертное всплеск, должно быть возможно окрашивание цельного антитела между фиксацией органа и обезвоживанием образца. К сожалению, цельное окрашивание требует гораздо более длительных этапов инкубации и поэтому значительно увеличивает время, необходимое для создания образца ( т. Е. На 4-21 день) 6 , 31 . Кроме того, этот подход, основанный на прижизненном окрашивании, не только быстрее, но и обеспечиваетБолее эффективное проникновение ткани в антитело по сравнению с протоколом 9 полного окрашивания. Хотя абсолютная эффективность окрашивания не была количественно определена, ожидается, что значительная часть популяции лейкоцитов будет помечена, учитывая, что полученный флуоресцентный сигнал является чрезвычайно сильным. И флуоресцентные белки, и сама маркировка антител в значительной степени выживают после последующего процесса очистки, и оба они выглядят стабильными в течение длительного периода времени. Следует также отметить, что для очистки ткани используется агент на основе растворителя. Это в значительной степени затрудняет подход к окрашиванию цельной смолы после процесса очистки. Очистка ткани на основе растворителя является обратимым явлением, поэтому перенос очищенной ткани в среду на водной основе (например, PBS), которая обычно используется для стандартного окрашивания антител, приведет к непрозрачному образцу. Следовательно, должны быть установлены нестандартные протоколы окрашивания в органических растворителях i После очистки образца требуется целая окраска.
Последующая перфузия сердца абсолютно необходима для устранения как можно большего количества остаточной крови, поскольку кровь плохо очищается на следующих этапах и резко ухудшает результаты визуализации. После вырезания сердца тканевая вода удаляется в восходящем ряду этанола. Этот шаг можно рассматривать как первую часть химической очистки. Идея состоит в том, чтобы заменить тканевую воду погружной средой, которая лучше соответствует среднему показателю преломления (RI) выбранного образца. DBE был выбран в качестве иммерсионной среды по протоколу Ertuk et al. 32 , с некоторыми изменениями. DBE имеет показатель преломления 1,55 (nD20) и при сравнении с другими очищающими агентами, такими как бензиловый спирт: бензилбензоат (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6,7 или сахароза (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, лучше всего сохранить флуоресцентные метки, используемые в этом протоколе. Аналогичное сохранение флуоресценции было получено с использованием этил циннамата (ECI). Мы описали его использование в исследовании автоматизированной количественной оценки клубочков в нефротических почках 9. Мышцы Ткань, оцененная с показателем преломления 1,382 ± 0,004 33 , была одинаково хорошо очищена всеми веществами, которые мы оценивали 9. Поэтому решающим фактором для выбора DBE было сохранение флуоресценции, а не клиринговый потенциал. Изменение этого протокола пассивной очистки, использование активного метода, такого как CLARITY 34 , 35 , где удаление липидов с помощью электрофоретического тока приводит к сильно очищенным тканям, должно быть возможным. Однако в отличие от такой воды Основанный на очистке, очистка DBE приводит к значительному упрочнениюТкани, сопровождающейся незначительной усадкой. Это позволяет легко обрабатывать образцы и не требует дополнительных адаптаций для визуализации, таких как встраивание образца в блок агарозы. Поэтому перенос этого протокола на такой метод, как CLARITY, будет сложным, но люди успешно продемонстрировали использование выбранного ультрамикроскопа (см. Таблицу материалов) с помощью этого подхода 3 . Важно тщательно оценить потенциальное разрушение сигналов эндогенной флуоресценции с помощью выбранного метода очистки. Поскольку мы никогда не работали с CLARITY или другими протоколами активной очистки, мы не можем комментировать реакцию флуорохрома в этих системах. Наихудший случай заключается в том, что последующее окрашивание антител цельного монстра должно быть выполнено.
Этот метод легко регулируется для других органов, таких как мышиные легкие; почек; мозги; И даже кости, такие как бедра, голени или кальварии. Хотя оценка Потенциал приложения на новых участках ткани и / или новые стратегии флуоресцентной маркировки, самой большой проблемой обычно является разработка протокола таким образом, чтобы флуоресценция поддерживалась. Иммерсионная среда 13 на основе растворителя и дегидратирующие агенты 36 оказывают непосредственное влияние на целостность флюорохромов. Рекомендуется использовать производные AlexaFluor, поскольку они, по-видимому, довольно стабильны в различных протоколах. Однако очень часто необходимо использовать другие флуорохромы. В этом случае, безусловно, стоит оценить использование других очищающих агентов ( например, шкала 37 , кубическая 38 , сукроза 13 , ясность 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , метилсалицилат 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 и ECI 9 ) и другие варианты обезвоживания ( например, метанол и тетрагидрофуран 13 ).
Как и во многих других подходах LSFM, требуется процесс позиционирования прозрачного сердца под микроскопом. Коммерческие системы обеспечивают достаточное пространство для установки образцов размером с органы мыши, включая легочные дольки, почки или сердца. Однако на данный момент нет стандартных держателей образцов для этих образцов. Поэтому нам нужно было установить монтажное устройство, используя очищенные и повторно сформированные блоки агарозы. Тем не менее, определенное количество наборов данных изображений должно было быть отброшено из-за артефактов движения. Эта проблема также была увеличена из-за длительного времени использования используемого здесь микроскопа. Потенциально, генерация огромных наборов данных принесет большую пользу из более быстрых систем, но у нас не было возможности использовать более быстрый микроскоп. Наш микроскоп (см. Таблицу oF) была построена вокруг корпуса микроскопа с зумом и оснащена лазерным модулем, камерой sCMOS с размером пикселей 6,5 x 6,5 мм 2 и оптикой обнаружения с оптическим диапазоном увеличения от 1,26X до 12,6X. Центральная часть оптики обнаружения была объективом 0,5 NA с рабочим расстоянием 5,5 мм, что позволило наблюдать большое поле зрения в диапазоне от 1,7 до 17,6 мм по диагонали. Это было достаточно большим, чтобы выполнить оптическое разделение целых мышечных сердец. Коррекция хроматической аберрации от 400 до 800 нм была достигнута путем механической корректировки объектива. Там, где это необходимо, хроматические поправки были дополнительно выполнены во время последующей обработки компьютером. Сферическая аберрация, также в более толстых образцах, не наблюдалась в этой системе, и поэтому ее не нужно было исправлять.
В целом, мы приводим здесь надежный протокол для химической очистки и анализа пространственного lРаспределение эукоцитов внутри мышиных сердец с использованием микроскопии легкого листа. На этом этапе важно подчеркнуть, что эта процедура LSFM вряд ли способна разрешать тонкие тканевые структуры, такие как капилляры. В этом отношении этот LSFM хорошо подходит для характеристики общего распределения иммунных клеток и для описания потенциальных накоплений иммунных клеток внутри органа. Однако следует иметь в виду, что LSFM в целом не является идеальным выбором для анализа и количественной оценки клеточной локализации в субструктурах небольших органов, таких как сосудистая сеть. Чтобы ответить на такие вопросы, LSFM следует дополнить другими методами, такими как гистология или 2-фотонная микроскопия. Дальнейшие ограничения этого протокола включают ограничение до 3-4 цветов - синий канал трудно использовать для других сигналов, кроме автофлуоресценции - ограничение на фиксированные образцы и максимальный размер выборки 30 мм х 30 мм х 15 мм. Кроме того, сильный запах и острая токсичность DBE следует приниматьN. Если последняя точка проблематична, этилциннамат можно использовать в качестве альтернативного очищающего агента 9 . Основным преимуществом выбора этого метода микроскопии является способность анализировать весь орган сразу. При традиционном анализе гематоксилиновых и эозиновых окрашенных, формалин-фиксированных и парафиновых (FFPE) участков гистологической ткани существует высокая вероятность отсутствия важных пространственных областей, если не проанализировать каждую отдельную секцию. Кроме того, световая микроскопия не только позволяет виртуальную резку образца в каждой трехмерной плоскости, но также предлагает этот потенциал, не разрушая образец или не вызывая резки артефактов. При необходимости фиксированный орган может быть впоследствии обработан для дальнейших анализов, таких как корреляционные подходы к свету и электронной микроскопии для разрешения конкретных областей, представляющих интерес. Шаблон для такого исследования можно найти в работе Karreman et al. , Где ставка корреляцииВ результате была успешно показана 2-фотонная микроскопия и трехмерные данные электронной микроскопии 41 . Другим перспективным подходом может быть сочетание этого протокола с недавно опубликованным методом uDISCO, который также основан на органическом растворителе и который позволит исследовать гораздо большие органы по стандарту LSFM 42 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Gunzer были поддержаны Федеральным министерством образования и исследований Германии (грант № 0315590 AD) и Немецким исследовательским фондом (грант № GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Мы также благодарим IMCES за техническую поддержку и Себастьяна Кубата за помощь в 3D-моделировании мультфильмов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
