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Medicine

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

doi: 10.3791/55450 Published: May 31, 2017

Summary

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Abstract

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM), en combinación con los protocolos de eliminación química, se ha convertido en el estándar de oro para el análisis de estructuras marcadas con fluorescencia en muestras biológicas grandes, y es hasta la resolución celular. Mientras tanto, el refinamiento constante de los protocolos subyacentes y la mayor disponibilidad de sistemas comerciales especializados nos permiten investigar la microestructura de los órganos de ratones enteros e incluso permitir la caracterización del comportamiento celular en varios enfoques de imágenes de células vivas. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de todo el espacio espacial de la población de leucocitos CD45 + en corazones de ratón inflamados. El método emplea una cepa de ratón transgénico (CD11c.DTR) que recientemente se ha mostrado que sirve como un modelo robusto e inducible para el estudio del desarrollo de la miocarditis fatal fulminante, caracterizada por arritmias cardíacas letales. Este protocolo incluye la inducción de miocarditis, intravitAl mediada por anticuerpos, preparación de órganos y LSFM con subsiguiente procesamiento de imágenes asistido por ordenador. Aunque presentado como un método altamente adaptado para nuestra particular cuestión científica, el protocolo representa el modelo de un sistema fácilmente ajustable que también puede dirigirse a estructuras fluorescentes completamente diferentes en otros órganos e incluso en otras especies.

Introduction

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Durante la evolución de la microscopía óptica, aparecieron muchas formas especializadas, todas ellas desarrolladas para minimizar las limitaciones en el proceso de visualización de especímenes particulares. Uno de estos métodos es la microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). Desarrollado en 1903 por Siedentopf y Zsigmondy 1 y encontrando sus primeras aplicaciones biológicas fundamentales a principios de la década de 1990 2 , LSFM se ha convertido en la herramienta microscópica más poderosa hasta la fecha para la visualización de especímenes grandes, como órganos de ratones intactos, con una resolución de señal de fluorescencia Hasta el nivel celular. Debido a estos beneficios, en combinación con su potencial de imágenes de células vivas, Nature Methods nombró a LSFM como el "Método del Año 2014 3 ".

Como su nombre sugiere, la iluminación de la muestra en un LSFM es conducida por hojas de luz, que están orientadas perpendicularmente al eje del objetivo utilizado fO la recolección de luz de emisión y posterior formación de imagen. La lámina de luz se genera generalmente centrando los rayos láser colimados anchos con una lente cilíndrica o por el movimiento lateral rápido de rayos láser estrechos enfocados en apenas un plano horizontal o vertical 4 , 5 . De esta forma, sólo se ilumina el plano focal de la óptica de formación de imágenes, típicamente con un espesor de 1-4 μm. Por consiguiente, para una muestra fluorescente colocada en el plano de iluminación, tanto la generación de luz dispersa como los efectos del fotoblanqueo desde regiones por encima o por debajo del plano focal se eliminan o se suprimen en gran medida 6 , 7 . Como todos los planos fuera de foco no se iluminan, los efectos de fotoblanqueo se omite en estas áreas. En contraste con la microscopía confocal o multi-fotónica estándar, los caminos de la luz iluminada y emitida están separados unos de otros, por lo que la imagen final qual No depende del enfoque perfecto del haz de luz de excitación a través de los objetivos. Dependiendo de la pregunta subyacente, es posible utilizar objetivos con un campo de visión enorme (FOV) de modo que la mayor área posible del plano iluminado pueda ser visualizada sin ninguna parte componente que se mueva en la dirección xy.

En los modernos sistemas LSFM, se capta una imagen fluorescente de la sección óptica generada en un dispositivo de carga acoplada altamente sensible (CCD) o cámaras de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS), que son capaces de adquirir todo el campo de visión (FOV) En microsegundos. Por lo tanto, moviendo la muestra a través de la lámina de luz y adquiriendo imágenes a pasos z definidos, es posible obtener la información 3D completa de una muestra en una cantidad de tiempo razonable 8 , 9 , haciendo esta técnica aplicable para células vivas Estudios 10 ,Asno = "xref"> 11 , 12 .

Sin embargo, aunque LSFM ofrece un método rápido, sensible y amigable a la fluorescencia, la transmisión de luz a través de la muestra sigue siendo un problema importante, especialmente cuando las grandes muestras biológicas son el blanco para un análisis 3D. La transmisión de la luz se modifica críticamente por los aspectos físicos de la absorción y por la dispersión de la luz en las interfaces de las estructuras con diferentes índices de refracción [ 13] . Por lo tanto, cuando las muestras de imagen de varios milímetros de tamaño, LSFM se combina en su mayoría con los protocolos de limpieza para hacer las muestras ópticamente transparente. Estas técnicas se basan en la idea de eliminar el agua del respectivo tejido biológico y de intercambiarlo con medios de inmersión a base de disolventes acuosos o orgánicos, los cuales se eligen para ajustarse estrechamente a los índices de refracción de los componentes de tejido diana particulares. Como resultado, la dispersión de luz lateral se minimiza, y todas las longitudes de ondaDe luz puede pasar mucho más eficientemente a través del tejido 13 . En muchos casos, los especímenes biológicos tratados de esta manera aparecen macroscópicamente cristalinos, lo que permite que el LSFM se lleve a cabo, incluso en órganos enteros de ratón, usando objetivos de ampliación de larga distancia de trabajo y de baja ampliación.

Aquí presentamos un protocolo de preparación para la obtención de imágenes de gran muestra en un microscopio de lámina (ver tabla de materiales), que hemos establecido para investigar el infiltrado cardíaco celular en un modelo murino de miocarditis 15 . Los ratones CD11c.DTR expresan el receptor de la toxina diftérica de primate (DTR) bajo el control del promotor 16 de CD11c. En consecuencia, las células de estos ratones, que expresan CD11c junto con el DTR, se hacen sensibles a la exotoxina de Corynebacterium diphtheria (toxina diftérica, DTX); El tratamiento sistémico de estos animales con DTX produce un agotamiento de todos los CD11c + ceLls CD11c es una integrina y, como receptor de la superficie celular para una variedad de diferentes factores solubles, está involucrado en procesos de activación y maduración, principalmente en las células del linaje monocítico [ 17] . En consecuencia, el modelo de ratón CD11c.DTR se ha utilizado intensivamente para estudiar el papel de las células dendríticas y los subgrupos de macrófagos en el contexto de muchas preguntas inmunológicas diferentes. Con el tiempo, se ha reportado que los ratones CD11c.DTR tratados sistemáticamente con DTX pueden desarrollar efectos secundarios adversos y pueden mostrar tasas de mortalidad fuertemente elevadas 18 , 19 . Recientemente, hemos sido capaces de identificar la causa subyacente de la muerte 15 , que describe el desarrollo de miocarditis fulminante después de la aplicación intratraqueal DTX en estos animales. El desafío de la toxina causó la destrucción celular, incluso en las partes centrales del sistema de transmisión del estímulo en el corazón. Esto fue acompañado por un masivo CD45+ Infiltrado de leucocitos, lo que finalmente conduce a arritmias cardíacas letales. En este caso, no sólo fue importante la aparición de la población de leucocitos, sino también su distribución espacial dentro del corazón. Esta pregunta experimental es un desafío para la moderna imagen microscópica, que hemos resuelto por una luz microscopía de la hoja de enfoque que se apoya por la tinción de anticuerpos intravital y un disolvente orgánico basado en el protocolo de compensación óptica.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la UE y fueron aprobados por las autoridades locales competentes en Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Alemania). Los animales fueron utilizados y alojados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

1. Inducción de miocarditis por toxina diftérica (DTX)

  1. Preparar la solución DTX para la inducción de miocarditis diluyendo la solución madre de DTX con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una solución de trabajo de 1 μg / mL.
  2. Aplique 100 μL de esta solución intratraquealmente en ratones CD11c.DTR de 8 a 10 semanas de edad (aproximadamente 5 ng / g de peso corporal (peso corporal)), como muestra Hasenberg et al. Para la aplicación de una suspensión de esporas fúngicas 20 .
    NOTA: La aplicación intraperitoneal de la toxina podría resultar en una inducción similar deMiocarditis mortal. Sin embargo, este enfoque tendría que ser validado en primer lugar.
    1. Para su aplicación, anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal (ip) de 100 mg / kg de cetamina y 10 mg / kg de xilazina.
    2. Después de alcanzar la narcosis profunda (prueba del pinzamiento del dedo del pie), intubate a los animales usando un catéter venoso del domicilio 22 G a través de la cavidad oral. Compruebe el correcto posicionamiento del tubo de la lente ventilando a los animales con un respirador de animal pequeño a una velocidad de 250 respiraciones por minuto y un volumen de inhalación de 250 μL por respiración, también mostrado por Hasenberg et al. Alabama. 20 .
      NOTA: Cuando se coloca correctamente, la velocidad de respiración de los animales cambiará según los ajustes de ventilación aplicados.
    3. Desconecte el sistema de ventilación e inculque los 100 μl de solución DTX o una cantidad igual de PBS como control a través del catéter en el pulmón y continúe ventilando a los animales durante 1 minuto adicional.
  3. Deje que los animales se recuperen de la anestesia y controlar el estado general de salud y el cambio de peso corporal durante 4 días.
    NOTA: Dependiendo del antecedente genético, la cepa del ratón o el peso inicial, la gravedad y el inicio de la miocarditis pueden variar y deben determinarse primero.

2. Preparación de muestras para microscopía de lámina

  1. 4 días después de la aplicación de la toxina, anestesiar los ratones mediante el lavado de una cámara de inducción con una mezcla vaporizada de isoflurano / oxígeno al 2%. Inyectar 15 μg de un anticuerpo anti-CD45 marcado directamente (clon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) en 50 μL de PBS por vía intravenosa (iv) utilizando la vía de aplicación retroorbitaria, lo que garantiza una aplicación muy rápida y altamente precisa de la Cantidad correcta de anticuerpo.
    NOTA: La profundidad de narcosis deseada se ha alcanzado cuando los ratones están recostados y no reaccionan a la prueba de pinzamiento del dedo del pie.
  2. Después de 2 h de incubación, sacrificar los ratones por dislocación cervical yD perfunden los corazones in situ con 5 ml de PBS / EDTA (5 mM).
    1. Exponer el corazón e inyectar la solución de perfusión en el ventrículo derecho usando un catéter de 21 G. Perfundir con una presión lenta y constante y asegurarse de que la sangre se puede drenar después de cortar la aorta abierta.
      NOTA: Esta perfusión transcardial podría resultar en pequeños artefactos de preparación, lo que podría perturbar la visualización 3D final del órgano. Por lo tanto, los experimentadores experimentados avanzados podrían realizar la perfusión a través de la vena cava inferior, extirpando la aorta abdominal.
  3. Para la fijación química, perfundir el corazón a través del mismo receso con 5 mL de paraformaldehído al 4% (PFA). Mantenga el catéter en su lugar y simplemente coloque una jeringa nueva llena de PFA. Perfume con presión lenta y constante.
    NOTA: Paraformaldehído es altamente tóxico; Evitar el contacto con la piel, los ojos y otras mucosas.
    1. Sujete suavemente el corazón con una pinza dentada; PuLl ligeramente hacia arriba; Y cortar todas las conexiones de tejido, incluyendo las arterias y venas entrantes y salientes. Guarde el órgano durante 4 h adicionales en PFA al 4% para una fijación adicional.
  4. Para deshidratar el órgano, incubar el corazón en una serie de etanol ascendente al 50%, 70% y dos veces al 100%, cada una durante 12 h, a 4ºC en la oscuridad. En este caso, utilice tubos de reacción negros de polipropileno de 5 ml, lo que les permite girar constantemente en un rotador de tubos con una velocidad de rotación lenta para evitar la formación de burbujas de aire.
  5. Preparación completa de la muestra mediante limpieza química. Para que los corazones sean transparentes, incubelos en éter dibencilico (DBE) al 98% mientras gira constantemente durante la noche.
    NOTA: DBE es irritante para los ojos, la piel y el sistema respiratorio.

3. Microscopía de lámina

  1. Realizar LSFM usando el microscopio de la lámina-hoja (vea la tabla de materiales). Coloque la muestra en el soporte estándar de la muestra del microscopio en el DB lleno de DBEVette, que es adecuado para especímenes de hasta 30 mm x 30 mm x 15 mm.
  2. Mantenga la muestra firmemente en su lugar durante la adquisición de la imagen utilizando bloques de agarosa deshidratados y despejados.
    1. Para preparar los bloques de agarosa, se vierte 2% de agarosa fundida en un molde (15 mm x 15 mm x 5 mm). Deje que la agarosa se enfríe hasta que se solidifique.
    2. Deshidratarla en una serie de etanol ascendente (50%, 70% y dos veces al 100%). Incubar los bloques de agarosa durante la noche en 98% DBE. Guarde la agarosa en DBE hasta que se use.
      NOTA: Como la agarosa está compuesta principalmente de agua, los tiempos de incubación para cada paso de deshidratación pueden extenderse, dependiendo del tamaño del bloque.
      NOTA: DBE es irritante para los ojos, la piel y el sistema respiratorio.
    3. Cuando sea necesario, corte el bloque de agarosa preparado a la forma deseada usando un bisturí afilado. Típicamente, corte las formas en forma de prisma o de cuña para colocarlas en los bordes del adaptador de muestra.
      NOTA: Como los bloques de agarosa son elásticos,La muestra permanece en su lugar cuando se empuja con poca fuerza.
  3. Detectar las señales de fluorescencia de interés (en este caso, autofluorescencia y tinción de anticuerpos anti-CD45) con los ajustes de filtro de emisión y excitación apropiados.
    1. Para la detección de la señal de autofluorescencia derivada del tejido conectivo, utilice un filtro de paso de banda de 525/50 nm a una longitud de onda de excitación de 488 nm (OPSL: 50 mW); La tinción de CD45 con un anticuerpo acoplado a AF647 se detecta a 668 nm (filtro de paso de banda: 680/30 nm) ya una longitud de onda de excitación de 647 nm (láser de diodo: 50 mW).
    2. Elija 4 μm como la distancia entre los dos planos z individuales.

4. Postprocesamiento de imágenes

NOTA: Los datos de imagen digital adquiridos se procesaron posteriormente con un software de procesamiento y análisis de imágenes 3D / 4D científico (ver tabla de materiales).

  1. Apertura y preajuste de los ficheros de datos.
  2. Después de iniciar el software de análisis, seleccione el botón "Superar" en la esquina superior izquierda. Para abrir las pilas de imágenes, seleccione "Archivo", "Abrir" y seleccione una carpeta que contenga los datos del primer canal adquirido. Elija "Editar" y "Añadir canales" para agregar otros canales adquiridos.
    NOTA: Dependiendo del tamaño de los datos y del sistema informático, este proceso puede tardar varios minutos. El protocolo presentado demuestra todos los pasos para 2 canales de adquisición (autofluorescencia y AF647).
  3. Corrija las dimensiones de voxel x, y y z haciendo clic en "Editar" y seleccionando "Propiedades de imagen". Cuando se abra la nueva ventana, ajuste los parámetros.
    NOTA: Este paso depende del sistema de microscopio empleado y del formato de datos en particular. Los valores xyz correctos son críticos para el tamaño subsiguiente y las mediciones distantes. En la mayoría de los casos, estos parámetros se almacenan como metadatos en los archivos de micrografía. Sin embargo, si el archivo foRmat no puede ser interpretado correctamente por el software de análisis, es importante introducir manualmente el tamaño del píxel. El tamaño de píxel en las dimensiones x e y depende del tamaño del píxel de la cámara, del binning potencialmente aplicado y de la ampliación del objetivo y del objetivo. El tamaño de píxel en z es equivalente al tamaño de paso z autodefinido ( por ejemplo, 4 μm).
  • Ajustes del canal
    1. Primero transforme la señal de autofluorescencia en escala de grises abriendo el "Ajuste de pantalla" ("Editar" y "Mostrar ajuste de pantalla"). Una nueva ventana mostrará todos los canales abiertos y los ajustes de visualización para todos ellos; Para cambiar su color predeterminado, seleccione el canal de autofluorescencia y elija el estilo de visualización "blanco". Haga clic en "Aceptar" para aplicar.
    2. Para el ajuste de nivel de negro, vuelva a "Ajuste de visualización" y ajuste el valor de nivel de negro para excluir las señales de fondo no deseadas que no representan la estructura de la muestraS
      1. Para ello, utilice el triángulo superior izquierdo de la barra de canales y arrástrelo de izquierda a derecha.
        NOTA: Los cambios se visualizarán inmediatamente. Asegúrese de suprimir únicamente las señales que no derivan de la muestra. Los valores mínimos en el fondo nunca deben ser "0" para evitar píxeles negros, ya que las señales de ruido podrían ser necesarias para cálculos adicionales. Asegúrese de que todos los cambios de nivel de negro se realicen después de la adquisición de imágenes. De lo contrario, se podría perder información valiosa sobre la muestra. El ajuste de nivel de negro sólo sirve para propósitos representativos. Para usar la misma configuración de visualización en diferentes muestras, se pueden introducir valores precisos en el campo numérico "min" debajo de la lista de canales. Esto es muy útil para los análisis cuantitativos.
    3. Realice el ajuste de intensidad, ya sea utilizando el triángulo superior derecho para ajustar la intensidad del canal respectivo o introduciendo valores precisos en el campo numérico "máximo" debajo del canalL lista.
    4. Realice el ajuste de contraste arrastrando el triángulo inferior en el centro de la barra de canales para aumentar o disminuir el valor gamma o introduciendo los valores precisos.
    5. Ajuste el canal AF647 según el canal de autofluorescencia. Como diferencia, configure la visualización de la señal AF647 en una tabla de búsqueda de color de mapa de calor. Para ello, elija el modo de canal "fuego" en un enfoque similar al del paso 4.2.1.
      NOTA: Como las intensidades totales de la señal son significativamente más bajas en comparación con el canal de autofluorescencia, los niveles de negro normalmente se ajustan a valores mucho más bajos. En cuanto al canal de autofluorescencia, el brillo de este canal suele aumentar.
    6. Seleccione el "modo de mezcla" para visualizar las estructuras de tejido en detalle. Analizar todas las muestras de una serie con los mismos valores de los parámetros.
  • Recorte virtual
    1. Para virtualmente abrir el órgano antes de la escena 3D expoRt, aplique un plano de recorte en el objeto 3D representado.
      1. Haga clic en el icono "Clipping Plane" (tijeras) en la lista de objetos. Dentro de la vista de imagen, aparecerá un marco amarillo y un manipulador (eje blanco). Gire el husillo en el extremo más fino con el ratón, cambiando de este modo la orientación del plano de recorte y mueva la parte central más gruesa del eje para seleccionar la profundidad de recorte deseada.
      2. Ocultar el marco y el manipulador desmarcando las respectivas casillas de verificación debajo de la lista de objetos y crear las instantáneas deseadas.
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    Representative Results

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    El enfoque LSFM presentado analiza la distribución y la cantidad de leucocitos en los corazones murinos tras la inducción de miocarditis grave. La Figura 1A explica el protocolo de pretratamiento para los ratones CD11c.DTR transgénicos para la inducción de miocarditis. Este paso representa el desencadenante necesario para el reclutamiento de leucocitos en el miocardio. Después de una aplicación DTX exitosa, los animales desarrollan síntomas severos de la enfermedad, tales como debilidad general, anorexia y pérdida de peso dentro del rango de 2-4 días. Después de 4 días, los leucocitos se tiñen por el iv . Aplicación de anticuerpo anti-CD45 acoplado al fluorocromo antes de la perfusión transcardial para eliminar la sangre de la circulación. Si se realiza con éxito, el corazón y otros órganos se tornan blanquecinos. Posteriormente, el órgano es extirpado, y el agua de tejido se intercambia con DBE por una fila de etanol ascendente y una incubación final en DBE. La figura 1B muestra el calendarioDe las etapas de incubación individuales en las que el órgano experimenta una contracción significativa. El órgano quımicamente limpiado se transfiere entonces a una cámara de formación de imagen llena de DBE en el soporte de tejido de microscopio estándar. Para estabilizar el órgano durante la adquisición de imágenes en 3D, se fija mediante bloques de agarosa transparente. El posicionamiento detallado de la muestra se visualiza en la Figura 2 . La adquisición de una pila de imágenes completa, compuesta de 2 canales (autofluorescencia y anti-CD45), toma alrededor de 20-30 minutos y genera un archivo de datos de aproximadamente 16 GB. Finalmente, los datos resultantes se analizan como representación 3D artificial en la que se muestra la distribución de leucocitos en una vista de mapa de calor. En la Figura 3 (fila superior), las áreas fuertemente inflamadas de un corazón de un animal tratado con DTX pueden ser percibidas por su aspecto rojizo / blanquecino. Un estudio más detallado del modelo 3D revela la concentración de leucocitos, especialmente en regiones del sistema de conducción cardíaca, tales como la atriovent Y las fibras de Purkinje. Por el contrario, los corazones de los animales tratados con PBS no muestran este patrón de inflamación en absoluto (fila inferior).

    Figura 1
    Figura 1: Esquema de inducción y preparación de muestras de miocarditis inducida por toxina diftérica. ( A ) El desarrollo de la miocarditis fue inducido por el mismo . Aplicación de toxina diftérica (100 ng / animal). Después de 4 días, la miocarditis se había desarrollado completamente y se había inyectado un anticuerpo anti-CD45 acoplado con AF647 (15 μg / animal) iv . Para detectar leucocitos CD45 + . Los animales se sacrificaron 2 h más tarde por dislocación cervical, y los corazones se perfundieron con PBS / EDTA (5 mM) seguido de PFA al 4%. ( B ) Después de la separación, el órgano se deshidrató con una serie de etanol ascendente y finalmente se eliminó por incubación durante la noche en éter dibencilico..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2: Esquema de posicionamiento de la muestra en el microscopio. El corazón transparente (4) quımicamente despejado se colocó sobre el soporte de muestras (2 y 5) y se estabilizó con la ayuda de bloques de agarosa despejados (6). Esta construcción se sumergió entonces en la cubeta de vidrio llena de DBE (3). Para la adquisición, se empleó una lente objetiva de 0,5 NA (1) con una distancia de trabajo de 5,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3: Representaciones 3D representativas de todo oGan Microscopía de lámina. Los ratones CD11c.DTR se trataron intratraquealmente con DTX (fila superior) o PBS (fila inferior). 4 días más tarde, el desarrollo de miocarditis, representado por la infiltración de leucocitos CD45 + , se visualizó mediante microscopía de luz fluorescente. Para teñir las células CD45 + , se inyectó un anticuerpo anti-CD45 acoplado a AF647 durante 2 h antes de sacrificar los ratones. La señal de autofluorescencia del tejido conectivo se muestra en gris, mientras que el CD45 + infiltrado se muestra en colores de mapa de calor (azul: señal baja, blanco: señal alta). Cada fila se compone de 4 representaciones 3D cortadas digitalmente, demostrando la situación dentro del órgano. La profundidad de corte respecto a la parte frontal del corazón se declara por encima de las imágenes individuales. La figura se ha modificado de Mann et al. 15 . Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquíPara ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

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    En la ciencia de la vida moderna, la visualización microscópica de los procesos biológicos desempeña un papel cada vez más importante. En este contexto, se han logrado muchos desarrollos durante los dos últimos siglos que ayudan a responder a preguntas no abordables hasta este punto,. En primer lugar, ha habido una clara tendencia a aumentar fundamentalmente la capacidad de resolución de los microscopios de luz. Con microscopía de iluminación estructurada (SIM) 21 , 22 , microscopía de emisión-agotamiento estimulada (STED) 23 , y microscopía de localización foto-activada (PALM) 24 , 25 o microscopía óptica de reconstrucción estocástica (STORM) 26 , A la difracción de luz 27 se rompió significativamente. El segundo desafío a menudo dirigido fue observar el comportamiento celular en un entorno similarLa condición natural lo más cerca posible. En este contexto, se forzó el desarrollo de enfoques de imagen in situ o in vivo . Para superar la limitada profundidad de penetración de luz en tejidos biológicos complejos, la microscopía de 2 fotones 28 , 29 ha establecido nuevos estándares en este campo de investigación.

    Sin embargo, una característica que todas estas técnicas de microscopía por lo general comparten es el uso de alto NA objetivos para garantizar la mejor resolución posible. A pesar de que resuelve las microestructuras con mayor detalle, el uso de objetivos de alta NA limita significativamente el campo de visión, así como la distancia de trabajo. Como consecuencia, el contexto biológico en términos del medio circundante a menudo sale de foco en el sentido más verdadero de la palabra. Para cerrar esta brecha, el desarrollo LSFM ha ganado recientemente interés, proporcionando una técnica de microscopía que es capaz de resolver las estructuras fluorescentes a tamaño celularSino también para evaluar convenientemente toda la información 3D de una muestra con un tamaño de más de 1 cm.

    El protocolo descrito aquí presenta un método de cómo emplear un ultramicroscopio para visualizar un infiltrado de leucocitos celulares en corazones murinos enteros. Después de la inducción exitosa de miocarditis estéril en un modelo de ratón CD11c.DTR 30 , el animal respectivo recibe una inyección iv de un anticuerpo anti-CD45 acoplado al fluorochrome, el cual circula durante 2 h en el animal vivo. En principio, realizando una autopsia, debería ser posible la tinción del anticuerpo de montaje completo entre la fijación del órgano y la deshidratación de la muestra. Desafortunadamente, la tinción de montaje completo requiere etapas de incubación mucho más largas y por lo tanto aumenta enormemente el tiempo necesario para la generación de la muestra ( es decir, entre 4-21 días) 6 , 31 . Además, este enfoque de tinción intravital no sólo es más rápido, sino que también proporcionaMás eficaz de la penetración del tejido del anticuerpo en comparación con un conjunto de montaje tinción protocolo [ 9] . Aunque no se ha cuantificado la eficacia de tinción absoluta, se espera que una gran proporción de la población de leucocitos esté marcada, dado que la señal de fluorescencia resultante es notablemente fuerte. Tanto las proteínas fluorescentes como el marcaje de anticuerpos en sí sobreviven en gran medida al proceso de limpieza subsiguiente, y ambos parecen ser estables durante un largo período de tiempo. También debe observarse que se utiliza un agente a base de disolvente para la limpieza de tejidos. Esto impide masivamente un enfoque de tinción de montaje completo después del proceso de limpieza. La limpieza de tejido a base de disolvente es un fenómeno reversible, por lo que una transferencia del tejido despejado a un medio basado en agua (tal como PBS), que se emplea habitualmente para la tinción estándar de anticuerpos, daría como resultado una muestra no transparente. Por lo tanto, los protocolos de tinción no estándar en solventes orgánicos tendrían que ser establecidos i Se requiere un procedimiento de tinción de montaje completo después de la limpieza de la muestra.

    La perfusión cardíaca subsiguiente es absolutamente necesaria para eliminar la mayor cantidad posible de sangre residual, ya que la sangre está mal aclarada en los siguientes pasos y empeora drásticamente los resultados de formación de imágenes. Después de extirpar el corazón, el agua del tejido se elimina en una fila de etanol ascendente. Este paso puede ser considerado como la primera parte del desmonte químico. La idea es sustituir el agua de tejido con un medio de inmersión que mejor se ajuste al índice de refracción medio (RI) del espécimen elegido. El DBE se eligió como medio de inmersión siguiendo el protocolo de Ertuk et al. 32 , con algunas modificaciones. El DBE tiene un índice de refracción de 1,55 (nD20), y cuando se comparó con otros agentes de limpieza, tales como benzoil benzoato (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6,7 o sacarosa (RI (nD20) = 1,44 )13, se conservó mejor las etiquetas fluorescentes utilizadas en este protocolo.Una preservación de fluorescencia similar se produjo utilizando cinamato de etilo (ECI ).Se han descrito su uso en un estudio sobre la cuantificación automatizada de glomérulos en los riñones nefríticos 9. El músculo El tejido, una vez estimado que tenía un índice de refracción de 1.382 ± 0.004 33 , fue igualmente despejado con todas las sustancias que evaluamos 9. Por lo tanto, el factor crucial para la elección de DBE fue la preservación de fluorescencia y no el potencial de compensación. El uso de un método activo tal como CLARITY 34 , 35 , en el que la eliminación de lípidos con la ayuda de una corriente electroforética da lugar a tejidos fuertemente despejados, debería ser posible. Sin embargo, a diferencia de tal agua Basados ​​en el método de limpieza, el borrado de DBE da como resultado un endurecimiento significativoDel tejido, acompañado de una contracción menor. Esto permite la fácil manipulación de las muestras y no requiere adaptaciones adicionales para la formación de imágenes, como la incorporación de la muestra en un bloque de agarosa. Por lo tanto, la transferencia de este protocolo a un método como CLARITY sería un reto, pero la gente ha demostrado con éxito el uso del ultramicroscopio elegido (ver la tabla de materiales) con este enfoque 3 . Es importante evaluar cuidadosamente la posible destrucción de las señales de fluorescencia endógena por el método de eliminación de la elección. Como nunca hemos trabajado con CLARITY u otros protocolos de limpieza activa, no podemos comentar la reacción del fluorocromo en estos sistemas. El peor caso sería que habría que realizar una tinción de anticuerpos de montaje completo posterior.

    Este método es fácilmente ajustable a otros órganos, tales como pulmones murinos; Riñones; sesos; E incluso huesos, como el fémur, la tibia o la calvaria. Mientras que evaluati Ng el potencial de aplicación en nuevas regiones tisulares y / o nuevas estrategias de etiquetado fluorescente, el mayor desafío suele ser diseñar el protocolo de una manera que la fluorescencia se mantiene viva. Los medios de inmersión a base de disolvente 13 y los agentes de deshidratación 36 tienen un impacto directo sobre la integridad de los fluorocromos. Se recomienda el uso de derivados de AlexaFluor, ya que parecen ser bastante estables en varios protocolos. Sin embargo, muy a menudo, otros fluorocromos deben ser empleados. En este caso, vale la pena evaluar el uso de otros agentes de compensación ( por ejemplo, Escala 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Claridad 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , salicilato de metilo 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 y ECI 9 ) y otras alternativas de deshidratación ( por ejemplo, metanol y tetrahidrofurano 13 ).

    Como en muchos otros enfoques de LSFM, el proceso de posicionamiento del corazón transparente bajo el microscopio es exigente. Los sistemas comerciales proporcionan espacio suficiente para instalar muestras del tamaño de los órganos del ratón, incluyendo lóbulos pulmonares, riñones o corazones. Sin embargo, actualmente no se dispone de muestras normalizadas para estos especímenes. Por lo tanto, tuvimos que establecer un aparato de montaje mediante el uso de bloques de agarosa despejados y re-formados. Aún así, un cierto número de conjuntos de datos de imagen tenía que descartarse debido a los artefactos de movimiento. Este problema también se incrementó debido al largo tiempo de adquisición del microscopio utilizado aquí. Potencialmente, la generación de enormes conjuntos de datos se beneficiará significativamente de sistemas más rápidos, pero no tuvimos la oportunidad de usar un microscopio más rápido todavía. Nuestro microscopio (ver tabla oF materiales) fue construido alrededor de un cuerpo de microscopio de zoom y fue equipado con un módulo láser, una cámara sCMOS con un tamaño de píxel de 6,5 x 6,5 mm 2 , y óptica de detección con un rango óptico de ampliación de 1,26X a 12,6X. La parte central de la óptica de detección era una lente objetivo 0,5 NA con una distancia de trabajo de 5,5 mm, lo que permitió la observación de un amplio campo de visión que oscilaba entre 1,7 y 17,6 mm en diagonal. Esto fue lo suficientemente grande para realizar el corte óptico de corazones murinos enteros. La corrección de la aberración cromática, entre 400 y 800 nm, se logró mediante el ajuste mecánico del objetivo. Cuando fue necesario, las correcciones cromáticas se llevaron a cabo durante el postprocesamiento asistido por ordenador. La aberración esférica, también en muestras más gruesas, no se observó en este sistema y por lo tanto no tuvo que ser corregido.

    En conjunto, presentamos aquí un robusto protocolo para el clearing químico y análisis de lEucocitos en el interior de corazones murinos utilizando microscopía de luz de la hoja. En este punto, es importante enfatizar que este procedimiento de LSFM es difícilmente capaz de resolver estructuras de tejido fino tales como capilares. A este respecto, este LSFM está bien adaptado para caracterizar la distribución general de células inmunes y para describir las potenciales acumulaciones de células inmunes dentro del órgano. Sin embargo, hay que tener en cuenta que LSFM en general no es la opción perfecta para analizar y cuantificar la localización celular en sub-estructuras de órganos pequeños, tales como la vasculatura. Para responder a estas preguntas, LSFM debe complementarse con otros métodos, como la histología o microscopía de 2 fotones. Otras limitaciones de este protocolo incluyen la restricción a un máximo de 3-4 colores - el canal azul es difícil de usar para otras señales aparte de la autofluorescencia - la restricción a muestras fijas y el tamaño máximo de la muestra de 30 mm x 30 mm x 15 Mm. Además, el olor fuerte y la toxicidad aguda de DBE deben tomarseN en cuenta. Si este último punto es problemático, el cinamato de etilo puede ser utilizado como un agente de compensación alternativo 9 . La principal ventaja de la elección de esta técnica de microscopía es la capacidad de analizar todo el órgano a la vez. En análisis convencionales de secciones histológicas de tejido hematoxilina y eosina-manchadas, fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE), existe una alta probabilidad de que falten áreas espaciales importantes a menos que cada sección sea analizada. Además, la microscopía de lámina no sólo permite el corte virtual de la muestra en cada plano tridimensional, sino que también ofrece este potencial sin destruir la muestra o causar artefactos de corte. Si fuera necesario, el órgano fijo podría procesarse subsiguientemente para análisis adicionales, tales como aproximaciones correlativas de microscopía óptica y electrónica para resolver altamente regiones particulares de interés. Una plantilla para tal estudio se puede encontrar en el trabajo de Karreman et al. , Donde la apuesta de correlaciónEntre una pila de imágenes de microscopía de 2 fotones y datos de microscopía electrónica tridimensional se demostró con éxito 41 . Otro enfoque prometedor podría ser la combinación de este protocolo con el recientemente publicado uDISCO método que también se basa en un disolvente orgánico y que permitiría la investigación de órganos mucho más grandes por un estándar LSFM [ 42] .

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    Disclosures

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgments

    La investigación en el laboratorio de Gunzer recibió el apoyo del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania (subvención nº 0315590 AD) y de la Fundación Alemana de Investigación (GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Agradecemos también al IMCES por el apoyo técnico ya Sebastian Kubat por su ayuda con el modelado de dibujos animados en 3D.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    diphtheria toxin Sigma Aldrich D0564
    phosphate buffered saline Biochrom L182-10
    ketamine [50 mg/mL] Inresa PZN 4089014
    xylazine [2 %] Ceva
    syringe Braun REF 9161502 Braun Omincan F 
    indwelt venous catheter  Becton Dickinson REF 381923 BD Insyte Autoguard
    small animal respirator Harvard Apparatus 73-0044 MiniVent
    anit-CD45 antibody (AF647) BioLegend 103124
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.2
    catheter (21 G) BD Biosciences REF 387455 BD valu-set
    paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
    PE tube (5 mL) Carl Roth EKY9.1 Rotilabo
    ethanol Carl Roth 9065.4
    dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
    tube rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 MACSmix
    agarose (low gelling) Sigma Aldrich A4018
    mold (15 x 15 x 5 mm) Tissue Tek 4566 Cryomold 
    light sheet microscope system LaVision Biotec Ultramicroscope 
    microscope body Olympus MVX10 
    objective Olympus 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
    sCMOS camera 5.5MP Andor Technology
    488 nm OPSL (50mW) laser Coherent
    647 nm  diode laser (50mW) Coherent
    3D image processing & analysis software Bitplane IMARIS Ver. 8.3
    transgenic mouse strain Steffen Jung et al. CD11c.DTR
    wt mouse strain Envigo Balb/c Ola Hsd J
    Laser Module LaVision Biotec
    MVPLAPO 2XC Objective Lens

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera
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    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).More

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).

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