Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged Published: March 24, 2017 doi: 10.3791/55453
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

Introduction

السل (TB) لا يزال يشكل تهديدا الصحة العالمية خطيرا على الرغم من توفر نظم العلاج الكيميائي لمكافحة السل لأكثر من 40 سنوات 1. وهذا يرجع جزئيا إلى شرط لفترات علاج طويلة لأكثر من 6 أشهر باستخدام مزيج من الادوية متعددة، الأمر الذي يؤدي إلى المريض عدم الامتثال 2 هذا. وظهور السل المقاوم للأدوية في السنوات الأخيرة من تعقيد المشاكل في الميدان حيث التنمية الناجحة من الأدوية المعتمدة سريريا هي شبه معدومة 3. في الواقع، على الرغم من تطوير الأدوية المضادة للسل شاملة، كان فقط دواء واحد وافقت ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام السريري في السنوات ال 40 الماضية (4). وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى الأجيال الجديدة من الأدوية المضادة للسل لمعالجة هذه المشكلة.

المشكلة الرئيسية في اكتشاف السل المخدرات هي عدم وجود النقل الناجح من مركبات مع في المختبر النشاط إلى فعالية في الإعداد السريرية= "XREF"> 5، 6، 7. في البداية، تم استخدام النهج الهدف استنادا للكشف عن مكافحة المخدرات المتفطرات السلية 5، الذي فشل في ترجمتها إلى الخلايا البكتيرية بأكملها. حتى عندما يتم استخدام خلايا المتفطرة السلية، وغالبا ما يتم تنفيذ ذلك باستخدام مرق نمت الثقافات، التي لا التنبؤ بدقة فعالية الدواء في الجسم الحي 8 و 9. وقد تم التعرف على هذه المشاكل وتم المقايسات فحص المخدرات ضد الضامة التي تحتوي على المتفطرات السلية أو الكامنة المتفطرات السلية أنشأت بنجاح 8، 10، 11، 12. ولكن، حتى هذه المقايسات أكثر تقدما لا تعطي الاعتبار الكافي للحواجز الاختراق التي تواجهها المخدرات في الآفات الرئوية غير أوعية دموية، وفي بؤر نخرية في موقع الإصابة. في الواقع، حتى للخط الأول السل ريفامبيسين المخدرات، وقد تم استجواب الجرعات دون المستوى الأمثل نظرا لعدم كفاية في أنسجة الجسم الحي والدماغية السائل الشوكي (CSF) اختراق 13، 14، 15 وكذلك انخفاض كفاءة الخلايا ضد المتفطرة السلية 8 و 9. على هذا النحو، ونماذج وفحوصات جديدة من شأنها أن تأخذ بعين الاعتبار هذه المعلمات أثناء عملية التنمية الرصاص في وقت مبكر من شأنه أن يحسن بلا شك السل جهود اكتشاف المخدرات.

لتلبية هذه الحاجة، أنشأنا مؤخرا-2 BSL متوافق نموذج العدوى بديل غير مكلف وسريع، والمتفطرات السلية المخدرات فعالية الاختبار 16. هذا النموذج عدوى تنتج المكتظة معبأة المتفطرات السلية داخل هياكل الإجمالية البلاعم الكبيرة، والتي لخص الحواجز معدل انتشار الهواتف النقالة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ولدت بلعم-passaged المتفطرات السلية. المواضيع المتميزة المستمدة من هذا النموذج العدوى ودمجها مع فحص ريسازورين عيار مكروي (REMA) لتقييم نجاعة الأدوية، والتي تنتج نتائج متسقة مع نماذج إصابة الخلايا الأخرى وربطها بشكل جيد مع القدرة ذكرت من أدوية السل المشتركة لتحقيق تركيزات عالية CSF النسبية لتركيزات مصل 16.

نحن هنا تصف بالتفصيل جيل من المتفطرات السلية / الهياكل الكلية بلعم لإنتاج بلعم passaged المتفطرات السلية مناسبة لاختبار الحساسية المخدرات باستخدام REMA. على وجه الخصوص، وتبين لنا كيف يمكن تكييف هذا النظام العدوى إلى تنسيق 96-جيدا من أجل التوافق مع الفحص الإنتاجية مرشح الأدوية المضادة للسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: كما السل م مولودية 2 6206 هو سلالة الفوعة 17، 18، كل عمل في هذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها في 2 مرفق السلامة الأحيائية مستوى (BSL-2).

1. شروط الثقافة عن البروتين الفلوري الأخضر تعرب عن السل م مولودية 2 6206 (المتفطرات السلية -GFP)

ملاحظة: م. السل H37Rv المستمدة عوني التغذي سلالة مولودية 2 6206 (Δ panCD، Δ leuCD) تحولت مع استخدام GFP معربا عن البلازميد pMN437 طوال هذا البروتوكول 16. كان من الممكن أن تحل محل سلالة المتفطرة السلية -GFP مع عدم GFP يعبرون عن نوع السلالة البرية لتمكين تسهيل عملية التواصل من سلالة للباحثين. ومع ذلك، التعبير GFP أمر مرغوب فيه لتمكين تأكيدا البصرية البلعمة وتشكيل المتفطرات السلية المجاميع / البلاعم. لخط الطولز التخزين على المدى، جمدت المتفطرات السلية -GFP في -80 درجة مئوية في 7H9 وسائل الإعلام كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.1) تستكمل مع 20٪ الجلسرين.

  1. إعداد كامل وسائل الإعلام المتفطرات السلية -GFP (7H9-C) من خلال استكمال 7H9 المتوسطة مع 10٪ ميدلبروك OADC، 0.02٪ تيلوكسابول، 24 ميكروغرام / مل مد البانتوثنيك حامض، 50 ميكروغرام / مل L-ليسين و 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B.
  2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من المتفطرات السلية -GFP وإضافة إلى 10 مل من 7H9-C في 30 مل قارورة مربع PETG أسفل.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية على شاكر دوارة (50 دورة في الدقيقة). أخذ قياسات الكثافة الضوئية (OD 600) كل بضعة أيام حتى OD 600 يصل إلى 1.0 (حوالي 5-8 أيام).
  4. تمييع والثقافة مرور حسب الحاجة للحفاظ على OD 600 بين 0،2-1،0.
  5. للعدوى، استخدم ثقافة راسخة من المتفطرات السلية -GFP في مرحلة النمو لوغاريتمي (OD 600 من 0،6-1). لتجنب الثقافات ملتف، يصوتن الثقافة قارورة المتفطرات السلية في حمام مائي (130 واط؛ 3 × 5 ق البقول) انسه أو مرتين في الأسبوع

2. شروط الثقافة ل THP-1 خلايا

  1. إعداد كامل THP-1 خلية الإعلام (RPMI-C) من خلال استكمال RPMI 1640 المتوسطة مع 10٪ للحرارة المعطل مصل الجنين البقري، 2 مم L-الجلوتامين، و 10 ملي HEPES.
  2. احتضان الخلايا في قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2.
  3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو التدفق الخلوي كل يوم والحفاظ على THP-1 الخلايا في مناطق ذات كثافة بين ،1-0٬600٬000 لكل مليلتر.

3. بروتوكول العدوى لتوليد هياكل MTB / بلعم الركام

  1. THP-1 إعداد الخلية (في لوحة 96-جيدا)
    1. الطرد المركزي 7 × 10 6 THP-1 الخلايا في 250 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في 7 مل RPMI-C.
  2. إعداد المواضيع المتميزة -GFP
    1. الطرد المركزي 2.8 × 10 8 المتفطرات السلية -GFP في 3200 x ج لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي يتأرجح دلو شالغناء تحويل OD 600 1.0 = 3 × 10 8 بكتيريا / مل.
    2. يغسل مرة واحدة مع RPMI-C وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 3.2.1.
    3. resuspend في 7 مل RPMI-C ودوامة لمدة 10 ثانية.
  3. عدوى
    ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لقالب.
    1. إعداد لوحة 96-جيدا من خلال إضافة 200 ميليلتر من الماء المعقم في صفوف ألف وحاء والأعمدة 1 و 12 لحافة الماء لمنع التبخر من مستنبت.
    2. إضافة 200 ميكرولتر RPMI-C إلى العمود 2 (B2 إلى G2) لمراقبة الخلفية (فارغة).
    3. لتصيب، إضافة المتفطرات السلية -GFP تعليق (الخطوة 3.2) إلى THP-1 تعليق خلية (الخطوة 3.1) وتخلط جيدا من قبل pipetting. النهائي THP-1 كثافة الخلية 5 × 10 5 لكل مليلتر وتعدد المقابلة من الإصابة هو 40.
    4. صب THP-1 / المتفطرات السلية -GFP تعليق في خزان 25 مل.
    5. إضافة 200 ميكرولتر من THP-1 / المتفطرات السلية -GFP تعليق على كل 96-الآبار المتبقية (B3 من خلال G11) النقيبالجا متعدد القنوات ماصة.
      ملاحظة: إذا كان يعمل مع لوحات متعددة 96-جيدا، و resuspend بانتظام THP-1 / المتفطرات السلية تعليق المتبقية في الخزان لضمان يضاف خليط حتى إلى كل بئر.
    6. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 7-10 أيام.
    7. تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 عن طريق إزالة ببطء 100 ميكرولتر قضى وسائل الإعلام من أعلى كل بئر وبلطف بإضافة 100 ميكرولتر قبل تحسنت RPMI-C باستخدام الماصة متعدد القنوات. لا و resuspend الآبار وتعكير صفو المجاميع MTB / بلعم على الجزء السفلي من الآبار.
    8. فحص البصر الآبار بواسطة المجهر مضان (الهدف 4-10X) يوميا، مع الأخذ علما حجم المتفطرات السلية المجاميع / البلاعم. بعد يوم 10/7، وينبغي أن يكون المتفطرات السلية المجاميع / بلعم كبير بما فيه الكفاية (انظر الشكل 2 للمرجعية) على المضي قدما لاختبار نجاعة الأدوية (القسم 4).
    9. إذا رغبت في ذلك، التقاط الصور من الآبار 96 باستخدام نظام آلي التصوير الخلية مجهزةمع حقل مشرق ومرشح GFP يحدد لتوثيق MTB / بلعم تشكيل الكلي.
      ملاحظة: إذا لم يكن لدى المستخدمين الوصول إلى نظام التصوير الآلي، صور الآبار التمثيلية التي يمكن اتخاذها باستخدام أي المجهر المناسب مع GFP ومشرق الميدان القدرات.

4. إعاقة النمو الفحص لتقييم الأدوية فعالية ضد المتفطرة السلية مشتقة من المتفطرات السلية / بلعم المجاميع

  1. إعداد المخدرات (شروط ثلاث نسخ للعقارين)
    ملاحظة: انظر الشكل 1A للقالب.
    1. في لوحة 96-جيدا منفصلة، ​​إضافة 125 ميكرولتر من وسائل الإعلام 7H9-C إلى B2 من خلال لG10.
    2. إعداد عقارين في ضعف أعلى تركيز النهائي المطلوب في 1 مل من 7H9-C لحساب التخفيف في الخطوة 4.2.4.
    3. إضافة 250 ميكرولتر من كل دواء لآبار B11-C11-D11 و E11-F11-G11، على التوالي للعلاج ثلاث نسخ.
    4. باستخدام الماصة متعدد القنوات، ديل متسلسليوت المخدرات اختبار شقين عن طريق نقل 125 ميكرولتر من B11-G11 إلى B10-G10. مزيج من قبل pipetting 5 مرات في كل خطوة.
    5. مواصلة التحرك 125 ميكرولتر من عمود إلى عمود (من اليمين إلى اليسار) عبر لوحة، ووقف بعد العمود 4.
    6. بعد خلط العمود 4، ونبذ 125 ميكرولتر في حاوية النفايات. الأعمدة 2 و 3، أن لا يحتوي على أية عقاقير للسماح للاستخدام كخلفية (فارغة) والضوابط نمو إيجابية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، اتبع القالب في الشكل 1B للمكتبات اختبار المخدرات. كل لوحة 96-جيدا يمكن أن تستوعب 58 المخدرات بتركيز واحد. إعداد هذا الطبق المخدرات باستخدام ضعف التركيز النهائي المطلوب لأنها سوف تضعف في نصف في الخطوة 4.2.4.
  2. العلاج من الإدمان:
    1. استرداد لوحة 96 كذلك يحتوي على المتفطرات السلية -infected الضامة (المجاميع MTB / بلعم).
    2. بعناية صب جميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) مع الماصة متعدد القنوات.تنفيذ هذا بطريقة خطوتين: أولا إزالة 150 ميكرولتر من دون إمالة لوحة، ثم قم بإزالة وسائل الاعلام المتبقية (~ 50 ميكرولتر) عن طريق إمالة لوحة وإدخال طرف ماصة إلى الحافة السفلى من البئر. كما MTB / بلعم المجاميع هي ملتصقة إلى قاع البئر، يجب أن تضيع أي مادة.
    3. إضافة بلطف 100 ميكرولتر من 7H9-C وسائل الإعلام لجميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) من لوحة تحتوي على مجاميع / بلعم المتفطرات السلية.
    4. باستخدام الماصة متعدد القنوات، ونقل 100 ميكرولتر من المخدرات التي تحتوي على 96-جيدا لوحة (الخطوة 4.1) إلى الآبار المقابلة من لوحة العدوى.
    5. مكان في كيس مختوم واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية.

5. الكمي من فعالية الدواء باستخدام الفحص ريسازورين عيار مكروي

  1. إعداد ريسازورين حل السهم عند تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل في H 2 O. تصفية من خلال 0.22 ميكرون مسام الغشاء حجم PVDF للتعقيم.
  2. إعداد ريسازورين العمل الحل عن طريق خلط ريسازورين حل الأوراق المالية، H 2 O وتوين-80 (حل 20٪ في H 2 O) في نسبة 2: 1: 1. تركيزات النهائية هي 0.4 ملغ / مل ريسازورين و 5٪ توين-80.
  3. باستخدام قارئ لوحة، وإعداد برنامج لقراءة مضان في 530 نانومتر الإثارة و 590 نانومتر انبعاث كل 30 دقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. قبل دافئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من محلول العمل ريسازورين لجميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) من لوحة المخدرات المعالجة (الخطوة 4.11) باستخدام الماصة متعدد القنوات.
  5. وضع لوحة على قارئ لوحة وبدء البرنامج بإعدادها في الخطوة 5.3.
    ملاحظة: لتسهيل معالجة كميات كبيرة من لوحات الفحص، فإنه يكفي لتطوير فحص في الحاضنة 37 درجة مئوية وأداء مضان واحد يقرأ كل 24 ساعة. هذا ينطبق أيضا على المستخدمين الذين لا يستطيعون الوصول إلى قارئ لوحة مع القدرات الحركية والحضانة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتأكيد متانة التكيف مع هذا النموذج العدوى إلى 96 بئرا شكل لوحة، ونحن هنا فحص قابلية المخدرات من المتفطرات السلية المستمدة من وجهة نظرنا 96-جيدا تكييفها نموذج العدوى إلى ريفامبيسين (RIF) وموكسيفلوكساسين (MOXI) وفقا لقالب معين في الشكل 1A. علينا أن نبرهن على توليد MTB / الهياكل الكلية بلعم الرئيسية لهذا الاختبار يمكن أن تنتج بشكل موثوق في شكل لوحة 96-جيدا (الشكل 2)، وبالتالي تمكين التوافق الإنتاجية (الشكل 1B). passaged بلعم المتفطرات السلية المنتجة بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم مباشرة لاختبار نجاعة الأدوية باستخدام تتميز كذلك فحص ريسازورين عيار مكروي (الشكل 3).

كما يعتمد الفحص ريسازورين على الأنواع المؤكسدة التي تنتجها المتفطرات السلية عملية الأيض نشطة لتحويل ريسازورين الأزرق إلى فلورescent resorufin الوردي، وتغير في لون ومضان يمكن استخدامها لكمؤشر بديل لتحديد مقدار نمو البكتيريا. في الشكل 3A، وتبين لنا أن هناك ما يكفي من حساسية داخل فحص ريسازورين للكشف موثوق البكتيريا المتفطرة السلية قابلة للحياة قادرة على تكرار في ظل غياب الأدوية بعد 3 أيام فقط من الحضانة. في حين تأكيدا البصرية من التغيير نقطة النهاية اللون هو مجرد تقييم تقريبي للنمو، يمكننا تحديد بدقة هذا عن طريق قياس حركيا تحويل ريسازورين إلى مستقلبه الفلورسنت resorufin باستخدام قارئ لوحة (الشكل 3B). باستخدام هذه البيانات، وتطبيع للتحكم في نمو إيجابية (عدم وجود الأدوية) يسمح لحساب قابلية قتل منحنيات لتصور فعالية الدواء ضد passaged بلعم المتفطرات السلية (الشكل 4).

هنا، ونتائج ممثلة في أرقام 3 > و 4 تبين أن تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC)، الذي يعرف بأنه أقل تركيز من المضاد الحيوي الذي لوحظ 90٪ إعاقة النمو، وأكبر من 2 ميكروغرام / مل لكلا ريفامبيسين وموكسيفلوكساسين ضد المتفطرة السلية المستمدة من نموذج العدوى لدينا. هذا يدل على أن نموذج العدوى لدينا يتوقع فعالية مكافحة المخدرات المتفطرات السلية التي هي أكثر انسجاما مع القيم MIC تحدد ضد الخلايا المتفطرات السلية 8، وبالتالي يعكس خصائص نشر الحاجز الذي تهمل في معظم المتفطرات السلية فحوصات الحساسية المخدرات باستخدام مرق نمت الخلايا البكتيرية.

الأهم من ذلك، أظهرت البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الفحص هو موضح في شكل 96-جيدا نتائج مماثلة إلى حد كبير لتلك التي كانت قد قررت في وقت سابق للريفامبيسين وموكسيفلوكساسين ضد passaged بلعم المتفطرات السلية 16.

. في غضون الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: تخطيط لوحة المخدرات. (A) قالب مثال على لوحة التحدي دواء يستخدم في الخطوة 4. وهذا ما يسمح لاختبار الموازي للعقارين في الآبار ثلاث نسخ في 8 تركيزات محددة. كتجربة نموذجية، كنا ريفامبيسين (RIF) وموكسيفلوكساسين (MOXI) ابتداء من الساعة 2 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر، على التوالي. وتقدم (ب) نموذج بديل لفحص الإنتاجية أيضا لإظهار إمكانية اختبار 58 مركبات بتركيز واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: جيل من المتفطرات السلية / الهياكل الكلية بلعم في لوحة 96-جيداشكل. (A) حقل مشرق الممثل وGFP دمج الصور من المتفطرات السلية المجاميع -macrophage في يوم 9 آخر العدوى. تم القبض على الصور مع الهدف 4X باستخدام برنامج التصوير الخلية الآلي الذي يوثق جيدا بأكمله عن طريق خياطة المونتاج 3 من 3 الصور الملتقطة بشكل فردي. (ب) صورة فردية غير مخيط من المجال البصري هو مبين في الفقرة (أ). (ج) ممثل دمج مشرق صورة الميدان وGFP من المتفطرات السلية / هيكل الكلي بلعم أسر مع الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): عن طريق الفحص عيار مكروي ريسازورين لقياس جدوى المتفطرات السلية. (أ) وجود viablخلايا البريد المتفطرات السلية يمكن تحديدها ببساطة عن طريق تحويل الصبغة ريسازورين الأزرق إلى اللون الوردي، وانخفاض شكله. وتظهر نتائج ممثلة هنا باستخدام ريفامبيسين (RIF) وموكسيفلوكساسين (MOXI) وفقا للنموذج في الشكل 1A. (ب) لقياس كمي لتحويل ريسازورين، مضان من الآبار الفردية (الموافق الشكل 3A) تم رصد حركيا لمدة 24 ساعة كما هو موضح في الخطوة 5. ممثل مصغرة الرسوم البيانية تظهر وحدات مضان النسبي (المحور الصادي) مقابل الوقت (خ -محور). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تحديد قابلية المخدرات مما أسفر عن مقتل منحنيات من البيانات REMA. وحدات مضان النسبية في وقت resaz القصوىكانت إشارة urin في الفقرة (أ) ريفامبيسين و (ب) موكسيفلوكساسين تعامل الآبار (من الشكل 3B) تطبيع إلى أي مكافحة المخدرات (نمو المتفطرات السلية الأقصى) إلى 100٪ البقاء على قيد الحياة. السيطرة خلفية تم طرح (فارغة) إشارات من كل عينة جيدا. وقد تآمر على البقاء على قيد الحياة في المئة لكل تركيز الفرد من العلاج من تعاطي المخدرات لتوليد منحنى القتل. تمثل البيانات في هذا الرقم وسائل ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، التي وصفناها في التفاصيل بديلا المتفطرات السلية نموذج العدوى مناسبة لاختبار فعالية الدواء. يأخذ هذا النموذج في الاعتبار اثنين من العوامل الرئيسية التي ينبغي إيلاء المزيد من الاهتمام خلال عملية التنمية السل المخدرات في وقت مبكر: وجود الحواجز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتغلغل المخدرات والتغيرات الأيضية من المتفطرات السلية خلال العدوى. في حين أظهرنا سابقا فوائد نموذج العدوى لدينا واقترح إمكانية توسيع نطاق العدوى لسرعة التوافق 16، وهنا علينا أن نبرهن على هذا يمكن ان يتحقق في الواقع من خلال تكييف النظام مباشرة في شكل لوحة 96-جيدا. القدرة على توليد MTB / بلعم المجاميع مباشرة في لوحات 96-جيدا هو مفيد لأنه يزيل شرط ماصة وتوزيع مجاميع من قارورة ثقافة كبيرة في الآبار الفردية، وهو أمر صعب بطبيعته كما أحجام الركام يمكن أن تصل إلى أحجام> 500 ميكرون. فإن حجم كبير من المجاميع بلعم المصابين منع استخدام P200 الماصات متعدد القنوات والتي هي ضرورية لفحوصات الإنتاجية لأنه إما تسد نصائح او ان pipetting لواسعة التفكك والمجاميع. تعديل هذا النظام العدوى إلى لوحات 96-جيدا يقلل من كمية من الخطوات التلاعب اللازمة ويولد الآبار موحدة مع كميات مماثلة من المتفطرات السلية المجاميع / البلاعم. على هذا النحو، فإن هذا النظام الاختبار هو قيمة خاصة ليس فقط في عملية التنمية في وقت مبكر للتنبؤ فعالية من المركبات مرشح الرصاص في الجسم الحي، ولكن في فحص إنتاجية المكتبات المخدرات.

والميزة الرئيسية لنموذج العدوى وصفها هي الاستفادة من BSL-2 متوافق سلالة المتفطرة السلية. القدرة على العمل في ظل ظروف BSL-2 هي عالية المردود، يسرع التلاعب في البروتوكول، والأهم من ذلك تمكن المختبرات التي لم يكن لديك الوصول إلى مرفق BSL-3 للقيامحد ذاته تقدم فحوصات فحص المخدرات. وتستخدم العوز الغذائي المتفطرات السلية مولودية 2 6206 سلالة هو مشتق من H37Rv 17 و 18 أن تحتفظ بجميع لكن 4 الجينات، panCD وleuCD، التي لا تؤثر على مقاومة المخدرات أو التسامح 16. بالمقارنة مع غيرها من بدائل المتفطرات السلية شائعة الاستخدام مثل M. البقرية BCG وم اللخنية، المتفطرات السلية مولودية 2 6206 هو الأكثر ارتباطا ضراوة المتفطرات السلية H37Rv، سلالة مرجعية للدراسات المرضية. الأهم من ذلك، فإنه يحافظ على موضع RD-1، الذي هو غائب من مجموعة بوسطن الاستشارية ويلعب دورا رئيسيا في المتفطرات السلية الفوعة والورم الحبيبي تشكيل 19. نسبيا، المتفطرات السلية مولودية 2 6206 هو أيضا أكثر أهمية لفحوصات تطوير السل للأدوية من M. اللخنية، وهي الأنواع سريعة النمو التي تختلف genomically من المتفطرات السلية ولها ملامح المقاومة للمضادات الحيوية المختلفة.

مقايسة الموصوفة هنا هو أيضا قيمة نظرا لمستوى عال من المرونة. لوحات 96-جيدا تحتوي على المجاميع MTB / البلاعم يمكن استخدامها ليس فقط للمعايرة العلاج بالعقاقير في يثلث كما بينا (الشكل 3)، ولكن أيضا لفحص المكتبات المخدرات بأكملها (الشكل 1B). بتركيز واحد، ويمكن لكل لوحة 96-جيدا الشاشة 58 مركبات. أن هذا الرقم يزيد بشكل كبير ل> 300 مركبات إذا تم تكييف النظام العدوى إلى لوحة 384 بشكل جيد، وهو ممكنا تماما على أساس أن حقيقة أن نحصل على إشارات ريسازورين قوية بعد السماح فقط للبكتيريا لتكرار لمدة 3 أيام. في الواقع، سيكون من السهل نسبيا للتكيف مع هذا النظام إلى شكل لوحة 384 بشكل جيد، والبعض من أن غالبية بروتوكول سيظل دون تغيير أسفل رفع كميات نسبيا لتتناسب مع شكل جيد أصغر. لتمكين إشارة كافية لفحص ريسازورين، قد يكونالمطلوبة لتمديد حضانة في الخطوة 4.2.5 إلى 7 أيام للسماح للنسخ المتماثل البكتيرية بما فيه الكفاية.

في حين اقتران هذا النموذج العدوى إلى فحص ريسازورين باعتباره من قراءة للبقاء المتفطرة السلية له فوائد عديدة، وهي الفعالية من حيث التكلفة، وبروتوكول فحص سريع في حين الحصول على نتائج مشابهة لأنظمة معيار الذهب الأخرى مثل BACTEC 460 20، فإنه مع ذلك لديها بعض القيود . فحص ريسازورين لا يمكن أن تميز بين الأدوية القاتلة للجراثيم ومبيد للجراثيم لأنه يقيس فقط النشاط الأيضي. هذا هو العائق المهم أن نأخذ في الاعتبار، والنشاط الأيضي منخفضة أصلا في كامنة المتفطرات السلية. ومع ذلك، فإن عنصرا رئيسيا من هذا الاختبار هو نموذج العدوى، والتي يمكن أن تكون متوافقة مع الرافضة قراءة لالمتفطرات السلية قابلية المخدرات وغيرها من الفحص ريسازورين. على سبيل المثال، بعد العلاج من تعاطي المخدرات والآبار يمكن مطلي مباشرة من ل(كفو) عد تشكيل وحدة مستعمرة، وذهب ستانالمعيارية لاختبار النشاط جراثيم من المركبات (رغم أن هذا غير متوافق مع فحص الإنتاجية). بدلا من ذلك، يمكن أن يقترن هذا النظام لوسيفيراز معربا عن المتفطرات السلية، وهو ما ثبت لربط ارتباطا وثيقا كفو عد 21. للاستفادة من نظام وسيفيراز لقياس قابلية المخدرات، ستكون هناك حاجة اثنين فقط من تغييرات على بروتوكول: ط) استبدال المتفطرات السلية -GFP مع المتفطرات السلية -luciferase وب) استخدام برايت بالشبكة وسيفيرين الكاشف في مكان ريسازورين في الخطوة 5. استخدام وسيفيراز معربا عن أن المتفطرات السلية تقصير تطوير فحص لمدة 30 دقيقة في حين زيادة كبيرة حساسية الاختبار لمستويات من شأنها أن تكون متوافقة بسهولة مع شكل 384 لوحة جيدا.

باختصار، نحن قد انتقلت بنجاح هذا النموذج العدوى إلى تنسيق لوحة 96-جيدا أن لديها عدد قليل نسبيا من خطوات التلاعب، واستنساخ عالية، والقدرة على إنتاج كميات لا حصر لها من البدايةمادة، كلها عوامل رئيسية في التوافق الخرج. هذا الاختبار هو أيضا قابل للتكيف بسهولة إلى العديد من الصيغ المختلفة والرافضة قراءة، مما يجعلها رصيدا قيما لعملية اكتشاف الدواء في وقت مبكر المتفطرات السلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

Tags

عدوى، العدد 121،
وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley,… More

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter