Introduction
La tuberculosis (TB) sigue siendo una grave amenaza mundial de la salud a pesar de la disponibilidad de regímenes de quimioterapia contra la tuberculosis durante más de 40 años 1. Esto se debe en parte a la necesidad de largos períodos de tratamiento de más de 6 meses utilizando múltiples combinaciones de fármacos, lo que conduce a paciente incumplimiento 2. La aparición de la tuberculosis resistente a los medicamentos en los últimos años se ha agravado aún más los problemas en un campo en el éxito del desarrollo de fármacos clínicamente aprobados es prácticamente inexistente 3. De hecho, a pesar del desarrollo exhaustiva fármaco anti-TB, sólo un único fármaco ha sido aprobado por la FDA para uso clínico en los últimos 40 años 4. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas generaciones de fármacos antituberculosos para hacer frente a este problema.
Un problema clave en el descubrimiento de fármacos TB es la falta de éxito de la transferencia a partir de compuestos con actividad in vitro de la eficacia en el ámbito clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, los enfoques basados diana se utilizan para la detección de drogas anti-Mtb 5, que no se tradujo en células bacterianas enteras. Incluso cuando se utilizan células Mtb, a menudo se lleva a cabo utilizando cultivos de caldo crecido, que no predicen con precisión la eficacia del fármaco in vivo 8, 9. Estos problemas han sido reconocidos y ensayos de cribado de fármacos contra macrófagos que contienen Mtb o latente Mtb se han establecido con éxito 8, 10, 11, 12. Sin embargo, incluso estos ensayos más avanzados no dan suficiente consideración a las barreras de penetración que los medicamentos encuentran en las lesiones pulmonares no vascularizados, y en los focos necróticos en el sitio de la infección. En efecto, Incluso para la primera línea de la tuberculosis rifampicina fármaco, la dosis subóptima ha sido cuestionada debido a insuficiente en el tejido vivo y el líquido cefalorraquídeo (LCR) La penetración de 13, 14, 15, así como una disminución de la eficacia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, los nuevos modelos y ensayos que tengan en cuenta estos parámetros durante el proceso de desarrollo temprana ventaja, mejoraría sin duda los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antituberculosos.
Para hacer frente a esta necesidad, hemos establecido recientemente un modelo de bajo costo, rápida, y BSL-2 compatibles alternativa infección para las pruebas de eficacia de drogas Mtb 16. Este modelo de infección producida densamente poblado Mtb dentro de grandes estructuras de agregados de macrófagos, que recapitula las barreras de penetración celular fisiológicamente relevantes y generó macrófagos passaged
A continuación se describe en detalle la generación de estructuras agregadas MTB / macrófagos para producir macrófagos pases Mtb adecuada para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos utilizando REMA. En particular, se muestra cómo este sistema la infección podría ser adaptado a un formato de 96 pocillos para la compatibilidad con la detección rendimiento de los fármacos antituberculosos de candidatos.
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Protocol
NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 es una cepa no virulenta 17, 18, todos los trabajos en este protocolo se puede realizar en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2).
1. Condiciones de cultivo para la proteína verde fluorescente que expresan M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP)
NOTA: La M. tuberculosis H37Rv derivado auxótrofo cepa 6206 mc 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada con el plásmido que expresa GFP pMN437 se utiliza en este protocolo 16. Es posible sustituir la cepa Mtb-GFP con no expresan GFP cepa de tipo salvaje para permitir un acceso más fácil de la cepa para los investigadores. Sin embargo, la expresión de GFP es deseable para permitir la confirmación visual de la fagocitosis y la formación de agregados de Mtb / macrófagos. para long almacenamiento a largo plazo, Mtb-GFP se congelaron a -80 ° C en 7H9 medio completo (descrito en el paso 1.1) suplementado con 20% de glicerol.
- Preparar completa medios Mtb-GFP (7H9-C), completándolo medio 7H9 con 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tiloxapol, / ml de ácido D-pantoténico 24 mg, 50 mg / ml de L-leucina y 50 mg / ml de higromicina B.
- Descongelar un vial de Mtb-GFP y añadir a 10 ml de 7H9-C en un matraz de fondo cuadrado PETG 30 mL.
- Incubar a 37 ° C en un agitador rotatorio (50 rpm). Tomar medidas de densidad óptica (OD 600) cada pocos días hasta DO600 alcanza 1,0 (aproximadamente 5-8 días).
- Diluir y la cultura paso según sea necesario para mantener un OD 600 entre 0,2 a 1,0.
- Para la infección, utilice una cultura establecida de Mtb-GFP dentro de la fase de crecimiento logarítmico (DO 600 de 0,6-1). Para evitar culturas clumpy, sonicar el frasco de cultivo de Mtb en un baño de agua (130 W; 3 x 5 s pulsos) once o dos veces a la semana
2. Las condiciones de cultivo para THP-1 células
- Preparar completa THP-1 medio celular (RPMI-C), completándolo RPMI 1640 con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal, 2 mM L-glutamina y HEPES 10 mM.
- Se incuban las células en un matraz T-75 a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro o citometría de flujo cada dos días y mantener las células THP-1 a una densidad entre ,1-0.600.000 por ml.
3. Protocolo de infección para generar estructuras de Mtb / macrófagos de agregado
- THP-1 de preparación de células (por placa de 96 pocillos)
- Centrifugar 7 x 10 6 células THP-1 a 250 g durante 5 min. Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C.
- Preparación de Mtb-GFP
- Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3200 xg durante 5 min en una centrífuga de balanceo-cubo ucantar una conversión de OD 600 = 1,0 x 10 3 8 bacterias / ml.
- Lavar una vez con RPMI-C y se centrifuga como en el paso 3.2.1.
- Volver a suspender en 7 ml de RPMI-C y agitar durante 10 s.
- Infección
NOTA: Véase la figura 1 para la plantilla.- Preparar una placa de 96 pocillos mediante la adición de 200 l de agua estéril en las filas A y H y las columnas 1 y 12 para una llanta de agua para evitar la evaporación del medio de cultivo.
- Añadir 200 l RPMI-C a la columna 2 (B2 a G2) para el control de fondo (blanco).
- Para infectar, añadir la suspensión de Mtb-GFP (paso 3.2) para THP-1 suspensión de células (paso 3.1) y mezclar bien con la pipeta. La final de la densidad de células THP-1 es 5 x 10 5 por ml y la multiplicidad correspondiente de la infección es 40.
- Verter el / Mtb-GFP suspensión THP-1 en un depósito de 25 ml.
- Añadir 200 l de células THP-1 / Mtb-GFP suspensión de los 96 pozos restantes (B3 a G11) usinga pipeta multicanal.
NOTA: Si se trabaja con placas múltiples de 96 pocillos, resuspender regularmente el THP-1 suspensión / Mtb queda en el depósito para asegurar que se añadió una mezcla homogénea a cada pocillo. - Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 7-10 días.
- Cambiar el medio cada 2 días retirando lentamente 100 l pasó medios desde la parte superior de cada pocillo y suavemente la adición de 100 l de pre-calentado medio RPMI-C utilizando una pipeta multicanal. No resuspender pozos y molestar a los agregados Mtb / macrófagos en el fondo de los pocillos.
- Examinar visualmente los pozos por microscopía de fluorescencia (objetivo 4-10X) al día, tomando nota del tamaño de los agregados Mtb / macrófagos. Durante el día 7-10, Mtb agregados / macrófagos deben ser lo suficientemente grande (véase la figura 2 para referencia) para proceder a las pruebas de la eficacia del fármaco (Sección 4).
- Si se desea, imágenes de la captura de los 96 pocillos utilizando un sistema de imágenes de células automatizado equipadoscon campo brillante y el filtro de GFP establece para documentar Mtb formación de agregados / macrófagos.
NOTA: Si los usuarios no tienen acceso a un sistema automatizado de imágenes, las imágenes de pozos representativos pueden ser tomadas con cualquier microscopio adecuado con capacidad de GFP y de campo brillante.
4. Ensayo de inhibición del crecimiento para evaluar la eficacia de medicamentos contra Mtb Derivado de MTB / agregados de macrófagos
- Preparación de la droga (por triplicado condiciones para dos fármacos)
NOTA: Consulte la Figura 1A para la plantilla.- En una placa de 96 pocillos separada, añadir 125 l de los medios de comunicación 7H9-C a través de B2 a G10.
- Preparar dos fármacos en el doble de la más alta concentración final deseada en 1 ml de 7H9-C para tener en cuenta la dilución en el paso 4.2.4.
- Añadir 250 l de cada fármaco a los pocillos B11-C11-D11 y E11-F11-G11, respectivamente, para los tratamientos por triplicado.
- Usando una pipeta multicanal, en serie dilute los fármacos de ensayo de dos veces moviendo 125 l de B11-B10-G11 en G10. Mezclar pipeteando 5 veces en cada paso.
- Continuar para pasar 125 l de una columna a otra (derecha a izquierda) a través de la placa, y dejar después de la columna 4.
- Después de mezclar la columna 4, deseche 125 l en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener alguna droga para permitir su uso como fondo (espacio en blanco) y los controles de crecimiento positivas.
NOTA: Como alternativa, siga plantilla en la figura 1B para las bibliotecas de pruebas de drogas. Cada placa de 96 pocillos puede acomodar a 58 medicamentos en una sola concentración. Preparar esta placa de fármaco usando el doble de la concentración final deseada, ya que se diluirá en un medio en el paso 4.2.4.
- El tratamiento farmacológico:
- Recuperar la placa de 96 pocillos que contenía el Mtb infectados con macrófagos (agregados Mtb / macrófagos).
- decantar cuidadosamente todos los pozos correspondientes (B2) a través de G11 con una pipeta multicanal.Realice esto de una manera de dos pasos: primero eliminar 150 l sin inclinar la placa, y luego eliminar residuos de medios (~ 50 l) por la inclinación de la placa y la inserción de la punta de la pipeta hasta el borde inferior del pozo. Como MTB / macrófagos agregados son adherentes a la parte inferior del pozo, ningún material se debe perder.
- Añadir con cuidado 100 l de 7H9-C medios de comunicación a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa que contiene los agregados / macrófagos Mtb.
- Con una pipeta de múltiples canales, transferir 100 l de la droga que contiene 96 pocillos de placa (etapa 4.1) a los pocillos correspondientes de la placa de la infección.
- Colocar en bolsa sellada y se incuba durante 3 días a 37 ° C.
5. La cuantificación de la eficacia de medicamentos usando el ensayo de microtitulación resazurina
- Preparar resazurina solución madre a una concentración final de 0,8 mg / ml en H 2 O. Se filtra a través de 0,22 micras de tamaño de poro de membrana de PVDF para la esterilización.
- Preparar la solución de trabajo resazurina mezclando resazurina solución madre, H2O y Tween-80 (solución al 20% en H2O) en una proporción de 2: 1: 1. Las concentraciones finales son 0,4 mg / ml de resazurina y 5% de Tween-80.
- El uso de un lector de placas, la configuración de un programa para leer la fluorescencia a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión cada 30 minutos durante 24 horas a 37 ° C. lector de placas pre-calentamiento a 37 ° C.
- Añadir 20 l de solución de trabajo de la resazurina a todos los pocillos pertinentes (B2 a través de G11) de la placa tratado con fármaco (etapa 4.11) usando una pipeta multicanal.
- Colocar la placa en el lector de placas e iniciar el programa establecido en el paso 5.3.
NOTA: Para facilitar el procesamiento de grandes volúmenes de placas de ensayo, es suficiente para desarrollar el ensayo en una incubadora a 37 ° y realizar solo fluorescencia lee cada 24 h. Esto es aplicable a los usuarios que no tienen acceso a un lector de placas con capacidades cinéticas e incubación también.
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Representative Results
Para confirmar la solidez de la adaptación de este modelo de infección al formato de placa de 96 pocillos, que aquí examinamos la sensibilidad a los medicamentos de Mtb derivado de nuestra 96 pocillos adaptada modelo de infección a la rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla dada en la figura 1A. Se demuestra que la generación de estructuras de agregados de macrófagos MTB / clave para este ensayo se puede producir de forma fiable en un formato de placa de 96 pocillos (Figura 2), lo que permite la compatibilidad rendimiento (Figura 1B). Macrófagos passaged Mtb producido de esta manera se puede utilizar directamente para las pruebas de la eficacia del fármaco usando el ensayo de microtitulación de resazurina bien caracterizado (Figura 3).
Como el ensayo de la resazurina se basa en las especies oxidativas producidas por Mtb metabólicamente activa para convertir la resazurina azul a la fluorescent resorufina rosa, el cambio de color y la fluorescencia se puede utilizar como un marcador sustituto para determinar la cantidad de crecimiento bacteriano. En la Figura 3A, se muestra que hay suficiente sensibilidad en el ensayo de la resazurina a detectar de forma fiable las bacterias Mtb viables capaces de replicarse en ausencia de fármacos después de sólo 3 días de incubación. Mientras que la confirmación visual de cambio de color de punto final es solamente una evaluación aproximada del crecimiento, podemos cuantificar con precisión mediante la medición de esta cinéticamente la conversión de la resazurina a su metabolito fluorescente resorufina usando un lector de placas (Figura 3B). Usando estos datos, la normalización para el control de crecimiento positivo (ausencia de fármacos) permite el cálculo de las curvas de la matanza de susceptibilidad para visualizar la eficacia del fármaco contra Mtb macrófagos a pases (Figura 4).
Aquí, los resultados representativos en las figuras 3 4 muestran que la concentración mínima inhibitoria (MIC), definida como la concentración más baja del antibiótico a la que se observó la inhibición del crecimiento del 90%, es mayor que 2 g / ml tanto para la rifampicina y moxifloxacina contra Mtb derivado de nuestro modelo de infección. Esto demuestra que nuestro modelo de infección predice la eficacia de los medicamentos contra Mtb que están más en línea con los valores de MIC contra determinados intracelular Mtb 8, y por lo tanto refleja las propiedades de barrera de difusión que son abandonados en la mayoría de los ensayos de sensibilidad a los medicamentos Mtb utilizando células bacterianas en caldo crecido.
Es importante destacar que los datos obtenidos mediante el ensayo descrito en el formato de 96 pocillos mostraron resultados altamente comparables a los que habíamos determinado previamente para la rifampicina y moxifloxacina contra Mtb macrófagos passaged 16.
Figura 1: disposición de la placa de Drogas. (A) plantilla Ejemplo de la placa de entrada de fármaco utilizado en el paso 4. Esto permite que para el ensayo paralelo de dos fármacos en pocillos por triplicado a 8 concentraciones definidas. Como un experimento representativo, se utilizó la rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) a partir de las 2 micras y 2,5 mM, respectivamente. También se proporciona (B) una plantilla alternativa para el cribado de rendimiento para mostrar la posibilidad de que las pruebas de 58 compuestos a una sola concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de Mtb / estructuras agregadas de macrófagos en placas de 96 pocillosformato. (A) Representante de campo claro y GFP se fusionaron imágenes de Mtb agregados -macrophage el día 9 después de la infección. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo 4X usando un programa de formación de imágenes de células automatizado que documenta todo el pozo por la costura de un montaje de 3 por 3 imágenes capturadas de forma individual. (B) Una imagen individual no cosido del campo visual se muestra en (A). Imagen del campo brillante y GFP (C) Un representante fusionada de una estructura agregada Mtb / macrófagos capturado con un objetivo de 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Usando el ensayo de microtitulación resazurina para medir la viabilidad de Mtb. (A) La presencia de viablcélulas e Mtb se pueden determinar simplemente mediante la conversión del colorante resazurina azul a su rosa, forma reducida. Los resultados representativos se muestran aquí usando rifampicina (RIF) y moxifloxacina (moxi) de acuerdo con la plantilla en la Figura 1A. (B) Para medir cuantitativamente la conversión de la resazurina, la fluorescencia de los pocillos individuales (que corresponde a la figura 3A) se controla cinéticamente durante 24 h como se describe en el paso 5. representativos mini-gráficos muestran unidades de fluorescencia relativa (eje y) frente al tiempo (x -eje). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Determinación de la susceptibilidad al fármaco matar curvas a partir de datos REMA. unidades de fluorescencia relativa en el momento de máxima resazseñal urin en rifampicina (A) y (B) tratado con moxifloxacino pozos (de la Figura 3B) se normalizaron a la no control de drogas (crecimiento Mtb máxima) como 100% de supervivencia. control de fondo señales (en blanco) se restaron de cada pocillo de muestra. El porcentaje de supervivencia se trazó para cada concentración individual de tratamiento de drogas para generar una curva de muerte. Los datos de esta figura representan la media ± SD de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, hemos descrito en detalle un modelo de infección de Mtb alternativa adecuada para las pruebas de la eficacia del fármaco. Este modelo tiene en cuenta dos factores clave que deben ser considerados en mayor medida durante el proceso de desarrollo de la primera medicamentos contra la tuberculosis: la presencia de barreras fisiológicamente relevantes a la penetración del fármaco y cambios metabólicos de Mtb durante la infección. Si bien ya hemos demostrado los beneficios de nuestro modelo de infección y propuso la posibilidad de ampliación de la infección por compatibilidad rendimiento de 16, aquí se demuestra que este hecho es realizable mediante la adaptación del sistema directamente en formato de placa de 96 pocillos. La capacidad de generar Mtb / macrófagos agregados directamente en placas de 96 pocillos es ventajoso ya que elimina el requisito de la pipeta y distribuir los agregados de un matraz de cultivo grande en pocillos individuales, que es inherentemente difícil, ya que los tamaños de los agregados pueden alcanzar tamaños> 500 micras. El gran tamaño de los agregados de macrófagos infectados impediría el uso de P200 pipetas multicanal que son necesarios para los ensayos de rendimiento, ya que sería o bien obstruir los consejos o extensa de pipeteado se rompería aparte los agregados. La modificación de este sistema infección a placas de 96 pocillos reduce la cantidad de etapas de manipulación necesarios y genera pozos uniformes con cantidades similares de Mtb agregados / macrófagos. Como tal, este sistema de ensayo es particularmente valioso no sólo en el proceso de desarrollo temprano para predecir la eficacia de compuestos candidatos de plomo en vivo, pero en la proyección rendimiento de bibliotecas de medicamentos.
Una ventaja clave del modelo de infección descrito es la utilización de una cepa de Mtb compatibles BSL-2. La capacidad de trabajar en condiciones BSL-2 es altamente rentable, acelera la manipulación del protocolo, y lo más importante permite a los laboratorios que no tienen acceso a una instalación BSL-3 para realizar lase avanzó ensayos de cribado de fármacos. El utilizada auxotrófico mc 2 Mtb 6206 cepa es un derivado de H37Rv 17, 18 que retiene todos menos 4 genes, PANCD y leuCD, que no afectan a la resistencia a fármacos o la tolerancia 16. En comparación con otros sustitutos de Mtb uso común, tales como M. bovis BCG y M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 está más estrechamente relacionado con Mtb H37Rv virulenta, la cepa de referencia para los estudios de patogénesis. Es importante destacar, que mantiene el locus RD-1, que está ausente de BCG y juega un papel importante en la virulencia Mtb y formación de granulomas 19. Comparativamente, Mtb mc 2 6206 también es más relevante para los ensayos de desarrollo de tuberculosis a los medicamentos que M. smegmatis, que es una especie de crecimiento rápido que es genómicamente diferente de Mtb y tiene diferentes perfiles de resistencia a los antibióticos.
El ensayo descrito aquí también es valioso debido a su alto nivel de flexibilidad. Las placas de 96 pocillos que contienen los agregados MTB / macrófagos se pueden utilizar no sólo para la valoración de los tratamientos con fármacos por triplicado como hemos mostrado (figura 3), sino también para el cribado de bibliotecas de drogas enteras (Figura 1B). A una sola concentración, cada placa de 96 pocillos puede detectar 58 compuestos. Este número aumentaría drásticamente a> 300 compuestos si el sistema de infección está adaptado a una placa de 384 pocillos, que es completamente factible basado en que el hecho de que se obtiene fuertes señales de resazurina después de que sólo permite que las bacterias se replican durante 3 días. De hecho, sería relativamente sencillo para adaptar este sistema al formato de placa de 384 pocillos, como distinta de la reducción a escala de los volúmenes proporcionalmente más adecuada para los así más pequeño, la mayor parte del protocolo de permanecería sin cambios. Para activar la señal sea adecuada para el ensayo de la resazurina, puede serrequerida para extender la incubación en el paso 4.2.5 a 7 días para permitir la suficiente replicación bacteriana.
Mientras que el acoplamiento de este modelo de infección para el ensayo de la resazurina como una lectura de datos para Mtb viabilidad tiene muchos beneficios, a saber, su rentabilidad y protocolo de ensayo rápido, mientras que la obtención de resultados comparables a otros sistemas estándar de oro como BACTEC 460 20, no obstante, tiene algunas limitaciones . El ensayo de la resazurina no puede discriminar entre los fármacos bacteriostáticos y bactericidas, ya que sólo mide la actividad metabólica. Esta es una limitación importante a tener en cuenta, ya que la actividad metabólica es inherentemente baja en Mtb latente. Sin embargo, el componente clave de este ensayo es el modelo de infección, que puede ser compatible con leer-outs para Mtb sensibilidad a los medicamentos que no sea el ensayo de la resazurina. Por ejemplo, después de tratamiento de drogas, los pozos pueden ser sembraron directamente para la formación de la unidad de recuento de colonias (CFU), el oro StanDard para probar la actividad bactericida de los compuestos (aunque esto no es compatible con la detección de rendimiento). Alternativamente, este sistema podría ser acoplado a luciferasa que expresa Mtb, que se ha demostrado que se correlaciona estrechamente con CFU contando 21. Para utilizar un sistema de luciferasa para medir la sensibilidad a los medicamentos, se necesitarían sólo dos cambios en el protocolo: i) la sustitución de Mtb-GFP con Mtb -luciferase y ii) el uso de reactivo luciferina Bright-Glo en lugar de resazurina en el paso 5. el uso de luciferasa que expresa Mtb acortaría el desarrollo del ensayo a 30 minutos, mientras que aumentando considerablemente la sensibilidad del ensayo a niveles que serían fácilmente compatible con el formato de 384 pocillos de placas.
En resumen, hemos hecho la transición con éxito este modelo de infección en un formato de placa de 96 pocillos que tiene relativamente pocas etapas de manipulación, alta reproducibilidad, y la capacidad de producir una cantidad infinita de partidamateriales, todos los factores clave en la compatibilidad rendimiento. Este ensayo también es fácilmente adaptable a diferentes formatos y leer-outs, por lo que es un activo valioso para el proceso de descubrimiento de fármacos principios de Mtb.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
