Introduction
Tuberculose (tbc) blijft een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid ondanks de beschikbaarheid van anti-TB chemotherapie regimes voor meer dan 40 jaar 1. Dit is deels te wijten aan de eis voor langere tijd de behandeling van meer dan 6 maanden gebruik van meerdere combinaties van geneesmiddelen, wat leidt tot niet-naleving 2 patiënt. De opkomst van resistente tbc in de afgelopen jaren nog verergerd problemen op een gebied waar de succesvolle ontwikkeling van klinisch goedgekeurde medicijnen is vrijwel non-existent 3. Sterker nog, ondanks uitputtende anti-TB geneesmiddelenontwikkeling slechts één geneesmiddel goedgekeurd door de FDA voor klinisch gebruik in de afgelopen 40 jaar 4. Zo worden nieuwe generaties anti-TB middelen dringend nodig om dit probleem aan te pakken.
Een belangrijk probleem bij tuberculose geneesmiddelen is het gebrek aan succesvolle overdracht uit verbindingen met in vitro activiteit werkzaamheid in de klinische setting= "xref"> 5, 6, 7. Aanvankelijk werden doelwit gebaseerde benaderingen gebruikt om te screenen op anti-Mtb drugs 5, die niet aan te vertalen naar hele bacteriële cellen. Zelfs wanneer Mtb cellen worden gebruikt, wordt vaak uitgevoerd met behulp bouillon gekweekt culturen, die niet nauwkeurig kan voorspellen geneesmiddelefficiëntie in vivo 8, 9. Deze problemen zijn erkend en screeningstesten voor geneesmiddelen tegen macrofagen bevattende Mtb of latente Mtb werden met succes 8, 10, 11, 12. Echter, zelfs deze meer geavanceerde assays onvoldoende rekening met de penetratie barrières drugs tegenkomen in de niet-gevasculariseerd pulmonaire laesies en in de necrotische foci op de plaats van infectie. InderdaadZelfs voor de eerste lijn TB geneesmiddel rifampicine is suboptimale dosering ondervraagd door onvoldoende in vivo weefsel en cerebrospinale vloeistof (CSF) penetratie 13, 14, 15 en verminderde werkzaamheid tegen intracellulaire Mtb 8, 9. Als zodanig, nieuwe modellen en testen die rekening zou houden met deze parameters tijdens het voortouw ontwikkelingsproces vroeg zou ongetwijfeld verbeteren TB drug discovery inspanningen.
Om aan deze behoefte te pakken, hebben we onlangs een goedkope, snelle en BSL-2 compatibele alternatieve infectie model voor MTB werkzaamheid van het geneesmiddel testen 16. Deze infectie model dichtbevolkte geproduceerd gepakt MTB in grote macrofagen aggregaat structuren, die fysiologisch relevante cellulaire penetratie barrières recapituleerde en genereerde macrofaag-gepasseerd
Hier beschrijven we in detail de generatie van MTB / macrofaag aggregaat structuren te produceren macrofaag gepasseerd MTB geschikt voor drug gevoeligheid testen met behulp van REMA. In het bijzonder tonen we hoe deze infectie systeem kan worden aangepast om een 96-well formaat voor compatibiliteit met screening van kandidaat anti-TB-geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Als M. tuberculosis mc 2 6206 is een avirulente stam 17, 18, kunnen alle werkzaamheden in dit protocol worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2-faciliteit (BSL-2).
1. Cultuur Voorwaarden voor Green Fluorescent Protein Het uiten van M. tuberculosis mc 2 6206 (MTB-GFP)
LET OP: De M. tuberculosis H37Rv afkomstig auxotroof stam mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) getransformeerd met de GFP tot expressie plasmide pMN437 wordt in dit protocol 16 gebruikt. Het is mogelijk om het Mtb-GFP-stam te vervangen door niet-GFP tot expressie brengende wildtype gemakkelijker toegankelijkheid van de stam voor onderzoekers mogelijk. Echter, GFP expressie is wenselijk om visuele bevestiging van fagocytose en de vorming van MTB / macrofaag aggregaten mogelijk te maken. voor long termijnopslag, Mtb-GFP werden ingevroren bij -80 ° C in volledige 7H9 medium (in stap 1.1 beschreven) aangevuld met 20% glycerol.
- Bereid volledige Mtb GFP media (7H9-C) door aanvulling 7H9-medium met 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 ug / ml D-pantotheenzuur, 50 ug / mL L-leucine en 50 ug / ml hygromycine B.
- Dooi een flacon van MTB-GFP en toe te voegen aan 10 ml van 7H9-C in een 30 ml vierkante bodem PETG kolf.
- Incubeer bij 37 ° C op roterende schudmachine (50 rpm). Neem metingen van optische dichtheid (OD 600) om de paar dagen tot OD 600 1,0 (ongeveer 5-8 dagen) bereikt.
- Verdunnen en passage cultuur als nodig is om een OD 600 te handhaven tussen 0,2-1,0.
- Voor infectie, gebruik van een gevestigde cultuur van de MTB-GFP in de logaritmische groeifase (OD 600 van 0,6-1). Om clumpy culturen voorkomen, ultrasone trillingen de cultuur kolf Mtb in een waterbad (130 W, 3 x 5 en peulvruchten) ONCe of twee keer per week
2. Cultuur Voorwaarden voor THP-1 cellen
- Bereid volledige THP-1 celmedium (RPMI-C) door toevoeging RPMI 1640 medium met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine en 10 mM HEPES.
- Incubeer cellen in een T-75 kolf bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
- Aantal cellen met een hemocytometer of flowcytometrie om de dag te handhaven en THP-1 cellen bij een dichtheid tussen 0,1-0.600.000 per mL.
3. Infectie Protocol bij MTB / macrofaag Aggregate Structures Genereer
- THP-1 celpreparaat (per 96 putjes)
- Centrifugeer 7 x 10 6 THP-1 cellen bij 250 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 7 ml RPMI-C.
- Mtb-GFP voorbereiding
- Centrifuge 2,8 x 10 8 MTB-GFP bij 3200 xg gedurende 5 minuten in een swingende-bucket centrifuge uzingen een omzetting van OD 600 1,0 = 3 x 10 8 bacteriën / ml.
- Was eenmaal met RPMI-C en gecentrifugeerd zoals in stap 3.2.1.
- Resuspendeer in 7 ml RPMI-C en vortex gedurende 10 s.
- Infectie
OPMERKING: Zie figuur 1 voor de template.- Bereid een 96-well plaat door toevoeging van 200 pl steriel water in rijen A en H en kolommen 1 en 12 een rand water om verdamping van kweekmedium voorkomen.
- Voeg 200 ul RPMI-C kolom 2 (B2 G2) voor de achtergrond controle (blanco).
- Te infecteren, voeg Mtb GFP suspensie (stap 3.2) aan THP-1 cel suspensie (stap 3.1) en meng goed door pipetteren. De uiteindelijke THP-1 celdichtheid 5 x 10 5 per ml en de overeenkomstige multipliciteit van infectie 40.
- Giet de THP-1 / MTB-GFP ophanging in een 25 ml reservoir.
- Voeg 200 ul van THP-1 / Mtb GFP suspensie alle resterende 96 putjes (B3 tot G11) usinga multi-channel pipet.
Opmerking: Als het werken met meerdere 96-well platen, regelmatig resuspendeer de resterende THP-1 / Mtb suspensie in het reservoir om een gelijkmatige mengsel wordt aan elk putje toegevoegd. - Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 7-10 dagen.
- Veranderen media elke 2 dagen door langzaam verwijderen 100 pi bracht inhoud van de bovenkant van elk putje en voorzichtig toevoegen van 100 ul voorverwarmde RPMI-C een multi-kanaal pipet. Niet putjes resuspendeer verstoren de Mtb / macrofaag aggregaten op de bodem van de putjes.
- Visueel onderzoek van de putten door fluorescentie microscopie (4-10X doelstelling) per dag, rekening houdend met de omvang van de MTB / macrofaag aggregaten. Per dag 7-10, moet MTB / macrofaag aggregaten voldoende groot zijn (zie figuur 2 voor de referentie) om door te gaan naar de werkzaamheid van drugs testen (hoofdstuk 4).
- Indien gewenst, foto's maken van de 96-wells met behulp van een geautomatiseerd cell imaging-systeem gemonteerdmet heldere veld en GFP filter sets te MTB / macrofaag aggregaat vorming documenteren.
LET OP: Als gebruikers geen toegang hebben tot een geautomatiseerd imaging systeem kunnen beelden van representatieve putten worden genomen met behulp van een geschikte microscoop met GFP en heldere veld mogelijkheden.
4. Groei Remming Assay te beoordelen Drug werkzaamheid tegen Mtb Afgeleid van MTB / macrofaag Aggregaten
- Bereiding geneesmiddel (triplo voorwaarden voor twee geneesmiddelen)
OPMERKING: Zie figuur 1A voor template.- In een afzonderlijke 96-well plaat, voeg 125 ul van 7H9-C media B2 tot G10.
- Bereid twee geneesmiddelen dubbel zo hoog gewenste eindconcentratie in 1 ml van 7H9-C die overeenkomt met het verdunning in stap 4.2.4.
- Voeg 250 ul van elk geneesmiddel te putten B11-C11-D11 en E11-F11-G11, respectievelijk drievoud behandelingen.
- Een multi-kanaal pipet, serieel dilute de test drugs tweevoudige door het bewegen van 125 pi van B11-G11 in B10-G10. Meng door pipetteren 5 keer bij elke stap.
- Verder 125 ul van kolom naar kolom (van rechts naar links) over de plaat en stoppen na kolom 4.
- Na het mengen kolom 4, gooi 125 ul in een afvalcontainer. Kolommen 2 en 3 mogen geen drugs bevatten om voor gebruik als een achtergrond (lege) en positieve controles groei.
NB: Als alternatief, volg sjabloon in figuur 1B voor het testen van drugs bibliotheken. Elke 96-putjesplaat kan geschikt 58 geneesmiddelen bij één concentratie. Bereid deze drug plaat met behulp van het dubbele van de gewenste uiteindelijke concentratie, omdat het in de helft zal worden verdund in stap 4.2.4.
- Behandeling met geneesmiddelen:
- Haal de 96-well plaat met de Mtb geïnfecteerde macrofagen (MTB / macrofaag aggregaten).
- decanteren zorgvuldig alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) met een multi-channel pipet.Voer deze in een twee-staps manier: eerste 150 ul verwijderen zonder het kantelen van de plaat en verwijder de resterende media (~ 50 pi) door het kantelen van de plaat en het plaatsen van de pipet tip om de onderste rand van de put. Zoals Mtb / macrofaag aggregaten aanhanger van de bodem van de put, mag geen materiaal verloren.
- Zachtjes 100 ul van 7H9-C media toe te voegen aan alle relevante bronnen (B2 door middel van G11) van de plaat met de MTB / macrofaag aggregaten.
- Een multi-kanaal pipet, breng 100 ui van de geneesmiddel bevattende 96 putjes (stap 4,1) in de overeenkomstige putjes van de plaat infectie.
- In een afgesloten zak en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C.
5. Het kwantificeren van de werkzaamheid van het geneesmiddel met behulp van de Resazurin Microtiterplaten Assay
- Bereid Resazurin voorraadoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 0,8 mg / ml in H2O gefiltreerd door 0,22 urn poriegrootte PVDF membraan sterilisatie.
- Bereid resazurin werkoplossing door mengen Resazurin voorraadoplossing, H2O en Tween-80 (20% oplossing in H 2 O) in een 2: 1: 1 ratio. Uiteindelijke concentraties 0,4 mg / ml resazurine en 5% Tween-80.
- Met behulp van een plaatlezer, opstelling een programma fluorescentie afgelezen bij 530 nm excitatie en 590 nm emissie elke 30 min gedurende 24 uur bij 37 ° C. Voorverwarmen plaatlezer bij 37 ° C.
- Voeg 20 ul van Resazurin werkoplossing alle relevante putjes (B2 tot G11) van de met geneesmiddel behandelde plaat (stap 4.11) een multi-channel pipet.
- Plaats de plaat op de plaat lezer en start de set-up in stap 5.3 programma.
Opmerking: Om de verwerking van grote hoeveelheden testplaten vergemakkelijken, kan worden volstaan met de bepaling in een 37 ° C incubator ontwikkelen en uitvoeren van één leest fluorescentie elke 24 uur. Dit is ook van toepassing op gebruikers die geen toegang hebben tot een plaat reader met kinetische en incubatie bekwaamheden beschikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de robuustheid van aanpassing van deze infectie model 96-well plaat formaat bevestigen we hier onderzocht de drug gevoeligheid van Mtb afgeleid van onze 96-well aangepast infectiemodel tegen rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) volgens het model weergegeven in figuur 1A. We tonen aan dat het genereren van Mtb / macrofaag aggregaatstructuren sleutel tot deze test betrouwbaar kan worden geproduceerd in een 96-well plaat formaat (Figuur 2), waardoor doorvoer compatibiliteit (Figuur 1B) mogelijk. Macrofaag gepasseerd Mtb die op deze wijze kan direct worden gebruikt voor drug werkzaamheidstest met de goed gekarakteriseerde Resazurin microtiter assay (figuur 3).
Aangezien de Resazurin assay is gebaseerd op de oxidatieve deeltjes door metabolisch actieve Mtb de blauwe Resazurin converteren naar het fluorescent roze resorufine, kan de verandering in kleur en fluorescentie worden gebruikt als een surrogaat marker om de hoeveelheid bacteriegroei te bepalen. In figuur 3A tonen wij dat er genoeg gevoeligheid in de Resazurin test op betrouwbare wijze vast Mtb levensvatbare bacteriën kan repliceren in afwezigheid van geneesmiddelen na 3 dagen incubatie. Terwijl visuele bevestiging van het eindpunt van kleur te veranderen is slechts een benadering evaluatie van de groei, kunnen wij nauwkeurig dit te kwantificeren door kinetisch het meten van de omzetting van resazurin zijn fluorescerende metaboliet resorufin behulp van een plaat reader (Figuur 3B). Met behulp van deze gegevens normaliseert de positieve groeicontrole (zonder geneesmiddelen) maakt de berekening van de gevoeligheid doden curves drug werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd Mtb zichtbaar (figuur 4).
Hier, de representatieve resultaten in Figuren 3 4 blijkt dat de minimale remmende concentratie (MIC), gedefinieerd als de laagste concentratie van het antibioticum waarbij 90% groeiremming wordt waargenomen, groter dan 2 ug / ml voor zowel rifampicine en moxifloxacine tegen Mtb afgeleid van onze infectiemodel. Dit toont aan dat onze infectie model voorspelt effectiviteit van anti-Mtb geneesmiddelen die meer in lijn zijn met MIC-waarden bepaald tegen intracellulaire Mtb 8, en daarmee weerspiegelt de diffusie-barrière-eigenschappen die worden verwaarloosd in de meeste MTB drug gevoeligheid testen met behulp van bouillon gegroeid bacteriële cellen.
Belangrijk is dat de verkregen met de test beschreven in 96-well formaat gegevens toonden zeer vergelijkbare resultaten met die we eerder bepaald voor rifampicine en moxifloxacine tegen macrofagen gepasseerd Mtb 16.
Figuur 1: Drug plaatindeling. (A) Voorbeeld model van het geneesmiddel challenge plaat toegepast in stap 4. Dit maakt het parallelle onderzoek van twee geneesmiddelen in triplo putjes 8 vastgestelde concentraties. Als representatief experiment gebruikten we rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) beginnend bij 2 uM en 2,5 uM, respectievelijk. (B) Een alternatief model voor screening is ook voorzien om de mogelijkheid van het testen van 58 verbindingen vertonen bij een enkele concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Vorming van Mtb / macrofaag aggregaatstructuren in 96-well plaatformaat. (A) Vertegenwoordiger helder veld en GFP samengevoegd beelden van Mtb -macrophage aggregaten op dag 9 na infectie. Beelden werden vastgelegd met een 4X doelstelling met behulp van een geautomatiseerd cell imaging-programma dat het hele goed documenteert door stikken een montage van 3 bij 3 individueel opgenomen beelden. (B) Een individuele non-gestikt beeld van het gezichtsveld getoond in (A). (C) Een representatief beeld helder veld en GFP gefuseerd van een MTB / macrofaag aggregaat structuur gevangen met een 10x doelstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het gebruik van de resazurin microtiter test om MTB meten van de levensvatbaarheid. (A) De aanwezigheid van viable Mtb cellen kunnen eenvoudig worden bepaald door de omzetting van de blauwe kleurstof Resazurin zijn roze, gereduceerde vorm. Representatieve resultaten worden hier gebruikt rifampicine (RIF) en moxifloxacine (Moxi) volgens de template in figuur 1A. (B) om kwantitatief meten van de omzetting van Resazurin, fluorescentie van afzonderlijke putjes (overeenkomstig figuur 3A) werd kinetisch gemonitord gedurende 24 uur zoals beschreven in stap 5. Representatieve mini-grafieken relatieve fluorescentie-eenheden (y-as) versus de tijd (x -as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bepalen drug gevoeligheid doden curves van REMA data. Relatieve fluorescentie-eenheden ten tijde van maximale resazurin signaal in (A) en rifampicine (B) moxifloxacine behandelde putjes (figuur 3B) werden genormaliseerd aan de controle geen geneesmiddel (maximale groei Mtb) als 100% overleving. Achtergrond controle (lege) signalen werden afgetrokken van elk monster ook. Het percentage overleving werd uitgezet voor elke afzonderlijke concentratie van therapie om een moord curve te genereren. Gegevens in deze figuur vertegenwoordigen de gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we gedetailleerd beschreven alternatieve Mtb infectiemodel geschikt voor drug werkzaamheid testen. Dit model houdt rekening met twee belangrijke factoren die meer rekening moet worden gehouden tijdens de vroege TB geneesmiddelenontwikkelingsproces: de aanwezigheid van fysiologisch relevante barrières voor penetratie van het geneesmiddel en metabolische veranderingen van Mtb tijdens infectie. Terwijl we eerder de voordelen van onze infectie model hebben laten zien en de mogelijkheid van het opschalen van de infectie voor doorvoer compatibiliteit 16 voorgesteld, Hier laten we zien dat dit inderdaad bereikt door direct aanpassing van het systeem in 96-well plaat formaat. De mogelijkheid om Mtb / macrofagen genereren aggregaten direct in 96-well platen is voordelig omdat het verwijdert de verplichting om pipet en de aggregaten verdelen van een grote kweekfles in afzonderlijke putjes, die inherent moeilijk als de grootte van de aggregaten afmetingen kunnen bereiken> 500 urn. De grote omvang van de geïnfecteerde macrofaag aggregaten zou het gebruik van P200 multichannel pipetten dat throughput assays noodzakelijk aangezien het ofwel zou verstoppen de uiteinden of weids pipetteren zou splitsen de aggregaten voorkomen. De wijziging van deze infectie systeem 96-well platen vermindert de hoeveelheid manipulatie stappen die genereert uniforme putjes met gelijke hoeveelheden Mtb / macrofaag aggregaten. Als zodanig is dit bepalingssysteem is bijzonder waardevol niet alleen in de vroege ontwikkelingsproces om de werkzaamheid van lead kandidaat-verbindingen in vivo te voorspellen, maar in de screening van geneesmiddelen bibliotheken.
Een belangrijk voordeel van de beschreven infectie model is het gebruik van een BSL-2 compatibel MTB stam. De mogelijkheid om te werken onder BSL-2 omstandigheden is zeer kosteneffectief, versnelt manipulatie van het protocol, en vooral in staat stelt laboratoria die geen toegang hebben tot een BSL-3 faciliteit hebben om de uit te voerense geavanceerde drug screeningstesten. De gebruikte auxotrofe MTB mc 2 6206 stam is een afgeleide van H37Rv 17, 18, dat alles behalve 4 genen, panCD en leuCD, die niet van invloed drug resistentie of tolerantie 16 behoudt. In vergelijking met andere veel gebruikte Mtb surrogaten zoals M. bovis BCG en M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 is het meest nauw verwant aan virulente Mtb H37Rv, de referentie-stam voor de pathogenese studies. Belangrijker echter ook steeds RD-1 locus, dat afwezig is in BCG en speelt een belangrijke rol in virulentie en Mtb granuloomvorming 19. Relatief, Mtb mc 2 6206 is ook meer van belang voor tbc-ontwikkeling van geneesmiddelen testen dan M. smegmatis, dat is een snelgroeiende soorten die het genoom verschilt van MTB en heeft verschillende antibioticaresistentie profielen.
De beschreven test is ook waardevol vanwege de hoge flexibiliteit. De 96-well platen met de Mtb / macrofaag aggregaten worden niet alleen gebruikt voor titratie van medicamenteuze behandelingen in triplo zoals we hebben aangetoond (figuur 3), maar ook voor het screenen van bibliotheken gehele geneesmiddel (Figuur 1B). Bij één concentratie, kan elke 96-well plaat screenen 58 verbindingen. Dit aantal drastisch toenemen tot> 300 verbindingen als de infectie wordt aangepast om een 384-well plaat, die volledig mogelijk op basis van het feit dat we sterk resazurin signalen verkregen na waardoor de bacterie repliceren gedurende 3 dagen. In feite zou het betrekkelijk eenvoudig om deze aan te passen aan 384-well plaat formaat, andere dan schaalverkleining de hoeveelheden evenredig aan de kleinere well formaat passen de meeste protocol blijft ongewijzigd. Voldoende signaal voor de Resazurin assay schakelen, kan hetverplicht de incubatie verlengen stap 4.2.5 tot 7 dagen om voor voldoende bacteriële replicatie.
Terwijl het koppelen van deze infectie model om de resazurin assay als een read-out voor MTB levensvatbaarheid heeft vele voordelen, namelijk de kosteneffectiviteit en snelle assay protocol, terwijl het verkrijgen van vergelijkbare resultaten op andere gouden standaard systemen zoals BACTEC 460 20, toch wel een aantal beperkingen . De resazurin test kan geen onderscheid maken tussen bacteriostatische en bacteriedodende drugs, omdat het meet alleen metabolische activiteit. Dit is een belangrijke beperking in gedachten te houden, zoals metabole activiteit is van nature laag in latente MTB. Echter, de belangrijkste component van deze test is de infectie-model, die compatibel zijn met read-outs voor MTB drug gevoeligheid anders dan de resazurin test kan zijn. Bijvoorbeeld, na behandeling met geneesmiddelen, putten kan direct uitgestreken voor kolonievorming eenheid (CFU) te tellen, het goud standard bactericide activiteit van testverbindingen (hoewel dit niet geschikt throughput screening). Alternatief kan dit systeem worden gekoppeld aan luciferase tot expressie Mtb, waarvan is aangetoond dat nauw correleren met CFU tellen 21. Een luciferase systeem gebruiken om drug gevoeligheid te meten, zou slechts twee wijzigingen aan het protocol vereist: i) vervanging van Mtb GFP met Mtb -luciferase en ii) het gebruik van Bright-Glo luciferine reagens in plaats van Resazurin in stap 5. het gebruik van luciferase expressie Mtb zouden de ontwikkeling van de test verkorten 30 min tijdens de assay gevoeligheid voor niveaus die moeilijk verenigbaar met 384 putjes format zou aanzienlijk verhogen.
Samengevat hebben we met succes overgezet deze infectie model in een 96-well plaat formaat dat relatief weinig stappen van manipulatie, hoge reproduceerbaarheid en het vermogen om eindeloze hoeveelheden startpunt producerenmateriaal, alle belangrijke factoren van de overslag compatibiliteit. Deze test is ook gemakkelijk aan te passen aan vele verschillende formaten en lees-outs, waardoor het een waardevolle aanwinst voor het begin van de Mtb drug discovery proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
