Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung Mycobacterium tuberculosis

Summary

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Abstract

Der frühe Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente wird durch die ineffiziente Umsetzung von Verbindungen mit In-vitro-Aktivität in die Wirksamkeit im klinischen Umfeld behindert. Dies ist wahrscheinlich auf eine mangelnde Berücksichtigung der physiologisch relevanten zellulären Penetrationsbarrieren zurückzuführen, die im infizierten Wirt vorhanden sind. Wir haben kürzlich ein alternatives Infektionsmodell etabliert, das große Makrophagen-Aggregatstrukturen erzeugt, die dicht gepackte M. tuberculosis (Mtb) im Kern enthalten und sich für Empfindlichkeitstests von Medikamenten eignen. Dieses Infektionsmodell ist kostengünstig, schnell und vor allem BSL-2-kompatibel. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren zur Generierung von Mtb/Makrophagen-Aggregatstrukturen, die Makrophagen-passageiertes Mtb für Arzneimittelempfindlichkeitstests produzieren würden. Insbesondere zeigen wir, wie dieses Infektionssystem direkt an das 96-Well-Plattenformat angepasst werden könnte, was die Durchsatzfähigkeit für das Screening von Wirkstoffbibliotheken gegen Mtb zeigt. Insgesamt ist dieser Assay aufgrund seiner Einfachheit, Kosteneffizienz und Skalierbarkeit eine wertvolle Ergänzung der derzeit verfügbaren Mtb-Wirkstoffforschungs-Toolbox.

Introduction

Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB - Chemotherapien seit über 40 Jahren ^ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung ² zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente ³ praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB - Medikamentenentwicklung,....

Protocol

HINWEIS: M. tuberculosis mc ² 6206 ist ein avirulenten Stamm ^{17, 18,} alle Arbeiten in diesem Protokoll kann in einem Biosafety Level 2 - Anlage (BSL-2) durchgeführt werden.

1. Kulturbedingungen für Green Fluorescent Protein exprimieren M. tuberculosis mc ² 6206 (Mtb -GFP)

HINWEIS: Die M. tuberculosis H37Rv - auxotrophe Stamm mc ² 6206 abgeleitet (Δ panCD, Δ leuCD) , transformiert mit dem Plasmid gfp pMN437 exprimierenden ¹⁶ in diesem Pr....

Results

Um die Robustheit der Anpassung dieser Infektionsmodell auf 96-Well - Plattenformat bestätigen, untersuchten wir hier die Wirkstoffansprechverhaltens von Mtb abgeleitet aus unserer 96-Well angepasst Infektionsmodell Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) nach der Vorlage in Abbildung 1A. Wir zeigen , dass die Erzeugung von Mtb / Makrophagen Aggregatstrukturen Schlüssel zu diesem Assay kann zuverlässig in einer 96-Well - Plattenformat (Figur 2).......

Discussion

Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb - Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt haben , und sc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7H9	BD Difco	271310	Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers
Middlebrook OADC	BD Biosciences	212351
Tyloxapol	Sigma	T8761	20%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
D-Pantothensäure, Hemicalciumsalz	Sigma	P5710	Bereiten Sie 24 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
L-Leucin	MP Biomedicals	194694	von 50 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter Sterilisierung von
Hygromycin B	EMD Millipore	400051	Herstellung von 200 mg/ml Stammlösung in H2O
Nalgene Square PETG Medienflasche	Thermo Fisher	2019-0030
RPMI 1640 Medium	Hyclone	SH30027.01
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S12450H
L-Glutamin	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Cytation 3 Plate Reader	Biotek		Austauschbar mit jedem Fluoreszenzplatten-Reader und Mikroskop
Gen5 Software	Biotek		Aufzeichnung und Analyse von Rezasurin-Coversion
Rifampicin	Fisher Scientific	BP2679250	von 10 mg/ml Stammlösung in H2O
Moxifloxacin	Hydrochlorid Acros Organics	457960010	Herstellung von 10 mg/ml Stammlösung in H2O
Resazurin Natriumsalz	Sigma	R7017	Zubereitung von 800 μm; g/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
Tween-80	Fisher Scientific	T164500	20%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren