Introduction
Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB - Chemotherapien seit über 40 Jahren ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung 2 zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente 3 praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB - Medikamentenentwicklung, nur ein einziges Medikament für die klinische Anwendung FDA gewesen 4 in den letzten 40 Jahren zugelassen. So werden neue Generationen von Anti-TB-Medikamente sind dringend erforderlich, um dieses Problem zu lösen.
Ein wesentliches Problem bei der TB Drug Discovery ist der Mangel an erfolgreichen Transfer von Verbindungen mit in - vitro - Aktivität zur Wirksamkeit in der klinischen Einstellung= "Xref"> 5, 6, 7. Zunächst wurden Zielbasierte Ansätze verwendet 5 für Anti- Mtb Drogen zu screenen, die in ganze Bakterienzellen zu übersetzen ist fehlgeschlagen. Selbst wenn Mtb - Zellen verwendet werden, wird es oft durchgeführt Brühe gewachsenen Kulturen verwendet, die nicht genau Arzneimittelwirksamkeit in vivo 8, 9 vorherzusagen. Diese Probleme wurden erkannt und Wirkstoff - Screening - Assays gegen Makrophagen enthalten , Mtb oder latent Mtb wurden erfolgreich etabliert 8, 10, 11, 12. Aber auch diese erweiterte Tests geben keine ausreichende Berücksichtigung der Durchdringung Barrieren, die Drogen in den nicht-gefäßLungenLäsionen auftreten, und in der Nekrosen an der Stelle der Infektion. Tatsächlich, Auch für die First-Line - TB - Medikamente Rifampicin, suboptimale Dosierung wurde 13, 14, 15 als auch in vivo Gewebe und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) Penetration aufgrund unzureichender in Frage gestellt als Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mtb 8 verringert, 9. Als solche neue Modelle und Tests, die Berücksichtigung dieser Parameter während der frühen Führung Entwicklungsprozess zweifellos TB Drug Discovery nehmen würde Anstrengungen verbessern würde.
Um diesem Bedarf zu begegnen, wir eine kostengünstige, schnelle und BSL-2 - kompatible Alternative Infektionsmodell für Mtb Arzneimittelwirksamkeitsprüfung 16 vor kurzem etabliert. Diese Infektionsmodell produziert dicht Mtb verpackt in großen Makrophagen Aggregatstrukturen, die physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert und erzeugt Makrophagen-agierten
Hier beschreiben wir ausführlich in der Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen Makrophagen-agierten Mtb geeignet für die Arzneimittelempfindlichkeitstests unter Verwendung von REMA herzustellen. Insbesondere zeigen wir, wie diese Infektion System auf eine 96-Well-Format für die Kompatibilität mit Durchsatz-Screening von Kandidaten-Anti-TB-Medikamente angepasst werden könnte.
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Protocol
HINWEIS: M. tuberculosis mc 2 6206 ist ein avirulenten Stamm 17, 18, alle Arbeiten in diesem Protokoll kann in einem Biosafety Level 2 - Anlage (BSL-2) durchgeführt werden.
1. Kulturbedingungen für Green Fluorescent Protein exprimieren M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP)
HINWEIS: Die M. tuberculosis H37Rv - auxotrophe Stamm mc 2 6206 abgeleitet (Δ panCD, Δ leuCD) , transformiert mit dem Plasmid gfp pMN437 exprimierenden 16 in diesem Protokoll verwendet wird. Es ist möglich , die Mtb -GFP Stamm mit nicht - GFP - exprimierenden Wildtyp - Stamm zu ersetzen für Forscher leichter Zugänglichkeit des Stammes zu ermöglichen. Allerdings ist die GFP - Expression wünschenswert visuelle Bestätigung der Phagozytose und die Bildung von Mtb / Makrophagen - Aggregate zu ermöglichen. Für long Zeitlagerung, Mtb -GFP wurden ergänzt mit 20% Glycerin bei -80 ° C in vollständiger 7H9 Medium (in Schritt 1.1 beschrieben) eingefroren.
- Bereiten vollständige Mtb -GFP Medien (7H9-C) durch Ergänzung 7H9 - Medium mit 10% OADC Middlebrook, 0,02% Tyloxapol, 24 ug / ml D-Pantothensäure, 50 ug / ml L-Leucin und 50 ug / ml Hygromycin B.
- Ein Fläschchen mit Mtb -GFP auftauen und in einem 30 ml quadratischem Boden PETG Kolben auf 10 ml 7H9-C hinzufügen.
- Bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler (50 rpm). Nehmen Sie Messungen der optischen Dichte (OD 600) alle paar Tage , bis die OD 600 erreicht 1,0 (ca. 5-8 Tage).
- Verdünnen und Passage Kultur nach Bedarf eine OD 600 zwischen 0,2 bis 1,0 zu halten.
- Zur Infektion eine etablierte Kultur der Mtb -GFP innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von 0,6-1) verwenden. Um klumpig Kulturen zu vermeiden, beschallen die Mtb Kulturflasche in einem Wasserbad (130 W, 3 x 5 s Pulse) ONCe oder zweimal pro Woche
2. Kulturbedingungen für THP-1-Zellen
- Bereiten vollständige THP-1-Zellmedium (RPMI-C) von RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES ergänzt.
- Inkubiere Zellen in einem T-75 - Kolben bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder Durchflusszytometrie jeden zweiten Tag und aufrechtzuerhalten THP-1-Zellen in einer Dichte zwischen 0,1 bis 0.600.000 pro mL.
3. Infektion Protokoll zum Generieren Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen
- THP-1 Zellpräparation (pro 96-well - Platte)
- Zentrifuge 7 x 10 6 THP-1 - Zellen bei 250 xg für 5 min. Resuspendieren in 7 ml RPMI-C.
- Mtb -GFP Vorbereitung
- Zentrifuge 2,8 x 10 8 Mtb -GFP bei 3.200 xg für 5 min in einem Schwenkbecherzentrifuge ueine Umwandlung von 1,0 OD 600 = 3 x 10 8 Bakterien / ml singen.
- Wasche einmal mit RPMI-C und zentrifugiert wie in Schritt 3.2.1.
- Resuspendieren in 7 ml RPMI-C und 10 s vortexen.
- Infektion
HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für eine Vorlage.- Vorbereiten eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Zugabe von 200 & mgr; l sterilem Wasser in den Reihen A und H und Spalt 1 und 12 für eine Wasserverdampfung von Felgenkulturmedium zu verhindern.
- Füge 200 & mgr; l RPMI-C, bis Spalte 2 (B2 bis G2) für die Hintergrundkontrolle (Blank).
- Mtb -GFP Suspension (Stufe 3.2) zu THP-1 - Zellsuspension (Schritt 3.1) und gut mischen durch Pipettieren zu infizieren, hinzuzufügen. Die endgültige THP-1 Zelldichte beträgt 5 x 10 5 pro ml , und die entsprechende Vielzahl der Infektion ist 40.
- Gießen Sie die THP-1 / Mtb -GFP Suspension in einem 25 - ml - Reservoir.
- In 200 ul THP-1 / Mtb -GFP Suspension auf die restlichen 96 Vertiefungen (B3 bis G11) usinga Mehrkanalpipette.
HINWEIS: Wenn mit mehreren 96-Well - Platten arbeiten, resuspendieren regelmäßig die restlichen THP-1 / Mtb Suspension in dem Vorratsbehälter eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten , zu jeder Vertiefung zugegeben. - Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage.
- Änderungsmedien alle 2 Tage durch langsames Entfernen 100 ul verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung und sanft Zugabe von 100 & mgr; l vorgewärmtes RPMI-C einen Mehrkanal-Pipette. Resuspendieren Sie nicht Brunnen und stören die Mtb / Makrophagen - Aggregate auf dem Boden der Wells.
- Sichtprüfung der Vertiefungen durch Fluoreszenzmikroskopie (4-10 x Objektiv) täglich, Kenntnis von der Größe von Mtb / Makrophagen - Aggregate nehmen. Am Tag 7-10, sollte Mtb / Makrophagen - Aggregate ausreichend groß sein (siehe 2 für die Bezugnahme auf Abbildung) für die Arzneimittelwirksamkeitsprüfung (Abschnitt 4) , um fortzufahren.
- Falls gewünscht, können die Aufnahmen der 96-Mulden eine automatisierte Cell Imaging System ausgestattetmit Hellfeld und GFP - Filter setzt Mtb / Makrophagen - Aggregatbildung zu dokumentieren.
HINWEIS: Wenn die Benutzer keinen Zugriff auf ein automatisiertes Imaging-System haben, Bilder von repräsentativen Brunnen mit GFP und Hellfeld-Funktionen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Mikroskop aufgenommen werden.
4. Growth Inhibition Assay zur Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mtb Beurteilen von Mtb / Makrophagen - Aggregates Abgeleitet
- Arzneimittelzubereitung (dreifacher Ausfertigung Bedingungen für zwei Medikamente)
HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für Vorlage.- In einem separaten 96-Well-Platte, fügen Sie 125 ul 7H9-C Medien B2 bis zu G10.
- Bereiten zwei Medikamente bei der doppelten höchsten gewünschte Endkonzentration in 1 ml 7H9-C für die Verdünnung zu berücksichtigen, in Schritt 4.2.4.
- In 250 ul jeder Droge in die Vertiefungen B11-C11-D11 und E11-F11-G11, die jeweils für drei Exemplaren Behandlungen.
- Verwendung einer Mehrkanalpipette, seriell dilute die Testmedikamente zweifach um 125 & mgr; l von B11-G11 in B10-G10 bewegt. Mischen durch Pipettieren 5 mal bei jedem Schritt.
- Weiter 125 & mgr; l von einer Spalte zu bewegen (von rechts nach links) über die Platte, und nicht mehr, nachdem Spalte 4.
- Nach dem Mischen Spalte 4, verwerfen 125 & mgr; l in einen Abfallbehälter. Die Spalten 2 und 3 sollten keine Medikamente enthalten, die für die Verwendung als Hintergrund (Blank) und positive Wachstumskontrollen zu ermöglichen.
Hinweis: Alternativ folgen Vorlage in 1B zum Testen Droge Bibliotheken. Jede 96-Well-Platte 58 Medikamente in einer einzigen Konzentration aufnehmen kann. Bereiten Sie dieses Medikament Platte doppelt um die gewünschte endgültige Konzentration verwendet wird, da es in der Mitte in Schritt 4.2.4 verdünnt werden.
- Medikamentöse Behandlung:
- Rufen Sie die 96-Well - Platte der Mtb - infizierten Makrophagen (Mtb / Makrophagen - Aggregate) enthält.
- dekantieren sorgfältig alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) mit einer Mehrkanalpipette.Führen Sie diese in einem zweistufigen Weise: zunächst 150 ul entfernen, ohne die Platte kippen, und entfernen Sie dann verbleibenden Medien (~ 50 & mgr; l) durch die Platte Kippen und die Pipettenspitze an den unteren Rand des Bohrlochs eingesetzt wird. Als Mtb / Makrophagen - Aggregate an der Unterseite des Schachts adhärenten sind, sollten kein Material verloren.
- Fügen Sie vorsichtig 100 ul 7H9-C Medien auf alle relevanten Brunnen (B2 durch G11) der Platte die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthält.
- Verwendung einer Mehrkanalpipette, dann 100 & mgr; l aus der Arzneimittel enthaltenden 96-Well-Platte (Schritt 4.1) in die entsprechenden Vertiefungen der Platte Infektion.
- Platz in versiegelten Beutel und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C.
5. Quantifizierung der Wirksamkeit von Medikamenten den Assay Resazurin Mikrotitter Verwendung
- Bereiten Resazurin Stammlösung in einer Endkonzentration von 0,8 mg / ml in H 2 O. Man filtriert durch 0,22 um Porengrße PVDF - Membran für Sterilisierung.
- Bereiten Resazurin - Lösung von Resazurin Arbeitsstammlösung Mischen, H 2 O und Tween-80 (20% ige Lösung in H 2 O) in einem 2: 1: 1 - Verhältnis. Endkonzentrationen 0,4 mg / ml Resazurin und 5% Tween-80.
- Unter Verwendung eines Plattenlesegerät, ein Setup-Programm, um die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission alle 30 min für 24 h bei 37 ° C gelesen. Vorwärmen Plattenleser auf 37 ° C.
- Fügen Sie 20 & mgr; l Resazurin Arbeitslösung zu allen relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der arzneimittelbehandelten Platte (Schritt 4.11) eine Mehrkanal-Pipette.
- Legen Sie die Platte auf dem Plattenleser und starten Sie das Programm einrichten in Schritt 5.3.
ANMERKUNG: Um die Verarbeitung von großen Mengen von Assayplatten zu erleichtern, ist es ausreichend, den Test in einem 37 ° C Inkubator zu entwickeln und auszuführen einzelne Fluoreszenz all 24 h liest. Dies gilt auch für Benutzer, den Zugriff auf einen Plattenleser nicht mit kinetischen und Inkubation Fähigkeiten haben.
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Representative Results
Um die Robustheit der Anpassung dieser Infektionsmodell auf 96-Well - Plattenformat bestätigen, untersuchten wir hier die Wirkstoffansprechverhaltens von Mtb abgeleitet aus unserer 96-Well angepasst Infektionsmodell Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) nach der Vorlage in Abbildung 1A. Wir zeigen , dass die Erzeugung von Mtb / Makrophagen Aggregatstrukturen Schlüssel zu diesem Assay kann zuverlässig in einer 96-Well - Plattenformat (Figur 2), wodurch der Durchsatz Kompatibilität (1B) ermöglicht , hergestellt werden. Makrophagen- agiert Mtb auf diese Weise erzeugt wird, kann direkt für die Arzneimittelwirksamkeitstests verwendet werden , unter Verwendung des gut charakterisierten Resazurin Mikrotiter - Assay (Abbildung 3).
Da der Resazurin - Assay beruht auf den oxidativen Spezies von metabolisch aktiven Mtb produziert das blaue Resazurin zur fluor zu konvertierenrosa zier Resorufin, die Änderung in der Farbe und Fluoreszenz kann als Ersatzmarker verwendet werden, um die Menge des Bakterienwachstums zu bestimmen. In 3A zeigen wir , dass es genügend Empfindlichkeit innerhalb des Resazurin - Tests ist tragfähige Mtb Bakterien in Abwesenheit von Arzneimitteln replizierender bereits nach 3 Tagen Inkubation der Lage, zuverlässig zu detektieren. Während eine visuelle Bestätigung des Endpunkts Farbänderung nur eine annähernde Bewertung des Wachstums ist, können wir dies genau quantifizieren , durch kinetisch die Umwandlung von Resazurin in seine fluoreszierende Metabolit Messen eines Plattenlesegerät (3B) Resorufin werden. Mit Hilfe dieser Daten an die positiven Wachstumskontrolle (ohne Medikamente) Normalisierung ermöglicht die Berechnung der Anfälligkeit zu töten Kurven Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen-agierten Mtb (Abbildung 4) sichtbar zu machen.
Hierbei ist die repräsentativen Ergebnisse in den 3 4 zeigen , daß die minimale Hemmkonzentration (MIC), die niedrigste Konzentration des Antibiotikums definiert , bei der 90% Wachstumshemmung beobachtet wird , größer als 2 & mgr; g / ml für beide Rifampicin und Moxifloxacin gegen Mtb aus unserem Infektionsmodell abgeleitet ist. Dies zeigt , dass unsere Infektionsmodell Wirksamkeit von Anti - Mtb Medikamente vorhersagt , die mehr im Einklang mit den MHK - Werten bestimmt gegen intrazelluläre Mtb 8, und somit spiegelt die Diffusionsbarriereeigenschaften , die in den meisten Mtb Sensibilitätstests unter Verwendung von Brühe gezüchtet Bakterienzellen vernachlässigt werden.
Wichtig ist , dass die erhaltenen Daten den beschriebenen Assay in 96-Well - Format unter Verwendung zeigten sehr vergleichbare Ergebnisse zu denen , die wir früher für Rifampicin und Moxifloxacin gegen Makrophagen- passagierten Mtb 16 bestimmt war.
Abbildung 1: Drug Plattenlayout. (A) Beispiel Vorlage der Platte Arzneimittel Herausforderung in Schritt 4. Dies ermöglicht die parallele Untersuchung von zwei Arzneimitteln in jeweils drei Wells bei 8 definierten Konzentrationen. Als ein repräsentatives Experiment verwendeten wir Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) bei 2 & mgr; M und 2,5 & mgr; M ausgehend, respectively. (B) Eine alternative Vorlage für throughput screening wird auch bei einer einzigen Konzentration , die Möglichkeit des Testens von 58 Verbindungen zu zeigen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen in 96-Well - PlatteFormat. (A) Repräsentative Hellfeld und GFP fusionierten Bilder von Mtb -macrophage Aggregaten an Tag 9 nach der Infektion. Die Bilder wurden mit einem 4X Ziel unter Verwendung eines automatisierten Cell-Imaging-Programm erfasst, die durch Nähen eine Montage von 3 x 3 einzeln aufgenommenen Bilder die gesamte gut dokumentiert. (B) ein einzelne nicht-genähte Bild aus dem Gesichtsfeld in (A) gezeigt. (C) ein Vertreter fusionierte Hellfeld- und GFP Bild eines Mtb / Makrophagen - Aggregat - Struktur mit einem 10X - Objektiv eingefangen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Unter Verwendung der Resazurin Mikrotitertest Mtb Lebensfähigkeit zu messen. (A) Die Anwesenheit von viable Mtb Zellen können einfach durch die Umwandlung des blauen Resazurin Farbstoff auf seine rosa, reduzierte Form bestimmt werden. Repräsentative Ergebnisse sind hier gezeigten Rifampicin (RIF) und unter Verwendung von Moxifloxacin (Moxi) entsprechend der Schablone in 1A. (B) Zur Messung der quantitativen Bestimmung der Umwandlung von Resazurin, Fluoreszenz von einzelnen Vertiefungen (entsprechend auf 3A) wurde 24 h kinetisch kontrolliert , wie in Schritt 5. Repräsentative Mini-Diagramme zeigen relative Fluoreszenzeinheiten (y-Achse) gegen die Zeit beschrieben (x -Achse). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Wirkstoffansprechverhaltens Bestimmung Kurven von REMA Daten zu töten. Relative Fluoreszenzeinheiten zum Zeitpunkt der maximalen resazurin Signal in (A) und Rifampicin (B) Moxifloxacin behandelten Vertiefungen (von 3B) wurden normalisiert auf die kein Medikament Steuerung (maximale Wachstums Mtb) als 100% Überleben. Hintergrund Steuerung (Blank) Signale wurden von jeder Probe gut abgezogen. Die prozentuale Überleben wurde für jede einzelne Konzentration der medikamentösen Behandlung aufgetragen, um eine Tötung Kurve zu erzeugen. Daten in dieser Figur repräsentieren die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb - Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt haben , und schlug vor , der Skalierung , die Infektion für den Durchsatz Kompatibilität 16, hier oben die Möglichkeit , zeigen wir , dass diese direkt in durch die Anpassung des Systems tatsächlich erreichbar ist 96-Well - Plattenformat. Die Fähigkeit , Mtb / Makrophagen zu erzeugen Aggregate direkt in 96-Well - Platten ist von Vorteil , da es die Anforderung zu Pipette entfernt , und die Aggregate aus einem großen Kulturkolben in einzelne Wells, die schwierig ist inhärent verteilt , da die Grßen der Aggregate Größen erreichen> 500 & mgr; m. Die Größe der infizierten Makrophagen-Aggregate würde die Verwendung von P200 Mehrkanalpipetten zu verhindern, die für Durchsatz-Tests notwendig sind, wie wäre es entweder die Spitzen oder umfangreiche Pipettieren verstopfen würden die Aggregate auseinander brechen. Die Modifikation dieser Infektion System auf 96-Well - Platten reduziert die Menge der Manipulationsschritte benötigt und erzeugt gleichförmige Vertiefungen mit ähnlichen Mengen von Mtb / Makrophagen - Aggregate. Als solches ist dieses Testsystem besonders wertvoll nicht nur in den frühen Entwicklungsprozess die Wirksamkeit von Blei Kandidatenverbindungen in vivo, aber in dem Durchsatzscreening von Medikamentenbibliotheken vorherzusagen.
Ein wesentlicher Vorteil des Modells beschrieben Infektion ist die Verwendung eines BSL-2 - kompatible Mtb - Stamm. Die Fähigkeit, unter BSL-2 Bedingungen zu arbeiten, ist sehr kostengünstig, beschleunigt Manipulation des Protokolls und vor allem ermöglicht es Labors, die den Zugang zu einem BSL-3-Anlage müssen die nicht durchführense erweiterte Suchtests Droge. Das verwendete auxotrophen Mtb mc 2 6206 - Stamm ist ein Derivat von H37Rv 17, 18 , die alle aber 4 Gene, panCD und leuCD behält, die Arzneimittel - Resistenz oder Toleranz nicht 16 beeinflussen. Im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Mtb Surrogate wie M. bovis BCG und M. smegmatis, mc 2 6206 Mtb ist am engsten mit Mtb H37Rv virulenten Referenzstamm für die Pathogenese Studien. Wichtig ist , hält sie den RD-1 - Locus, die aus BCG fehlt und spielt eine wichtige Rolle in Virulenz und Mtb Granulombildung 19. Vergleichsweise ist Mtb mc 2 6206 auch relevant für TB-Medikamentenentwicklung Assays als M. smegmatis, die eine schnell wachsende Arten, die aus Mtb genomisch ist anders und hat andere Antibiotika - Resistenzprofile.
Der Test hier beschrieben ist auch wertvoll aufgrund ihrer hohen Flexibilität. Die 96-Well - Platten , die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthalten , können für die Titration von medikamentöser Behandlung in Triplikaten nicht nur verwendet werden , wie wir (Abbildung 3), sondern auch für das Screening von gesamte Medikamentenbibliotheken (1B) gezeigt haben. Bei einer einzigen Konzentration, die jeweils 96-Well-Platte 58 Verbindungen können Bildschirm. Diese Zahl würde sich drastisch auf> 300 Verbindungen, wenn die Infektion System auf eine 384-Well-Platte ausgelegt ist, die auf der Basis, dass die Tatsache, vollständig durchführbar ist, dass wir starke Resazurin Signale nach nur Lassen der Bakterien für 3 Tage zu replizieren erhalten. In der Tat wäre es relativ einfach sein, dieses System auf 384-Well-Platte-Format anzupassen, wie auch andere als Down Skalieren der Volumina proportional die kleineren Well-Format zu entsprechen, die Mehrheit des Protokolls würde unverändert bleiben. Damit ausreichendes Signal für die Resazurin-Assay, kann es sein,erforderlich, um die Inkubation in Schritt 4.2.5 bis 7 Tage zu verlängern genügend bakterielle Replikation zu ermöglichen.
Während Kopplung dieser Infektionsmodell mit dem Resazurin - Assay als Auslese für Mtb Lebensfähigkeit hat viele Vorteile, nämlich seine Kosteneffizienz und schnelle Assay - Protokoll während vergleichbare Ergebnisse zu anderen Goldstandard -Computersysteme wie BACTEC 460 20 zu erhalten, hat es dennoch einige Einschränkungen . Der Resazurin Test kann nicht zwischen bakteriostatische und bakterizide Drogen unterscheiden, da sie nur die metabolische Aktivität misst. Dies ist eine wichtige Einschränkung im Auge zu behalten, wie die metabolische Aktivität von Natur aus niedrig in latent Mtb ist. Allerdings ist die Schlüsselkomponente dieser Test die Infektion Modell, das mit Auslesungen für Mtb Wirkstoffansprechverhaltens andere als die Resazurin - Assay kompatibel sein kann. Beispielsweise nach medikamentöse Behandlung, Brunnen direkt ausplattiert zur Koloniebildung Einheit (CFU) Zählen werden könnte, das Gold standard bakterizide Aktivität von Verbindungen zu testen (obwohl dies mit Throughput-Screening nicht kompatibel ist). Alternativ könnte dieses System gekoppelt werden exprimierenden Mtb Luciferase, die 21 eng an CFU Zählen korreliert wurde. Um ein Luciferase - System nutzen Wirkstoffansprechverhaltens zu messen, nur zwei Änderungen des Protokolls wäre erforderlich: i) Austausch von Mtb -GFP mit Mtb -luciferase und ii) die Verwendung von Bright-Glo Luciferin - Reagenz anstelle von Resazurin in Schritt 5. die Verwendung von Luciferase exprimierenden Mtb würde die Entwicklung des Assays auf 30 min verkürzt werden, während erheblich die Testempfindlichkeit auf ein Niveau erhöht wird, die mit 384-Well - Platte - Format leicht kompatibel wäre.
Zusammengefasst haben wir erfolgreich dieses Infektionsmodell in eine 96-Well-Plattenformat umgestellt, die relativ wenige Manipulationsschritte, hohe Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit, endlose Mengen von Ausgangs zu produzierenMaterial, alle wichtigen Faktoren in Durchsatz Kompatibilität. Dieser Test ist auch leicht anpassbar an viele verschiedene Formate und Auslesen, es ist eine wertvolle Bereicherung für den frühen Mtb Drug Discovery - Prozess zu machen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
