Introduction
שחפת (TB) נותרה איום בריאותי הגלובלי רציני למרות הזמינות של כימותרפיה נגד שחפת במשך 40 שנה 1. זה נובע בחלקו לדרישת תקופות טיפול ארוך של למעלה מ -6 חודשים באמצעות שילובי תרופות מרובות, אשר מוביל לחולה אי קיום 2. הופעה של TB עמיד לתרופות בשנים האחרונות חריף עוד יותר בעיות בתחום שבו פיתוח מוצלח של תרופות קליניות שאושרה הנו כמעט אפסי 3. ואכן, למרות בפיתוח תרופות נגד שחפת ממצה, רק תרופה אחת כבר FDA אישר לשימוש קליני ב -40 השנים האחרונות 4. לפיכך, דורות חדשים של תרופות אנטי-TB יש צורך דחוף כדי לטפל בבעיה זו.
בעיית מפתח לגילוי סמי TB היא חוסר העברה מוצלחת תרכובות עם פעילות במבחנה יעילה במסגרת הקלינית= "Xref"> 5, 6, 7. בתחילה, גישות ה ביעדים שימשו למסך אנטי סמים חיידק השחפת 5, אשר לא הצליחו לתרגם בתאים שלמים של חיידקים. גם כאשר תאי חיידק השחפת משמשים, זה בד"כ מבוצע באמצעות תרבויות גדלו מרק, אשר לא לחזות במדויק יעילות תרופת in vivo 8, 9. בעיות אלה הוכרו מבחני מיון תרופה נגד מקרופאגים המכילים חיידקי שחפת או סמוי חיידק שחפת הוקמו 8 בהצלחה, 10, 11, 12. עם זאת, גם אלה מבחנים מתקדמים יותר לא נותנים תמורה מספקת לחסמים החדירים שתרופות נתקלות הנגעים ריאתי הלא vascularized, ובסופו של המוקדים נמקי באתר של זיהום. אכן, אפילו עבור ריפמפיצין התרופה הראשונה אונליין TB, מינון תת אופטימלית נחקר בשל לקוי ברקמות vivo ובנוזל השדרה מוחין (CSF) חדירה 13, 14, 15 וכן ירד היעילות נגד תאיים 8 MTB, 9. ככזה, מודלי מבחנים חדשים שייקחו בחשבון פרמטרים אלה במהלך תהליך פיתוח מוקדם להוביל היה ללא ספק לשפר את המאמצים לגילוי סמי TB.
כדי לתת מענה לצורך זה, הקמנו לאחרונה מודל זיהום זול, מהיר, BSL-2 תואם חלופי בדיקות יעילות תרופת חיידקי שחפת 16. מודל זיהום זה מיוצר ארוז חיידק שחפת בצפיפות בתוך מבנים המצרפי מקרופאג גדולים, אשר סכם את המחסומים חדירי הסלולר רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שנוצר-passaged מקרופאג
כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של חיידק השחפת / מבנים המצרפי מקרופאג לייצר-passaged מקרופאג חיידק השחפת מתאים בדיקות רגישות סמים באמצעות הרמ"א. בפרט, אנו מראים כיצד מערכת זיהום זה יכול להיות מותאם בפורמט 96-גם עבור תאימות עם התפוקה ההקרנה של תרופות נוגדות-TB מועמד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כפי שחפת mc 2 6206 הוא זן לֹא אַלִים 17, 18, כל העבודה בפרוטוקול זה יכול להתבצע במתקן 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL-2).
1. תנאי תרבות עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק הבעת שחפת mc 2 6206 (חיידקי השחפת -GFP)
הערה: M. שחפת H37Rv נגזר auxotroph זן mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) הפך עם GFP להביע פלסמיד pMN437 משמש ברחבי פרוטוקול זה 16. אפשר להחליף את זן חיידקי השחפת -GFP עם GFP שאינו מביע זן פראי סוג כדי לאפשר נגישות קלה יותר של הזן לחוקרים. עם זאת, הביטוי GFP רצוי לאפשר אישור ויזואלי של phagocytosis היווצרות של אגרגטים MTB / מקרופאג. עבור לוןאחסון לטווח גרם, MTB -GFP הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס 7H9 מדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.1) בתוספת 20% גליצרול.
- הכן התקשורת חיידק השחפת -GFP מלאה (7H9-C) על ידי השלמת 7H9 בינוני עם 10% מידלברוק OADC, 0.02% tyloxapol, 24 מיקרוגרם / מ"ל D-חומצה פנטותנית, 50 מיקרוגרם / מ"ל L-לאוצין ו -50 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B.
- להפשיר בקבוקון אחד של חיידק השחפת -GFP ולהוסיף 10 מ"ל של 7H9-C בבקבוק PETG תחתית מלבנית 30 מ"ל.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס על שייקר רוטרי (50 סל"ד). קח מדידות צפיפות אופטית (OD 600) כל כמה ימים עד OD 600 מגיע 1.0 (כ 5-8 ימים).
- לדלל ותרבות מעבר לפי הצורך כדי לשמור על OD 600 בין 0.2-1.0.
- עבור זיהום, להשתמש תרבות הוקמה של חיידק השחפת -GFP במסגרת שלב צמיחת הלוגריתמים (OD 600 של 0.6-1). כדי למנוע תרבויות clumpy, sonicate את הבקבוק תרבות חיידקי השחפת באמבט מים (130 ואט; 3 x פולסים של 5) oncדואר או פעמיים בשבוע
2. תנאי התרבות THP-1 תאים
- הכן התקשורת תא THP-1 המלא (RPMI-C) על ידי משלים RPMI 1640 בינוני עם 10% בסרום שור העובר חום מומת, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו -10 מ"מ HEPES.
- דגירה התאים בבקבוק T-75 על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer או cytometry זרימה בכל יום אחר ולשמור תאים THP-1 בצפיפות בין 0.1 כדי 0.6 מיליון דולר מ"ל.
3. פרוטוקול זיהום כדי לייצר מבני צבירת MTB / Macrophage
- THP-1 הכנת תא (לכל צלחת 96-היטב)
- צנטריפוגה 7 x 10 6 THP-1 תאים ב 250 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 7 מ"ל RPMI-C.
- הכנה חיידק השחפת -GFP
- צנטריפוגה 2.8 x 10 8 חיידק השחפת -GFP ב 3,200 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה מתנדנד דלי uלשיר המרה של OD 600 1.0 = 3 x 10 8 חיידקים / מ"ל.
- שטפי פעם עם כמו RPMI-C ו צנטריפוגות בשלב 3.2.1.
- גלולה ב 7 מ"ל RPMI-C ו מערבולת למשך 10 s.
- הַדבָּקָה
הערה: ראה איור 1 עבור תבנית.- כן צלחת 96-היטב על ידי הוספת 200 μL של מים סטריליים בשורות A ו- H ועמודות 1 ו 12 עבור שפת מים כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות.
- הוספת 200 μL RPMI-C לעמודה 2 (B2 כדי G2) לפיקוח רקע (Blank).
- כדי להדביק, להוסיף ההשעיה חיידקי השחפת -GFP (שלב 3.2) כדי ההשעיה תא THP-1 (שלב 3.1) ומערבבים היטב על ידי pipetting. צפיפות התאים THP-1 הסופית היא 5 x 10 5 לכל מיליליטר והריבוי המקביל של זיהום הוא 40.
- יוצקים את ההשעיה THP-1 / חיידקי השחפת -GFP למאגר 25 מ"ל.
- הוספת 200 μL של THP-1 / חיידקי השחפת -GFP השעיה לכל 96-הבארות הנותרות (B3 דרך G11) usinפיפטה רב ערוצי ga.
הערה: אם עובד עם 96-גם צלחות מרובות, באופן קבוע resuspend השעית THP-1 / חיידק השחפת שנותרה המאגר כדי להבטיח אפילו תערובת מתווספת כל טוב. - לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7-10 ימים.
- שינוי תקשורת כל 2 ימים על ידי הסרת 100 לאט μL בילה תקשורת מהחלק העליון של כל טוב והוספה בעדינות 100 μL מראש חממו RPMI-C באמצעות pipet רב ערוצית. אל resuspend בארות ומפריעים המצרפים MTB / מקרופאג על החלק התחתון של הבארות.
- מבחינה ויזואלית לבחון את הבארות ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 4-10X) יומי, ובשים לב לגודל של אגרגטים MTB / מקרופאג. במשך היום 7-10, אגרגטים MTB / מקרופאג צריכים להיות גדולים מספיק (ראה איור 2 לעיון) כדי להמשיך לבדיקה יעילה תרופה (סעיף 4).
- אם תרצה, ללכוד תמונות של 96-בארות באמצעות מערכת הדמית תא אוטומטית מצוידותעם מסנן שדה GFP בהיר קובע לתעד היווצרות המצרפי MTB / מקרופאג.
הערה: אם אין למשתמשים גישה למערכת הדמיה אוטומטיות, תמונות של בארות נציג ניתן לקחת באמצעות כל מיקרוסקופ מתאים עם GFP ושדה בהיר יכולות.
4. צמיחה Assay עיכוב כדי להעריך את חיידקי השחפת נגד יעילות התרופה נגזר MTB / אגרגטים Macrophage
- הכנה ותרופות (תנאים בשלושה עותקים עבור שתי תרופות)
הערה: ראה איור 1A עבור תבנית.- צלחת 96-היטב נפרדת, להוסיף 125 μL של תקשורת 7H9-C כדי B2 עד G10.
- הכן שתי תרופות במחיר כפולה לריכוז הסופי הרצוי הגבוה ביותר 1 מיליליטר של 7H9-C לתת דין וחשבון על הדילול בשלב 4.2.4.
- הוסף 250 μL של כל תרופה לבארות B11-C11-D11 ו- E11-F11-G11, בהתאמה עבור טיפולים בשלושה עותקים.
- שימוש pipet הרב ערוצית, סדרתי dilיוטה תרופות המבחן כפול על ידי העברת 125 μL מ B11-G11 לתוך B10-G10. מערבבים על ידי pipetting 5 פעמים בכל שלב.
- המשך כדי לעבור 125 μL מעמודה לעמודה (מימין לשמאל) על פני הצלחת, ולהפסיק אחרי טור 4.
- לאחר ערבוב בעמודה 4, להשליך 125 μL לתוך מיכל פסולת. עמודות 2 ו -3 לא יכילו כל תרופות כדי לאפשר שימוש כרקע (בלנק) ובקרות צמיחה חיובית.
הערה: לחילופין, בצע תבנית באיור 1B לספריות בדיקות סמים. כל צלחת 96-גם יכולה להכיל 58 תרופות בריכוז יחיד. כן זה צלחת סמים באמצעות כפול לריכוז הסופי הרצוי שכן הוא יהיה מדולל וחצי בשלב 4.2.4.
- טיפול תרופתי:
- אחזר את צלחת 96-היטב המכיל את חיידקי השחפת -infected מקרופאגים (אגרגטים MTB / מקרופאג).
- בזהירות למזוג את כל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) עם pipet רב ערוצית.בצע זאת באופן דו-שלבי: ראשית להסיר 150 μL ללא הטיית הצלחת, ולאחר מכן להסיר התקשורת הנותרים (~ 50 μL) על ידי הטיית הצלחת החדרת קצה פיפטה לקצה התחתון של הבאר. כפי MTB / אגרגטים מקרופאג הם חסיד אל תחתית הבאר, לא חומר צריך ללכת לאיבוד.
- בעדינות להוסיף 100 μL של תקשורת 7H9-C לכל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) של הצלחת המכילה אגרגטים MTB / מקרופאג.
- שימוש pipet רב ערוצית, להעביר 100 μL מהתרופה המכיל צלחת 96-היטב (שלב 4.1) על הבארות המקבילות של הצלחת הזיהום.
- מקום בשקית אטומה דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
5. כימות של יעילות התרופה באמצעות assay Resazurin microtiter טוב
- הכן resazurin פתרון המניות בריכוז סופי של 0.8 מ"ג / מ"ל ב H 2 O. סינון דרך קרום PVDF גודל 0.22 מיקרומטר הנקבוביות לעיקור.
- כן resazurin עובד פתרון על ידי ערבוב פתרון מניות resazurin, H 2 O ו Tween-80 (פתרון 20% ב O H 2) בתוך 2: יחס 1: 1. ריכוזים גמר הן 0.4 מ"ג / מ"ל resazurin ו 5% Tween-80.
- באמצעות קורא צלחת, התקנת תכנית לקרוא קרינת עירור 530 ננומטר ו 590 ננומטר פליטה כל 30 דקות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. קורא צלחת טרום חם 37 ° C.
- להוסיף 20 μL של פתרון עובד resazurin לכל בארות רלוונטי (B2 דרך G11) של הצלחת טיפול תרופתי (שלב 4.11) באמצעות pipet הרב ערוצית.
- מניחים צלחת על צלחת הקורא ולהפעיל את התוכנית להקים בשלב 5.3.
הערה: כדי להקל על העיבוד של כמויות גדולות של צלחות assay, זה מספיק כדי לפתח את assay C חממת 37 ° ולבצע קרינה יחידה קוראה לכל 24 h. זה חל גם על משתמשים שאין להם גישה קוראת צלחת עם יכולות הקינטית דגירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאשר את חוסנו של התאמת המודל זיהום זה 96-גם בפורמט צלחת, אנחנו כאן בחנו את הרגישות לתרופה של חיידק השחפת נגזר 96-היטב שלנו מותאם מודל הזיהום ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) בהתאם לתבנית ניתנת באיור 1A. אנו מראים כי הדור של חיידק שחפת / מקרופאג המצרפי מבני מפתח assay זה יכול להיות מיוצר באופן מהימן במתכונת צלחת 96-היטב (איור 2), ובכך שהיא מאפשרת תאימות תפוקה (איור 1B). מקרופאג passaged חיידק השחפת מיוצר באופן זה ניתן להשתמש ישירות לבדיקה יעילה תרופה באמצעות assay microtiter resazurin המאופיין היטב (איור 3).
כמו assay resazurin מסתמך על מיני חמצונים המיוצרים על ידי חיידק שחפת פעילה מבחינה מטבולית להמיר את resazurin הכחול אל פלואורידescent ורוד resorufin, השינוי בצבע פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי כסמן פונדקאי כדי לקבוע את סכום התפתחות חיידקים. באיור 3 א, אנו מראים כי יש מספיק רגישות בתוך assay resazurin כדי מהימן לזהות חיידקי חיידקי שחפת קיימא יכולת שכפול בהעדר תרופות רק לאחר 3 ימים של דגירה. בעוד אישור חזותי של שינוי הצבע הסופי הוא רק להערכה גסה של צמיחה, אנו יכולים לכמת את זה במדויק על ידי מדידת ההמרה של resazurin kinetically כדי המטבוליט פלורסצנטי resorufin באמצעות קורא צלחת (איור 3B). בעזרת נתונים אלה, נרמול לשליטת הצמיחה החיובית (בהעדר תרופות) מאפשר לחישוב קימורי הרג רגישות לדמיין יעילות תרופה נגד-passaged מקרופאג חיידק השחפת (איור 4).
הנה, את תוצאות נציגי איורים 3 > ו -4 מראים כי ריכוז המעכבות המינימאלי (MIC), מוגדר הריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה שבה 90% עיכוב צמיחה הוא ציין, הוא יותר מ -2 מיקרוגרם / מיליליטר הוא ריפמפיצין ו moxifloxacin נגד חיידק השחפת נגזרה ממודל הזיהום שלנו. מכך ניתן להסיק כי מודל הזיהום שלנו חוזה יעילות של אנטי סמי חיידק השחפת, כי הם יותר בקו אחד עם ערכי MIC נקבעו נגד תאיים חיידק שחפת 8, ובכך משקף את המאפיינים של מכשול דיפוזיה כי מוזנח מבחני רגישות לתרופה ביותר חיידק השחפת באמצעות תאי חיידקיים גדלו מרק.
חשוב לציין כי הנתונים המתקבלים באמצעות assay תאר בפורמט 96-גם הראו תוצאות דומות מאוד לאלו שאנו קבענו בעבר עבור ריפמפיצין ו moxifloxacin נגד-passaged מקרופאג חיידק שחפת 16.
.within-page = "1"> 
איור 1: פריסת צלחת ותרופות. (א) תבנית דוגמא של צלחת התרופה אתגר בשימוש בשלב 4. זה מאפשר בדיקה המקבילה של שתי תרופות בבארות בשלושה עותקים 8 ריכוזים מוגדרים. כניסוי נציג, השתמשנו ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) החל מהשעה 2 מיקרומטר ו -2.5 מיקרומטר, בהתאמה. (ב) תבנית חלופית לסינון תפוקה מסופקת גם להראות את האפשרות של בדיקות של 58 תרכובות בריכוז יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדור של חיידק השחפת / מבנים המצרפי מקרופאג בצלחת 96-היטבפוּרמָט. (א) שדה בהיר נציג ו- GFP התמזגו תמונות של אגרגטים חיידקי השחפת -macrophage על זיהום שלאחר יום 9. תמונות נתפסו עם מטרת 4X באמצעות תכנית הדמית תא אוטומטית מתעד הבאר כולו על ידי תפרי מונטאז 'של 3 על 3 תמונות בנפרד בשבי. (ב) תמונה הלא תפור בודד מתוך שדה הראייה שמוצג (א). (ג) נציג התמזג תמונה בשדה ו- GFP הבהירה של מבנה המצרפי MTB / מקרופאג שנתפס עם מטרת 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: שימוש assay microtiter resazurin למדוד כדאי חיידק שחפת. (א) נוכחות של viablתאי דואר חיידק השחפת ניתן לקבוע בפשטות על ידי המרה של צבע resazurin כחול ורוד שלה, הצורה המצומצמת. תוצאות נציג מוצגים כאן על ידי שימוש ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) בהתאם לתבנית באיור 1A. (ב) כדי למדוד את ההמרה כמותית של resazurin, קרינה של בארות בודדות (המקביל ל איור 3 א) היה פיקוח kinetically עבור 24 שעות כפי שמתוארות בשלב 5. להראות יחידות קרינה יחסיות נציג גרפים מיניים (ציר y) לעומת זמן (x -צִיר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: קביעת רגישות התרופה להרוג עקומות מנתונים הרמ"א. יחידות קרינה יחסיות בעת resaz המקסימליUrin אות ב (א) ריפמפיצין ו- (ב) בארות מטופלים moxifloxacin (מ איור 3B) היו מנורמל אין שליטה התרופה (צמיחה מקסימלית חיידקי השחפת) 100% הישרדות. שליטת רקע (בלנק) אותות נגרעו מכל מדגם היטב. הישרדות האחוזים הייתה להתוות עבור כל ריכוז בודד של טיפול תרופתי כדי ליצור עקומת הרג. נתונים בנתון זה מייצגים את האמצעים ± סטיית תקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, יש לנו תיאר בפרוטרוט מודל חלופי בחיידק השחפת זיהום מתאים בדיקות יעילות התרופה. מודל זה לוקח בחשבון שני גורמים מרכזיים שיש לתת את דעת יותר במהלך תהליך פיתוח תרופות TB מוקדם: הנוכחות של מחסומים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית לחדירה בסמי שינויים מטבוליים של חיידק השחפת במהלך הדבקה. למרות שאנו בעבר הראינו את היתרונות של מודל הזיהום שלנו והצענו את האפשרות של דרוג את הזיהום עבור תאימות תפוקה 16, כאן אנו מראים כי זהו אכן ברי השגה על ידי התאמת המערכת ישירות לפורמט צלחת 96-היטב. היכולת ליצור MTB / מקרופאג אגרגטים ישירות צלחות 96-היטב יש יתרון כפי שהוא מסיר את דרישת פיפטה ולהפיץ המצרפים מבקבוקון תרבות גדול לתוך בארות בודדות, וזה קשה מטבעו כמו בגדלים של אגרגטים יכולים להגיע בגדלים> 500 מיקרומטר. גודלו של אגרגטים מקרופאג הנגועים ימנע את השימוש טפטפות רב ערוצית P200 הדרושים מבחני תפוקה כפי שהוא היה גם לסתום את העצות או pipetting הנרחב היה להתפרק המצרפים. השינוי של מערכת זיהום זה צלחות 96-היטב מפחית את כמות צעדי מניפולציה הצורכת ומייצר בארות אחידות עם כמויות דומות של אגרגטים MTB / מקרופאג. ככזה, מערכת assay זה היא בעל ערך במיוחד לא רק בתהליך ההתפתחות המוקדם לחזות את היעילות של תרכובות מועמד מובילות in vivo, אבל תפוקת ההקרנה של ספריות תרופה.
אחד יתרונות עיקריים של מודל הזיהום תאר הוא הניצול של זן BSL-2 חיידקי שחפת תואם. היכולת לעבוד בתנאי BSL-2 היא מאוד חסכונית, מאיצה מניפולציה של הפרוטוקול, והכי חשוב מאפשרת מעבדות שאין להם גישה למתקן BSL-3 כדי לבצע אתse מתקדם מבחני הקרנת סמים. זן auxotrophic מנוצל חיידק השחפת mc 2 6206 הוא נגזרת של H37Rv 17, 18 אשר שומרים את כל אבל 4 גנים, panCD ו leuCD, אשר אינם משפיעים עמידות לתרופות או סובלנות 16. לעומת פונדקאיות חיידק שחפת אחרות נפוצות כגון M. בוביס BCG ומ 'smegmatis, MTB mc 2 6206 הם הכי קשור קשר ההדוק ארסי חיידק השחפת H37Rv, זן ההתייחסות ללימודים בפתוגנזה. חשוב לציין, היא שומרת את הלוקוס RD-1, אשר נעדרו מן BCG ומשחק תפקיד מרכזי במערך ארסי ו גרנולומה חיידק שחפת 19. יחסית, MTB mc 2 6206 הוא גם רלוונטי יותר עבור מבחני התפתחות TB-תרופה מאשר מ smegmatis, שהנה מינים המתאפיינים בצמיחה מהירה, שונה genomically מן חיידק שחפת ויש לו פרופילים עמידים לאנטיביוטיקה שונות.
Assay המתואר כאן הוא גם בעל ערך בשל רמה גבוהה של גמישות. צלחות 96-היטב המכילות אגרגטים MTB / מקרופאג יכולות לשמש לא רק עבור טיטרציה של טיפולים תרופתיים ב triplicates כפי שהראינו (איור 3), אבל גם להקרנה של ספריות תרופה כולה (איור 1B). בריכוז אחד, כל צלחת 96-גם יכול להקרין 58 תרכובות. מספר זה דרסטי יגדיל כדי> 300 תרכובות אם מערכת הזיהום מותאמת צלחת 384 גם, אשר אינה ריאלית לחלוטין המבוססים על שהעובדה נקבל אותות resazurin חזקים אחרי המאפשר רק את החיידקים לשכפל במשך 3 ימים. למעשה, זה יהיה פשוט יחסית להתאים מערכת זו לפורמט צלחת 384 גם, כמו אחרים מאשר למטה-קנה מידה של הכרכים יחסיים כדי להתאים את הפורמט גם הקטן, רוב הפרוטוקול יישאר ללא שינוי. כדי לאפשר קליטה מתאימה עבור assay resazurin, זה יכול להיותהנדרשת לצורך העמדת הדגירה בשלב 4.2.5 ל -7 ימים כדי לאפשר שכפול חיידקים מספיק.
בעוד צימוד מודל זיהום זה אל assay resazurin בתור מחוץ לקרוא הכדאיות חיידקי השחפת יש יתרונות רבים, כלומר עלות תועלת שלה פרוטוקול assay מהירה תוך קבלת תוצאות דומות למערכות תקן הזהב אחרים כגון BACTEC 460 20, בכל זאת יש כמה מגבלות . את assay resazurin אינו מסוגל להבחין בין תרופות בקטריו ובקטרצידית שכן הוא רק מודד את פעילות חילוף חומרים. זהו אילוץ חשוב לזכור, כמו הפעילות המטבולית הוא נמוך מטבעו ב סמויה חיידק השחפת. עם זאת, הרכיב העיקרי של assay זה הוא מודל הזיהום, אשר יכול להיות תואם-outs לקרוא רגישות לתרופה בחיידק שחפת מלבד assay resazurin. לדוגמא, לאחר טיפול תרופתי, בארות יכולות להיות מצופות ישירות לספירת היווצרות יחידת מושבה (CFU), סטן הזהבdard לבחון פעילות bactericidal של תרכובות (אם כי זו אינה עולה בקנה אחד עם הקרנת תפוקה). לחלופין, מערכת זו יכולה להיות מצמידה את בלוציפראז להביע את חיידקי שחפת, אשר הוכח לתאם דוק CFU לספור 21. כדי לנצל מערכת בלוציפראז למדוד רגישויות סמים, רק שני שינויים בפרוטוקול יידרשו: i) החלפה של חיידק השחפת -GFP עם חיידקי שחפת -luciferase ו- II) את השימוש הגיב luciferin ברייט-Glo במקום resazurin בשלב 5. השימוש בלוציפראז להביע את חיידקי השחפת יקצרו את הפיתוח של assay 30 דקות תוך ניכרת הגדלת הרגישות assay לרמות זה יהיה תואם בקלות עם פורמט צלחת 384 גם.
לסיכום, יש לנו בהצלחת מעבר מודל זיהום זה לפורמט צלחת 96-היטב כי יש צעדי מניפולצית מעטים יחסית, שחזור גבוה, ואת היכולת לייצר כמויות אינסופיות של התחלהחומר, כל גורמי מפתח תאימות תפוקה. Assay זה גם להתאמה בקלות לפורמטים שונים ולקרוא-outs, מה שהופך אותו לנכס יקר לתהליך גילוי תרופות מוקדם חיידק השחפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
