Inandningsenheten som beskrivs häri kan generera, prov för karakterisering, och likformigt avsätta ett läkemedel aerosol i lungorna hos gnagare. Detta möjliggör den prekliniska bestämning av effekten och säkerheten av läkemedelsdoser deponeras i lungorna; nyckeldata som möjliggör klinisk inhalerad drogutveckling.
Obstruktiva andningssjukdomar, såsom astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) för närvarande behandlas av inhalerade antiinflammatoriska och bronkodilaterande läkemedel. Trots att det finns flera behandlingar, är båda sjukdomarna växande folkhälsoproblem. Majoriteten av astmapatienter under god kontroll på aktuella inhalerade behandlingar men ett stort antal patienter med svår astma inte. Astma drabbar uppskattningsvis 300 miljoner människor över hela världen och cirka 20 procent har en svår form av sjukdomen. Till skillnad från astma, det finns få effektiva behandlingar för KOL. Uppskattningsvis 10% av befolkningen har KOL och utvecklingen i dödligheten ökar för KOL och samtidigt minska för andra allvarliga sjukdomar. Även om utvecklings läkemedel för inhalerad leverans är utmanande, möjliggör näsan endast inandning enhet direkt leverans av nya läkemedel till lungan hos gnagare för pre-klinisk effekt och säkerhet / toxikologistudier. Inhalerad läkemedelstillförselhar flera fördelar för respiratoriska sjukdomar, där hög koncentration i lungan förbättrar effektiviteten och minimerar systemiska biverkningar. Inhalationssteroider och luftrörsvidgande dra nytta av dessa fördelar och inandning leverans kan också hålla potential för framtida biologiska terapier. Inandningsenheten som beskrivs häri kan generera, prov för karakterisering, och likformigt avsätta ett läkemedel aerosol i lungorna hos gnagare. Detta möjliggör den prekliniska bestämning av effekten och säkerheten av läkemedelsdoser deponeras i lungorna hos gnagare, nyckeldata som erfordras innan initiering av klinisk utveckling.
Det finns många fördelar med att inhalerad administrering av läkemedel för behandling av luftvägssjukdomar. Inhalerad leverans tillämpar terapeutiskt medel direkt till verkningsstället, lungorna. En hög lokal koncentration av läkemedlet i lungorna erbjuder en betydande fördel som minimerar dos och systemisk exponering, och maximerar effektivitet. Detta är en viktig fördel som kraftigt kan öka det terapeutiska indexet (TI, förhållande mellan dos av läkemedel som orsakar en sidoeffekt över dos av läkemedel som ger efficacy) av ett läkemedel. Inhalerade β 2 adrenergiska agonister, kortikosteroider och anti kolinerga läkemedel har visat sig vara effektiva för att förbättra lungfunktionen hos patienter med astma och KOL, samtidigt minimera de systemiska biverkningar (takykardi, immunsuppression, och förstoppning) observerades när dessa läkemedel tas oralt. Nya läkemedelsklasser (till exempel, PDE4-inhibitorer 1 och BTK inhibitorer 2) har nyligenvisat sig vara effektiv för att förbättra lungfunktionen i modeller men, prekliniska djursjukdomar liknande P2-agonister, kortikosteroider och anti kolinerga läkemedel, lider av systemiska biverkningar som kan minimeras genom inhalerad leverans. På grund av den extra kostnaden för utveckling av inhalerade vs. orala läkemedel, bör en inhalerad formulering endast övervägas för respiratoriska indikationer efter framgångsrik oral / systemisk administrering avslöjar dosbegränsande mekanismbaserade systemisk biverkningar.
Pre-kliniskt, är inhalerade föreningar optimerade för att öka TI, som kräver in vivo effekt och biverknings mätningar. Initialt dessa mätningar kan göras i separata analyser, vanligen en topiskt levererad effekt mätning och en systemiskt levererade bieffekt mätning, men att verkligen jämföra föreningar skall effekt och biverkningar mätas i samma djur efter inhalerade administrering. Detta kräver studier att AC dos / responshieve tillräckligt förening som administreras till lungorna för att inducera en mätbar bieffekt. Det enda sättet för närvarande att likformigt fördela stora doser av läkemedlet in i lungorna av multipla små djur samtidigt är nose-only inhalation 3, 4, 5. Styrkor och svagheter hos olika inandning exponeringstekniker har nyligen samman 6, 7, 8. Specialutrustning och en stor mängd av testförening (gramkvantiteter) krävs för näsa-bara inhalerad läkemedelstillförsel, men proof-of-concept studier kan vara möjligt med andra medel.
När mängden läkemedel är begränsad (mg kvantiteter), direkta administreringsmetoder är ett alternativ men lider alla av icke-homogen avsättning, med mer läkemedel koncentrerad längs de centrala luftvägarna och mindre väl representerade i parenkymal / alveoläraområdena 3, 4, 5. Den effektiva dosen som levereras genom direkt instillation är alltid högre och kan aldrig direkt jämföras med inhalerade doser 4. Direktinstillation metoder inklusive intranasal 9, intratrakeal vätska 10, 11 och sprayinstillation 12, eller torrpulver insufflation 13, kan 14 användas som ett screeningsverktyg för att bestämma den ungefärliga dosintervallet för senare näsa-bara inhalationsstudier, eller för att bestämma ranking av effektivitet / toxicitet för en serie av strukturellt liknande läkemedel 15. På grund av att den centrala luftvägsavsättningsmönstret, kan direkta administreringsmetoder vara mer användbart för att bestämma effekterna av föreningar som verkar på de centrala luftvägarna (bronkodilatorer eller mastcellhämmare) än in den perifera lungan (antiinflammatoriska medel).
Till skillnad från människor, som kan andas in en betydande dos av koncentrerad aerosol från en inhalator i en enda djupt andetag, kontinuerlig generering av en respirabel (0,5-5 | im aerodynamisk massmediandiameter, MMAD) aerosol, i upp till en timme, krävs för att deponera en verksam läkemedelsdos i en spontanandning gnagare lungor i en näsa-bara inhalationssystem 16. Aerosolgeneratorer (jet nebulisatorn eller Wright damm foder 17) som kontinuerligt kan producera den erforderliga aerosolen partikelstorleken och koncentrationen för näsa-bara inhalationsstudier är inte särskilt effektiva på att generera hög kvalitet (respirabla) aerosoler. De läkemedelsmatningshastigheterna till dessa aerosolgeneratorer för potent (IC 50 pM till nM i funktionella cell baserade analyser) föreningar är vanligen i en till 10 mg / min intervall och vanligen mindre än 1% av det läkemedlet aerosol gör det till andningszonen av djuren(Figur 1). Många av partiklarna som genereras är för stora (> 5 pm) för att komma in i lungorna och avlägsnas genom en aerosol klassificerare (en pre-separator eller cyklon med ett 5 | im snitt punkt) för att undvika en stor dos av läkemedel i näsan. Tillsats till ineffektiviteten hos näsa-bara inandningssystem är den lilla partikelstorleksområde (0,5 till 5 pm MMAD) för inandningsbara partiklar. Många av aerosolpartiklarna mindre än 0,5 ^ m utandas (som cigarettrök) och inte deponeras i lungorna 18. Även många av de "större" aerosolpartiklar (~ 5 | im) insättning i näsan absorberas eller transporteras av mukociliär clearance mot baksidan av halsen där de sväljs in i magen 19. Vid användning av näsa-bara inhalering är dosen deponeras i näsan alltid större än den avsätts i lungorna dos och den nasala dos kan bidra till systemisk exponering och biverkningar 20. Naturligt, inhaleras drug doser är små (i mikrogram-området) minimera eventuella systemisk biverkan potential av läkemedel som absorberas av den nasala, lunga, eller gastrointestinala vävnader. Även när partikelstorleken av aerosolen levereras till djuren är i det inandningsbara intervallet, ett genomsnitt av endast 4% av de aerosolpartiklar som gör det till andningszonen hos djur deposition i lungorna. Effektivare aerosolgeneratorer är tillgängliga, men den jetnebulisatorn och Wright damm foder är oöverträffade för deras förmåga att producera kontinuerliga aerosoler från olika formuleringar flytande och torra pulver, respektive.
Inandningsbar aerosol från föravskiljaren passerar in i näsan-bara exponering inandning enhet 21 som är baserad på en flödes förbi nosen designen 22. Inandnings enhet har 3 nivåer (endast två nivåer visas i figur 1) och varje grupp innehåller 10 exponerings portar för djur och aerosol provtagning. Portarna är placerade perifert runt central aerosol plenumet. Medvetna möss placeras i glashållande hållarna (6 inches lång och 1,2 tum i diameter) och andas innehållet i inandningsenheten aerosol. Mössen är inte acklimatiserad till fasthållningsanordningar 23. Tidigare erfarenheter har visat att möss tolererar fasthållningsröret av mindre än en timme varaktighet på liknande sätt, med eller utan anpassning 2.
Inandning Enheten är utformad för att leverera läkemedels aerosoler direkt till lungorna hos djuren samtidigt som man undviker exponering för operatörerna. Styrkan / toxiciteten av dessa läkemedel är vanligtvis okända och flera ingenjörssäkerhetskontrollerna används för att undvika exponering för operatörerna. Operatörerna måste alltid bära personlig skyddsutrustning (handskar, laboratorierock, respiratorer och skyddsglasögon). Den yttre plenumkammaren av inandnings enheten är under negativt tryck vid alla tidpunkter under drift, vilket möjliggör en säker borttagning av enstaka eller grupper av djur withoUT avstängning aerosolgeneratorn. Inandningsenheten är även innesluten i en sekundär inneslutning som hålles vid ett negativt tryck genom en avgasport i taket för att förhindra varje läckage av aerosol in i rummet i händelse av fel. All utströmmande luft från inandningssystemet filtreras av ett HEPA-filter före utsläpp i miljön. Näsan-bara exponeringssystemet som används i detta manuskript köptes från en enda leverantör (se kompletterande tabell of Materials).
En näsa-bara inhalation systemet och dess drift för att leverera farmaceutiska aerosoler till lungorna hos gnagare har beskrivits. Hålla fast djur i näsa-bara innehavare är en vanligt använd metod för att exponera djuren för luftburet material. Ett experiment utfördes som visar det antikolinergiska bronkdilaterare ipratropiumbromid 34 kan potent omvänd metakolin-inducerad bronkokonstriktion vid leverans genom näsan-endast inandning till möss med ett ED 50 av 0,1 pg / kg deponerade dosen. En ökning som är större än 10-faldigt i effektiv dos av ipratropium krävdes för bronkodilatation efter intratrakeal leverans (ED 50 intratrakeal = 1,3 | ig / kg, data visas ej) leverans. Detta beror på att den icke-homogena depositionsmönstret av läkemedel i lungorna som produceras av intratrakeal dosering 3, 5, 10. 10-faldigt och större effektiv dosskillnader mellan inhalerade och intratrakeala doseringstekniker för andra läkemedel har tidigare observerats av andra 4.
Den icke-homogena depositionsmönstret av läkemedel i lungorna som produceras av intratrakeal dosering saktar också läkemedelsabsorption genom lungan 35, minskar den hastighet med vilken läkemedlet kommer in i systemcirkulationen och minskar chanserna att se systemiska biverkningar. Därför, för att optimera säkerhets- / effekt (terapeutiskt index) 36 av nya inhalerade läkemedel, bör näsa-bara inhalation leverans användas. Intratrakeal avsättning kommer att ge en felaktig uppskattning av TI genom att generera felaktigt höga effektiva doser i lungan och låga doser till den systemiska cirkulationen.
Som nya läkemedel som levereras av den inhalerade vägen utvecklas är det viktigt att på lämpligt sätt översätta effektiva läkemedelsdosen från prekliniska effektstudier för att förutsäga en efficacious dosen till människa för kliniska prövningar. Den ökända död Tusko elefanten 37 vanligen citeras i litteraturen för att påminna oss att använda allometriska skalning för att förutsäga mellan arter läkemedelsdoser och att mellan arter läkemedelsdoser bör inte linjärt extrapoleras på basis av en enkel jämförelse av kroppsmassor. Är det vanligt att använda en allometriska arbetssätt med allometriska exponent b från 0,67 för att förutsäga humana läkemedelsdoser från preklinisk effektivitetsstudier 38. Med hjälp av musen inhalerad ED 90 av 0,9 | ig / kg för ipratropium, en allometriska exponent av 0,67, en mus kroppsmassa av 0,03 kg, och en human kroppsmassa på 60 kg; en uppskattad human ED 90 av 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60 ) (1-0.67) = 0,07) kan beräknas som den förutsagda humana deponerade dosen från våra musdata. Detta förutsagda värde är jämförbart med det faktiska humana efficacious deponerad dos av 0,26 | j, g / kg, vilket kan beräknas ur den levererade göraSO om 40 | j, g 39 dividerat med den mänskliga kroppsmassa på 60 kg multiplicerat med en human oral inhalation pulmonell deponering fraktion 16 av 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). En uppskattning av den effektiva humana inhalerad deponerade dosen bidrar också till att planera de levererade doserna som användes vid inandnings toxikologiska studier som krävs för kliniska prövningar 40.
Den specialutrustning och stor mängd av testförening (gramkvantiteter) som krävs för näsa-bara inhaleras läkemedelstillförsel kan vara betydande begränsningar vid utvecklingen näsan-bara inhalationsteknik. En kalibreringskörning utan djur som finns är nödvändigt om en specifik dos krävs för en (vanligtvis toxikologi och inte en effektivitet dos / respons) studie, och denna kalibreringskörning kommer att kräva mer läkemedel för att vara tillgängliga. Denna kalibreringskörning är nödvändig eftersom de fysikokemiska egenskaperna av varje läkemedel / formulering kan variera tillräckligt för att kraftigt påverka den avsatta dosenav läkemedel i lungorna. Optimering av luft- och läkemedelsmatningshastigheterna till aerosolgeneratorn under kalibreringskörning krävs för att uppnå en aerosol partikelstorlek och koncentration för den specifika dos som erfordras. Medan aerosolgeneratorn luft och läkemedelsmatningshastigheter som föreslås i metoderna är en rimlig utgångspunkt, det finns potential att en icke-respirabel (partikelstorlek> 5 mm) aerosol för en specifik läkemedelsformulering kommer att genereras. I prekliniska stadiet, finns det ofta inte tillräckligt läkemedel tillgängliga för att göra en kalibreringsdrivet och det är omöjligt att veta på förhand vilka doser (om någon) får in i lungorna. Också är statisk elektricitet produceras under aerosolproduktion processen och kan påverka tiden som krävs för aerosolen koncentrationen till jämvikt. Det är viktigt att korrekt jorda utrustning för att minimera statisk laddning. Ett annat alternativ för att minimera statisk elektricitet är att tillsätta fuktighet till den luft som tillinandningsenheten, för att öka ledningsförmågan ochavleda elektrostatiska laddningar på partiklarna 25. Befuktning av luft som tillförs aerosolgeneratorn krävs inte för djur komfort under korta (<1 h) doseringssessioner men bör övervägas om längre doseringstider används.
Läkemedel kan levereras till lungorna hos djur genom passiv näsa-bara inhalation eller direkta intratrakeala administreringsmetoder som kringgår nasofaryngeal avsättning. Nose-only inhalation leverans är vanligen används inom området för inandning toxikologi 41 men är sparsamt används tidigt i läkemedelsutvecklingsprocessen. En tvärvetenskaplig forskargrupp behövs för att genomföra näsa endast inhalationsstudier på grund av: behovet av stora mängder läkemedel, specialkunskaper som krävs för att formulera, skapa och karakterisera aerosoler; använda avancerade utrustning, och mäta läkemedlets effektivitet i djurmodeller av luftvägssjukdom. Leverans tekniker som beskrivs häri används för att utveckla small molekyl inhalerade läkemedel men i framtiden kan tillämpas för att utveckla inhalerade bioläkemedel 42, 43. Förhoppningsvis de förfaranden och tips dokumenteras i detta manuskript kommer att underlätta nya prekliniska läkemedelsforskning och toxikologiska forskare att förvärva de kunskaper som krävs för att leverera läkemedel till gnagare genom aerosol inhalation.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner: Dr Thomas Budiman på TSE Systems GmbH för sin tekniska expertis och utrustning anpassning. John Fry (Battelle Inc.) och Dr Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) för deras hjälp diskussioner. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller och Sean Davis (Amgen) för att få hjälp med experimenten.
Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |